Name: Protocollo di preparazione e trasferimento dei campioni per cristallografia a lunghezza donda lunga sotto vuoto su Beamline I23 presso Diamond Light Source (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Impara il protocollo di preparazione e trasferimento criogenico di cristalli macromolecolari per cristallografia a lunghezza d'onda lunga in vuoto. Questo metodo consente il fasing sperimentale e l'identificazione di elementi leggeri biologicamente rilevanti.

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Vorremmo ringraziare Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha e Kevin Wilkinson per il loro supporto nello sviluppo del Cryogenic Sample Transfer System (CTS). Questo lavoro è stato finanziato da iNEXT-Discovery (Grant 871037) finanziato dal programma Horizon 2020 della Commissione Europea.

1. Raccolta dei cristalli
NOTA: Utilizzare dispositivi di protezione individuale appropriati: occhiali e guanti, ove possibile.
<ol><li>Dopo che gli SH arrivano al laboratorio dell'utente in combipucks (Figura 3C), separare il coperchio dalla base del combipuck in modo che gli SHs rimangano attaccati alla base e le fiale siano trattenute nel coperchio.</li>
	<li>Immergere il coperchio con flaconcini in azoto liquido. Collegare un adattatore SH + (Figura 3B, a destra) a una bacchetta magnetica e raccogliere i cristalli come al solito.</li>
	<li>Raffreddare ogni campione direttamente nel pettine, prendendo nota della posizione del campione. Per chiudere il disco, utilizzare una bacchetta per fissare la base al coperchio.</li>
	<li>Trasferire il pettine dall'azoto liquido al caricatore secco o allo stoccaggio di azoto liquido dewar. Spedisci il mittente a secco a Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).</li>
</ol>2. Trasferimento del campione nel vuoto
<ol><li>Caricamento di SH da combipuck al blocco di trasferimento<ol>
<li>Posizionare la base del disco di blocco (Figura 3H) già popolata con blocchi di trasferimento vuoti (Figura 3D) sulla sua base di supporto all'interno dell'azoto liquido in un contenitore di schiuma (Figura 3J-b). NOTA: l'orientamento dei blocchi di trasferimento è importante per l'accuratezza del trasferimento del campione all'interno del recipiente del vuoto. Pertanto, i blocchi devono essere posizionati sulla base del disco del blocco assicurandosi che il perno contrassegnato con una freccia nella Figura 3D si trovi a sinistra del blocco.</li>
		<li>Posizionare il disco del flaconcino nel contenitore di schiuma riempito con azoto liquido, assicurandosi che la base del disco sia fissata al supporto magnetico all'interno del contenitore di schiuma (Figura 3J-a).</li>
		<li>Pre-raffreddare tutti gli strumenti necessari in azoto liquido. Utilizzare lo strumento separatore a disco mostrato nella Figura 3G sull'impostazione alta H per separare il coperchio dalla base, in modo che la base rimanga attaccata al supporto magnetico e gli SHs siano esposti all'interno dell'azoto liquido.</li>
		<li>Per rimuovere ogni SH dal suo adattatore, utilizzare la bacchetta del separatore (Figura 3F) per prelevare l'SH dalla base del pettine e posizionarlo nella posizione appropriata del blocco di trasferimento nella posizione orizzontale del carosello nella Figura 3J-b.<ol>
<li>Posizionare la bacchetta del separatore sull'adattatore SH + il più in basso possibile, assicurandosi che la bacchetta sia verticale, per evitare di toccare il campione.</li>
			<li>Spostare la piccola leva sulla bacchetta del separatore verso il basso con il pollice fino a quando non scatta, per fissare l'SH all'interno e tirare l'SH dall'adattatore.</li>
			<li>Abbassare il separatore sulla posizione del blocco desiderata, assicurandosi che uno dei tre rebbi si adatti all'interno del foro centrale del blocco.</li>
			<li>Rilasciare l'SH spostando nuovamente la leva verso l'alto. Ripetere questi passaggi per ogni SH.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per caricare i campioni nel blocco di esempio successivo, utilizzare lo strumento chiave carosello (Figura 3E) per ruotare un blocco vuoto in posizione orizzontale.</li>
		<li>Collegare lo strumento separatore di puck mostrato nella Figura 3G utilizzando l'impostazione bassa L al coperchio del puck di blocco avvitando in senso orario.</li>
		<li>Una volta trasferiti tutti gli SH, per chiudere il disco di blocco, posizionare il coperchio in azoto liquido e attendere che la temperatura si equilibri, quindi montare il coperchio sulla base come nella Figura 3I. Con lo strumento separatore collegato, sollevare delicatamente per rilasciare dalla giostra.</li>
		<li>In questa fase, il disco di blocco può essere trasferito al CTS (Figura 4B) o a un dewar di stoccaggio di azoto liquido.</li>
	</ol></li>
	<li>Caricamento dei blocchi di trasferimento nel recipiente del vuoto<ol><li>Assicurarsi che la navetta sia fissata saldamente alla stazione. Aprire le valvole azoto gas e aria e assicurarsi che i gas scorrano. Accendere il CTS.</li>
		<li>Se sul display non sono presenti messaggi di avviso, procedere con il raffreddamento sia del bagno che della navetta con azoto liquido. Posizionare l'imbuto fornito nella porta di riempimento sulla navetta e versare lentamente azoto liquido nell'imbuto mentre si monitora il livello sullo schermo. Fermati quando l'indicatore passa dal rosso al blu. NOTA: la navetta è pronta all'uso quando la temperatura del sedile freddo visualizzata sul touchscreen è inferiore a 100 K. Il bagno sample Station può essere riempito simultaneamente utilizzando l'imbuto corretto al livello indicato sulla parete del bagno o al 100% sul display del livello di azoto liquido. I livelli di azoto liquido e i sensori di temperatura devono essere monitorati costantemente durante il funzionamento; saranno necessarie diverse ricariche.</li>
		<li>Una volta che la temperatura del sedile freddo dello shuttle è inferiore a 100 K e i livelli di azoto liquido sulla navetta e sul bagno si stabilizzano, trasferire un disco di blocco dall'azoto liquido al bagno CTS utilizzando lo strumento separatore di puck collegato. Rimuovere il coperchio del disco di blocco e chiudere il coperchio del bagno CTS.</li>
		<li>Per introdurre un blocco nella navetta, aprire la valvola CTS, se non già aperta, premendo il pulsante Apri valvola shuttle sul display. Sblocca la maniglia della navetta ruotando di 90° in senso orario e avanzala verso il bagno in modo che la traccia guidata sulla maniglia imponga il corretto percorso di viaggio verso il bagno. Una volta che il coperchio del blocco è visibile all'interno del bagno, lasciare raffreddare il coperchio. Dopo che il gorgogliamento di azoto liquido attorno al coperchio si è fermato, avanzare verso il blocco di trasferimento.</li>
		<li>Per bloccare il blocco di trasferimento sulla navetta, ruotare la maniglia di 180° in senso orario.</li>
		<li>Ritrarre la maniglia nella posizione posteriore originale, quindi "Bloccarla" in posizione ruotando di 90° in senso antiorario.</li>
		<li>Premere Chiudi valvola shuttle e pompa sullo schermo del display per avviare l'evacuazione della navetta.</li>
		<li>Una volta visualizzato sul touchscreen il messaggio Shuttle pronto a staccarsi , premere la leva sotto la navetta e sollevarla con attenzione utilizzando la maniglia in alto.</li>
		<li>Portare la navetta all'airlock sulla stazione terminale del vuoto in posizione verticale.</li>
		<li>Collegare la navetta all'airlock sulla stazione terminale del vuoto. NOTA: una volta fissato saldamente, il touchscreen sulla stazione finale confermerà lo stato della navetta e dell'interblocco.</li>
		<li>Selezionare una posizione di blocco vuoto all'interno della nave premendo il pulsante corrispondente sul touchscreen e spostando l'hotel campione nella posizione di caricamento corretta.</li>
		<li>Una volta che l'hotel campione è in posizione, il pulsante Apri diventerà attivo. Premere questo pulsante per avviare la sequenza di interblocco del vuoto. NOTA: la pompa si avvierà e l'avanzamento verrà visualizzato sul monitor. Il completamento potrebbe richiedere fino a due minuti.</li>
		<li>Al termine della sequenza, lo stato cambierà in Airlock aperto, trasferimento in corso. Ruotare la maniglia di 90° in senso orario per sbloccare l'asta e spingere delicatamente l'asta nella nave in modo che la traccia guidata imponga nuovamente il percorso corretto di viaggio verso la posizione dell'hotel campione. Utilizzando il feed video visualizzato sullo schermo come guida, inserire lentamente il blocco nell'hotel, assicurandosi che la spia di posizione del blocco sul display touch sia attivata. Una volta attivato, ruotare l'impugnatura di 180° in senso antiorario per rilasciare il blocco e tirare fuori l'asta dal recipiente. Una volta completamente retratto, ruotare l'impugnatura di 90° in senso antiorario per bloccare l'asta.</li>
		<li>Una volta bloccata l'asta, il pulsante Chiudi diventerà attivo. Premere questa opzione per chiudere la valvola del vuoto della stazione finale e sfiatare lo spazio tra la navetta e il recipiente alla pressione atmosferica, in attesa fino a 20 s per il completamento.</li>
		<li>Attendere che il display mostri lo stato ok per rimuovere shuttle una volta completata la sequenza. A questo punto, rimuovere la navetta e tornare al CTS per ripetere il processo per il blocco successivo.</li>
		<li>Per preparare il blocco successivo per il trasferimento, ruotare il disco di blocco all'interno del bagno. Spingere la chiave di rotazione incorporata sulla parte superiore del coperchio acrilico verso il basso nella serratura al centro del disco del blocco. Tenendolo premuto, ruotare la chiave per posizionare il blocco desiderato nella posizione di prelievo.</li>
		<li>Una volta trasferiti tutti i blocchi, assicurarsi che la valvola shuttle sia aperta mentre è montata sul CTS. Premere il pulsante di cottura sul touchscreen e selezionare sia il bagno che la navetta, quindi premere bake. NOTA: Questo riscalda sia la navetta che il bagno per far bollire l'azoto liquido e successivamente evaporare qualsiasi accumulo di ghiaccio / condensa prima dell'uso successivo. Una volta che la cottura è iniziata, il gas e l'aria possono essere spenti.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

L'attuale protocollo è stato sviluppato per soddisfare i requisiti di preparazione del campione per gli esperimenti MX a lunghezza d'onda lunga nel vuoto sulla beamline I23. È stato in uso sulla beamline nell'ultimo anno e ha contribuito al completamento con successo di più progetti. Come indicato dai risultati qui presentati, il protocollo consente un trasferimento sicuro e affidabile dei campioni alla stazione terminale del vuoto preservandone la qualità di diffrazione. È un aspetto importante per il funzionamento della beamline e sarà accompagnato da una formazione di persona degli utenti da parte del personale della beamline. Alcuni dei passaggi meritano di essere evidenziati come critici per il completamento efficace e sicuro della procedura: il trasferimento di campioni da basi di pettine a blocchi di campioni richiede accuratezza e attenzione per evitare di danneggiare i campioni (vedi passaggio 2.1.4); il monitoraggio del livello di azoto liquido in tutte le fasi è importante per evitare che i campioni siano esposti all'aria o siano a stretto contatto con parti non adeguatamente raffreddate (2.1.3 e 2.2.2); attendere che la sequenza di chiusura (2.2.14) sia completamente terminata, prima di rimuovere la navetta dalla stazione finale (2.2.15), per evitare il degrado del vuoto della stazione finale.
La concezione del protocollo è stata avviata insieme a uno sforzo ingegneristico volto a sviluppare apparecchiature appositamente costruite per il trasferimento di cristalli proteici nell'ambiente del vuoto. I prodotti finali di questo progetto sono stati il CTS e gli strumenti di gestione dei campioni associati sopra descritti. Il CTS è un miglioramento significativo rispetto al suo predecessore, il Leica EM VCT10014, e rimuove molteplici limitazioni, come la mancanza di schermatura del campione e l'ambiente di vuoto durante il trasferimento, l'accumulo di ghiaccio all'interno del bagno di azoto liquido e l'assenza di un'interfaccia utente intuitiva e di funzioni di sicurezza. Ulteriori caratteristiche del CTS che migliorano l'esperienza dell'utente sono il monitoraggio della temperatura e del livello di azoto liquido all'interno della navetta e della stazione di campionamento, un bagno di maggiore capacità che ospita quattro blocchi contemporaneamente, anziché uno, e un meccanismo autoguidato per il funzionamento dello shuttle. Il CTS è completamente integrato nel sistema di controllo della beamline con un'interfaccia touchscreen intuitiva e una maggiore sicurezza meccanica e del vuoto quando si interfaccia con la stazione finale.
Beamline I23 è il primo strumento di sincrotrone MX a lunghezza d'onda lunga del suo genere e, come tale, l'introduzione di cristalli proteici in un ambiente ad alto vuoto e la loro conservazione a temperature criogeniche, ha richiesto sforzi considerevoli. I miglioramenti agli strumenti e al protocollo di preparazione dei campioni, nonché gli sforzi per semplificare i processi, sono in corso. Come parte del supporto utente, il personale beamline è sempre disponibile per assistere con la risoluzione dei problemi. Un esempio di uno di questi scenari potrebbero essere i problemi che compromettono l'integrità del sistema di vuoto, portando a difficoltà nel collegare o rimuovere la navetta da / per il CTS o l'airlock della stazione terminale. Diversi livelli di test vengono eseguiti su base settimanale e giornaliera e la formazione degli utenti coprirà ulteriori controlli per evitare potenziali guasti, come l'ispezione visiva degli O ring sulle interfacce a cui si collega la navetta. Mentre l'ambiente del vuoto apre l'opportunità di eseguire esperimenti di diffrazione in un intervallo di lunghezze d'onda non accessibile ad altre linee di fascio, la fase di trasferimento aggiuntiva riduce la produttività complessiva del campione.
Il trasferimento manuale con solo quattro campioni per blocco di trasferimento e fino a cinque blocchi all'interno del recipiente a vuoto limita la capacità totale a 20 campioni. Quindi, per i progetti con una grande variabilità da campione a campione, i campioni dovrebbero essere pre-selezionati presso le linee di fascio Diamond ad alta produttività, e quindi solo i campioni più promettenti dovrebbero essere trasferiti per il successivo esperimento ottimizzato a lunga lunghezza d'onda. Mentre i portacampioni e i blocchi di trasferimento sono invariati rispetto alla loro introduzione iniziale di alcuni anni fa, gli strumenti di gestione presentati qui sono tutti nuovi sviluppi. I portacampioni dedicati I23 sono immutabili grazie al loro ruolo nel concetto di raffreddamento per la beamline. Pertanto, la progettazione degli strumenti di gestione dei campioni mirava a creare un collegamento tra questo nuovo tipo di supporto e gli strumenti standard disponibili in commercio che la comunità di utenti MX aveva adottato per lungo tempo, come i pettini, le bacchette per la raccolta dei cristalli e il sistema di trasporto dello spedizioniere secco. Il loro design ha comportato una consultazione significativa con la comunità degli utenti e ha richiesto diverse iterazioni per essere completate. L'attrezzatura, gli strumenti e il protocollo qui presentati rappresentano un sistema semplice e robusto per il trasferimento di campioni utente per esperimenti presso la beamline I23 presso Diamond Light Source. Questo strumento per la cristallografia macromolecolare a lunghezza d'onda lunga nel vuoto apre nuove opportunità per la biologia strutturale.

La diffrazione a raggi X a lunga lunghezza d'onda viene utilizzata per sfruttare le proprietà di diffusione anomala di specifici atomi di luce presenti nativamente nelle macromolecole. Questo aiuta a risolvere il problema della fase cristallografica e a confermare in modo inequivocabile l'identità e la posizione di tali elementi all'interno delle macromolecole. Mentre nei primi giorni della cristallografia macromolecolare, le strutture de novo sono state risolte mediante sostituzione isomorfa multipla1, con l'avvento di linee di fascio di raggi X sintonizzabili ai sincrotroni, la fasatura sperimentale basata su tecniche di diffrazione anomala multi-lunghezza d'onda e singola lunghezza d'onda (SAD) sono diventati i metodi dominanti2 . Entrambi i metodi si sono storicamente basati sul segnale isomorfo o anomalo dei metalli pesanti, che devono essere introdotti artificialmente nei cristalli mediante co-cristallizzazione o immersione dei cristalli3. L'approccio per tentativi ed errori e l'esito imprevedibile possono rendere questi esperimenti frustranti e dispendiosi in termini di tempo. L'incorporazione della seleno-metionina durante l'espressione proteica4 è un modo molto elegante per superare queste limitazioni e sfruttare la diffrazione anomala a lunghezze d'onda corte, sebbene possa essere molto impegnativa nei sistemi di espressione proteica eucariotica.
MX a lunghezza d'onda lunga è estremamente interessante per la determinazione della struttura da esperimenti SAD nativi5,6 a causa della comodità di utilizzare cristalli direttamente da uno studio di cristallizzazione di successo senza ulteriori trattamenti. Inoltre, l'accesso ai bordi di assorbimento di elementi di elevata importanza biologica, come calcio, potassio, cloro, zolfo e fosforo, apre l'opportunità di identificare direttamente le posizioni di questi elementi nelle macromolecole7,8,9,10. A media e bassa risoluzione, l'assegnazione degli elementi in base alla densità elettronica 2Fo-Fc e all'ambiente chimico può essere difficile, in particolare per elementi con un numero simile di elettroni o ioni debolmente legati con occupazioni parziali. Queste ambiguità possono essere risolte raccogliendo dati sotto e sopra il bordo di assorbimento dell'elemento di interesse e l'interpretazione della risultante differenza anomala modellata sulle mappe di Fourier11,12. Localizzare le posizioni degli atomi di zolfo in queste mappe può anche aiutare la costruzione di modelli in mappe di densità elettronica a bassa risoluzione13. I bordi di assorbimento di questi elementi leggeri sono osservati a lunghezze d'onda comprese tra λ = 3 e 6 Å (vedi Figura 1, in alto). Questa gamma di lunghezze d'onda è stata ben oltre le capacità di qualsiasi beamline MX di sincrotrone e un funzionamento efficiente in questo intervallo richiede il superamento di diverse sfide tecniche, come descritto di seguito.
Beamline I23 a Diamond Light Source, Regno Unito, è uno strumento unico, specificamente progettato per facilitare esperimenti MX a lunga lunghezza d'onda, sintonizzabile in un intervallo di lunghezze d'onda compreso tra λ = 1,13 e 5,9 Å (intervallo di energia tra E = 2,1 e 11 keV). Operando in un ambiente ad alto vuoto14, l'assorbimento d'aria e la dispersione vengono eliminati, migliorando di conseguenza l'efficienza degli esperimenti di diffrazione e il rapporto segnale-rumore. Una grande stazione terminale per vuoto racchiude tutti i componenti dell'ambiente campione, tra cui il rilevatore semicilindrico Pilatus 12M, un goniometro multiasse, i sistemi di visualizzazione e collimazione in linea, nonché le apparecchiature su misura per il trasferimento e lo stoccaggio dei campioni (Figura 2). Ogni apparecchiatura è stata ottimizzata per garantire che possano essere raccolti i dati di lunghezza d'onda lunga della migliore qualità. Il rivelatore curvo Pilatus 12M può raccogliere angoli di diffrazione di 2θ = ±100°, ottenendo dati di diffrazione sufficientemente ad alta risoluzione anche alle lunghezze d'onda più lunghe (Figura 1, in basso). I 120 moduli rivelatori sono stati specificamente selezionati per la compatibilità a basso consumo energetico e sono state fornite calibrazioni per un'ulteriore modalità di guadagno ultra-alto.
La soglia del rivelatore più bassa possibile è di 1,8 keV, portando a maggiori effetti angolari e di bordo per energie inferiori a 3,6 keV e si può osservare una qualità dei dati compromessa alle lunghezze d'onda più lunghe, in particolare per i cristalli a bassa mosaicità. Questo effetto in combinazione con la diminuzione dell'efficienza quantistica del rivelatore15 deve essere preso in considerazione quando si pianifica un esperimento. Il goniometro multiasse consente il riorientamento dei cristalli per consentire strategie di raccolta dati che massimizzano la qualità e la forza del segnale anomalo, nonché la completezza dei dati anomali raccolti. L'assorbimento del campione è un fattore limitante per gli esperimenti, in particolare alle lunghezze d'onda più lunghe. Le correzioni di assorbimento, implementate nei pacchetti software di elaborazione MX comunemente usati16,17, funzionano bene a lunghezze d'onda intorno a 3 Å. Lunghezze d'onda più lunghe richiederanno correzioni analitiche di assorbimento basate su ricostruzioni tomografiche18 o ablazione laser per rimuovere materiale non diffrattante e tagliare i cristalli in forme ben definite19. Quest'ultimo aiuterà anche a ridurre le dimensioni dei cristalli più grandi poiché gli esperimenti di diffrazione a raggi X a lunghezze d'onda più lunghe sono più efficienti per i cristalli più piccoli14. La sfida di mantenere i campioni a temperature criogeniche durante la raccolta dei dati viene affrontata dal raffreddamento conduttivo, poiché l'utilizzo di dispositivi a flusso di gas freddo a flusso aperto non è compatibile con un ambiente sottovuoto. Quindi, i materiali termicamente conduttivi, come il rame, sono necessari per collegare il campione a un criorefrigeratore a tubo a impulsi. I perni standard SPINE in acciaio inossidabile utilizzati in MX, così come qualsiasi altro supporto per campioni disponibile in commercio, non sono adatti per MX a lunghezza d'onda lunga nel vuoto a causa della loro scarsa conduttività termica.
I portacampioni (SHs) per MX sotto vuoto devono essere una parte essenziale della via termica di rimozione del calore (Figura 3A). In quanto tali, sono costituiti da un corpo e un perno in rame termicamente conduttivi e includono due caratteristiche importanti: una solida base magnetica per garantire un adeguato collegamento termico alla testa del goniometro freddo e un supporto per campioni, realizzato in poliimmide, per ridurre al minimo l'assorbimento e la dispersione dei raggi X20. Sono stati compiuti sforzi per garantire che l'esperienza utente di raccolta dei cristalli e raffreddamento flash sia quasi identica a quella associata alle pratiche MX standard. Poiché gli SH I23 dedicati non sono direttamente compatibili con altre linee di fascio di sincrotrone, viene utilizzato un adattatore in acciaio inossidabile per la compatibilità con le bacchette magnetiche per la raccolta dei cristalli e le interfacce goniometriche esistenti su altre linee di fascio MX (Figura 3B). L'adattatore è importante anche per l'utilizzo delle strutture di automazione su altre beamline Diamond MX, che si basano su teste di pinza robot di tipo ALS21 e layout di base in stile unipuck22, se la variazione del campione richiede un rapido pre-screening per la selezione dei migliori cristalli diffrattanti. Il protocollo di preparazione e caricamento del campione può essere suddiviso in due fasi:
Fase 1: Raccolta dei cristalli e congelamento flash eseguita dagli utenti nei propri laboratori
Dopo la valutazione dell'idoneità del progetto per la raccolta dei dati I23, i portacampioni con anelli corrispondenti alle dimensioni dei cristalli (pre-assemblati con adattatori) vengono inviati ai laboratori degli utenti per la raccolta dei cristalli. Per evitare danni, gli SH e gli adattatori non devono essere separati e devono essere utilizzati come un'unica unità allo scopo di pescare cristalli con anelli di dimensioni appropriate utilizzando bacchette magnetiche standard per la raccolta dei cristalli. Come è comune in MX, questa attività viene eseguita manualmente al microscopio e i cristalli vengono immediatamente raffreddati al flash in un dewar di schiuma con azoto liquido23. A causa di una mancata corrispondenza delle forze magnetiche, gli SH non sono attualmente compatibili con gli unipucks. Lo stoccaggio e la spedizione sono realizzati utilizzando pettine (vedi tabella dei materiali), che sono disponibili per gli utenti su richiesta, insieme agli inserti di spedizione a secco compatibili (Figura 3C). Questi puck condividono la stessa piastra di base con gli unipucks ampiamente utilizzati e consentono un rapido pre-screening dei campioni su altre beamline Diamond MX. Il prestito di questa apparecchiatura agli utenti è attualmente la soluzione migliore, fino a quando i possessori di campioni su misura non saranno disponibili in commercio. Il trasporto alla beamline richiede gli spedizionieri a secco standard utilizzati nella comunità MX.
Fase 2: Trasferimento di campioni criorefrizionati nella stazione terminale del vuoto
Una volta che i campioni arrivano sulla beamline, vengono preparati per il trasferimento nella stazione terminale del vuoto. Ciò comporta la rimozione di SHs dai pettinati e la separazione dagli adattatori. L'introduzione di campioni biologici nel vuoto viene eseguita abitualmente nel campo della microscopia crioelettronica. Alcuni dei concetti consolidati sono stati adattati per il trasferimento del campione I23. In breve, gli SH vengono trasferiti sotto azoto liquido su blocchi di trasferimento (Figura 3D). Questi blocchi hanno un'eccellente conduttività termica e una massa termica significativa, impedendo ai cristalli di raggiungere la temperatura di transizione vetrosa quando sono sotto vuoto. Fino a quattro blocchi, con una capacità di quattro campioni ciascuno, vengono caricati sotto azoto liquido in un disco di blocco (Figura 3H), che viene utilizzato sia per il trasferimento di campioni al sistema di trasferimento criogenico (CTS) o per lo stoccaggio in azoto liquido dewars tra gli esperimenti.
Il sistema di trasferimento criogenico sviluppato presso Diamond Light Source comprende due sottoinsiemi, la stazione campione e lo shuttle (Figura 4A). La Sample Station è costituita da un bagno di azoto liquido per la conservazione temporanea di cristalli proteici e ha caratteristiche specifiche per garantire la sicurezza e consentire un'esperienza user-friendly (Figura 5). Il CTS è controllato da un controller logico programmabile tramite un'interfaccia touchscreen intuitiva. La stazione di campionamento ha diodi emettitori di luce integrati per una migliore visualizzazione e una serie di riscaldatori controllati in circuito chiuso per automatizzare l'essiccazione del bagno di azoto liquido una volta che i campioni sono stati trasferiti. Ha anche una varietà di sensori per garantire la sicurezza e il funzionamento efficiente del sistema. La sample station dispone di hardware su misura per fornire un'interfaccia elettrica affidabile per interagire con la navetta per le operazioni, come il pompaggio fino al vuoto grezzo per il trasferimento del campione, nonché il monitoraggio dei livelli di azoto liquido e della temperatura all'interno della navetta.
Lo Shuttle (Figura 6) è un dispositivo portatile utilizzato per prelevare un blocco di trasferimento dal bagno di azoto liquido della Sample Station e trasferirlo all'interno di un ambiente criogenico e vuoto alla stazione finale. Include un dewar di azoto liquido per mantenere i campioni freddi durante il trasferimento, il monitoraggio del livello del liquido nel dewar e una varietà di sensori per il funzionamento e la sicurezza dell'utente. Il braccio di trasferimento è dotato di un azionamento magnetico e include scanalature lavorate per guidare gli utenti nel carico e nello scarico sicuri dei blocchi di trasferimento nella stazione finale. Il trasferimento dalla navetta al recipiente a vuoto viene effettuato tramite una camera d'aria. L'airlock è un'interfaccia per lo shuttle sulla stazione terminale utilizzata per evacuare l'intercapedine tra la navetta e la stazione terminale, prima di aprire le valvole del vuoto dello shuttle e della stazione finale. Le sequenze di pompaggio e sfiato sono completamente automatizzate e possono essere azionate tramite un ampio touchscreen con un'interfaccia user-friendly (Figura 4C). L'attuale protocollo viene utilizzato per trasferire un cristallo di taumatina alla stazione terminale del vuoto per la raccolta dei dati.

<table><tbody><tr><td>Rivelatore 12M</td><td>Dectris, Svizzera</td><td></td><td>Rilevatore di raggi X a conteggio di fotoni singoli</td></tr><tr><td>CombiPuck</td><td>MiTeGen</td><td>SKU: M-CBP-P1</td><td>Cryopuck utilizzati per la conservazione criogenica e il trasporto di supporti per campioni I23 e campioni</td></tr><tr><td>Bacchetta magnetica per la raccolta dei cristalli</td><td>Dimensioni molecolari</td><td>MD7-411</td><td>Utilizzato per la raccolta dei cristalli</td></tr><tr><td>Dry Shipper (CX100)</td><td>Dimensioni molecolari</td><td>MD7-21</td><td>Utilizzato per lo stoccaggio criogenico e il trasporto di supporti e campioni di campioni I23</td></tr><tr><td>Inserto per spedizioniere a secco (CombiPuck Transport Cane)</td><td>MiTeGen</td><td>SKU: M-CBP-PTC1</td><td>Utilizzato per lo stoccaggio criogenico e il trasporto di supporti per campioni I23 e campioni</td></tr><tr><td>in poliimmide</td><td></td><td></td> <td>Kaptonsupporto del campione in Kapton poliimmide</td></tr><tr><td>Perpsex coperchio</td><td></td><td></td><td>acrilico con chiave di rotazione incorporata</td></tr><tr><td>Taumatina in polvere</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>T7638</td><td>Utilizzato per la produzione di cristalli di taumatina mediante diffusione di vapore</td></tr></tbody></table>

protocollo di preparazione e trasferimento dei campioni per cristallografia a lunghezza d'onda lunga sotto vuoto su beamline i23 presso diamond light source

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

La cristallografia macromolecolare a lunga lunghezza d'onda (MX) sfrutta le proprietà anomale di scattering di elementi, come zolfo, fosforo, potassio, cloro o calcio, che sono spesso presenti nativamente nelle macromolecole. Ciò consente la soluzione a struttura diretta di proteine e acidi nucleici tramite phasing sperimentale senza la necessità di ulteriori etichettature. Per eliminare il significativo assorbimento d'aria dei raggi X in questo regime di lunghezza d'onda, questi esperimenti vengono eseguiti in un ambiente di vuoto. Beamline I23 a Diamond Light Source, Regno Unito, è il primo strumento di sincrotrone del suo genere, progettato e ottimizzato per esperimenti MX nella lunga gamma di lunghezze d'onda verso 5 Å. 
Per rendere ciò possibile, un grande recipiente per vuoto racchiude tutti i componenti della stazione terminale dell'ambiente campione. La necessità di mantenere i campioni a temperature criogeniche durante la conservazione e la raccolta dei dati nel vuoto richiede l'uso di portacampioni termicamente conduttivi. Ciò facilita un'efficiente rimozione del calore per garantire il raffreddamento del campione a circa 50 K. L'attuale protocollo descrive le procedure utilizzate per la preparazione dei campioni e il trasferimento dei campioni nel vuoto sulla beamline I23. Garantendo l'uniformità nelle pratiche e nei metodi già stabiliti all'interno della comunità della cristallografia macromolecolare, il raffreddamento del campione alla temperatura dell'azoto liquido può essere eseguito in qualsiasi ambiente di laboratorio dotato di strumenti MX standard. 
Lo stoccaggio criogenico e il trasporto di campioni richiedono solo attrezzature standard disponibili in commercio. Sono necessarie attrezzature specializzate per il trasferimento di cristalli raffreddati criogenicamente dall'azoto liquido alla stazione terminale del vuoto. Strumenti di gestione dei campioni su misura e un sistema di trasferimento criogenico (CTS) dedicato sono stati sviluppati internamente. I dati di diffrazione raccolti su campioni preparati utilizzando questo protocollo mostrano eccellenti statistiche di fusione, indicando che la qualità dei campioni è inalterata durante la procedura. Ciò apre opportunità uniche per l'MX nel vuoto in un intervallo di lunghezze d'onda oltre le linee di fascio di sincrotrone standard.

Un cristallo di taumatina è stato introdotto nella stazione terminale del vuoto utilizzando il protocollo sopra descritto. I dati di diffrazione sono stati raccolti a una lunghezza d'onda di 2,7552 Å (E = 4500 eV) come 3600 immagini con un incremento di rotazione di 0,1 ° e 0,1 s di esposizione per immagine. La dimensione del fascio è stata regolata a 150 μm x 150 μm e ridotta al 10% di trasmissione, con una corrispondente misurazione del flusso di 7,1 x 109 fotoni/s. La scelta di λ = 2,7552 Å si basa su un compromesso tra l'aumento degli effetti anomali di assorbimento del segnale e del campione e la diminuzione della risoluzione a lunghezze d'onda più lunghe. Sebbene non vicino al margine teorico di assorbimento dello zolfo (λ= 5,0095 Å), a questa lunghezza d'onda, il contributo immaginario al fattore di scattering dello zolfo f" è 1,57 e- , un fattore di 1,6-2,1 più grande rispetto alle lunghezze d'onda comprese tra 1,7 e 2 Å. I segnali anomali più forti che ne derivano consentono una gradualità S-SAD di successo per progetti più impegnativi.
Una serie di difficili esperimenti di phasing sono già stati condotti sulla beamline I2324,25,26,27, con dati raccolti a questa lunghezza d'onda. Mentre la fasatura tramite S-SAD è possibile utilizzando lunghezze d'onda molto più corte, ciò richiede spesso la costruzione di segnali anomali attraverso la fusione di dati da molti cristalli isomorfi per raggiungere valori di molteplicità su 10028. A causa del segnale anomalo potenziato a lunghezze d'onda più lunghe, la maggior parte dei progetti di phasing risolti su I23 richiedeva solo dati da un cristallo. Un'immagine di diffrazione rappresentativa è mostrata nella Figura 7, a sinistra. L'elaborazione dei dati utilizzando Xia2-3dii29 ha prodotto eccellenti statistiche di fusione, come indicato nella Tabella 1. La Figura 7, a destra, mostra parte di un'immagine di diffrazione rappresentativa dal set di dati di taumatina e illustra lo sfondo basso che circonda le riflessioni di Bragg, che contribuisce ai grandi valori I/σ(I) tipicamente osservati nella configurazione del vuoto, assicurando che solo i raggi X dispersi dal campione raggiungano il rivelatore.
La risoluzione massima raggiungibile di 1,8 Å è dovuta alla geometria del rivelatore e alla lunghezza d'onda scelta della radiazione a raggi X. Il set di dati ha prodotto un segnale anomalo molto forte, riflesso nella pendenza media del parametro di probabilità normale anomala di 2.677, facilitando la soluzione della struttura dalla pipeline di fasatura automatica CRANK2. L'alta qualità della mappa della densità elettronica risultante ha permesso la costruzione automatica del modello di successo da parte del modulo Buccaneer30 all'interno di CRANK231, con il corretto posizionamento per il 100% della sequenza di amminoacidi della taumatina. La mappa di Fourier a differenza anomala di fase, calcolata con ANODE11, rivela 16 atomi di zolfo molto ben ordinati e un atomo di zolfo di Cys159 con due conformazioni alternative, come confermato dalle 18 altezze significative dei picchi nelle posizioni degli scatterer anomali nella Tabella 2. I 16 residui di cisteina all'interno della taumatina formano 8 ponti disolfuro, che sono tutti chiaramente visibili nella mappa 2Fo-Fc (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg"> Figura 1: Dati di diffrazione ad alta risoluzione da esperimenti MX a lunga lunghezza d'onda. (A) Grafico dei valori f" rispetto all'energia, che indica i bordi di assorbimento degli elementi leggeri accessibili sulla beamline I23. (B) Massima risoluzione raggiungibile agli angoli del rivelatore P12M contro l'energia. Abbreviazione: MX = cristallografia macromolecolare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg"> Figura 2: Sezione orizzontale attraverso il recipiente del vuoto con tutti i componenti della stazione finale. Abbreviazione: OAV = sistema di visualizzazione sull'asse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg"> Figura 3: Strumenti di gestione dei campioni. (A) I23 Portacampioni. (B) Pin mx spine-standard (a sinistra) accanto a un portacampioni I23 con adattatore (a destra). (C) Coperchio e base Combipuck con portacampioni I23 (blu). Coperchio e base del disco di blocco con due blocchi di trasferimento (oro). Una canna da spedizioniere asciutta, compatibile sia con i pettine che con i puck di blocco, è visibile sul retro. (D) Blocco di trasferimento con quattro portacampioni I23. (E) Strumento chiave utilizzato per la rotazione della base del disco del blocco. (F) Bacchetta separatore. (G) Strumento separatore Puck con due frecce che mostrano le impostazioni alta e bassa. (H) Base del disco di blocco con quattro blocchi di Cu vuoti. (I) Coperchio per il disco di blocco. (J) Contenitore di schiuma con tutti gli strumenti necessari per il trasferimento dei portacampioni dalle basi di pettine ai blocchi di rame. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg"> Figura 4: Sistema di trasferimento criogenico. (A) Stazione di campionamento CTS con navetta collegata e imbuti utilizzati per il riempimento. (B) Un disco di blocco con due blocchi di trasferimento posizionati all'interno del CTS. (C) Touchscreen del software di controllo CTS. Abbreviazione: CTS = Sistema di trasferimento criogenico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg"> Figura 5: Stazione campione del sistema di trasferimento criogenico. Abbreviazioni: LED = diodi emettitori di luce; LN2 = azoto liquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg"> Figura 6: Navetta del sistema di trasferimento criogenico. Abbreviazioni: LED = diodi emettitori di luce; LN2 = azoto liquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg"> Figura 7: Immagini di diffrazione. A sinistra, un'immagine di diffrazione dal set di dati raccolto sul cristallo di taumatina. A destra, un punto di diffrazione circondato da pixel di sfondo a basso conteggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg"> Figura 8: Soluzione strutturale di Thaumatin con pipeline automatica CRANK2 (impostazioni predefinite, nessun successivo affinamento). (A) Panoramica della taumatina con mappa 2Fo-Fc a 1,6σ (blu) e differenza anomala di fase Mappa di Fourier a 5σ calcolata in ANODE (verde). (B) Panoramica della taumatina che mostra solo la mappa di Fourier con differenza anomala di fase a 5σ. (C) Vista ravvicinata di un ponte disolfuro presente in taumatina con mappa 2Fo-Fc a 1,6σ (blu) e mappa di Fourier a differenza anomala di fase a 5σ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Thaumatin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lunghezza d'onda di raccolta dati (Å) (energia (eV))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Numero di immagini x dimensione del cuneo (°)</td>
			<td>3600 x 0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gruppo spaziale</td>
			<td>
S 41212</td>
		</tr>
<tr>
<td>Costanti di cella unitaria</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(a = b, c) (Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Risoluzione (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Completezza</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isa</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas ·</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim ·</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 ·</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molteplicità</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pendenza media</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Statistiche di raccolta ed elaborazione dei dati per Thaumatin a lunghezza d'onda di 2,755 Å alla beamline I23, DLS. Per risoluzione, completezza, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) e molteplicità, i gusci ad alta risoluzione sono mostrati tra parentesi. Abbreviazione: DLS = Diamond Light Source.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Atomo più vicino</td>
			<td>Altezza di picco (sigma)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS9 ·</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS56 ·</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>MET112 ·</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS149 ·</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS126 ·</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS145 ·</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS134 ·</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS177 ·</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS204 ·</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS66 ·</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS164 ·</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS193 ·</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS158 ·</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS77 ·</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS121 ·</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS71 ·</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Differenza anomala Le altezze dei picchi di Fourier mappate da ANODE utilizzando il modello a fasi e costruito automaticamente da CRANK2.

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione di campioni criogenici e il trasferimento di cristalli nella stazione finale del vuoto sulla beamline I23 a Diamond Light Source, per esperimenti di cristallografia macromolecolare a raggi X a lunga lunghezza d'onda.

Protocollo di preparazione e trasferimento dei campioni per cristallografia a lunghezza d'onda lunga sotto vuoto su Beamline I23 presso Diamond Light Source

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

La cristallografia macromolecolare a lunga lunghezza d'onda sfrutta il segnale anomalo proveniente da atomi di luce nativamente presenti nelle proteine e negli acidi nucleici. Questa tecnica viene utilizzata per risolvere sperimentalmente il problema della faccia cristallografica e per determinare l'identità e la posizione di questi elementi. Beamline I23 at Diamond Light Source è uno strumento di sincrotrone unico ottimizzato per esperimenti a lunghezze d'onda lunghe fino a cinque angstrom.Permette l'accesso ai bordi di assorbimento di elementi di elevata rilevanza biologica, come calcio, potassio, cloro, zolfo e fosforo. A causa del significativo assorbimento dei raggi X da parte dell'aria nel regime a lunghezza d'onda lunga, questi esperimenti vengono eseguiti in un ambiente di vuoto. Per mantenere i campioni a temperature criogeniche all'interno dell'ambiente sottovuoto, i cristalli sono montati su portacampioni dedicati e termicamente conduttivi.Il trasferimento del campione criogenico dall'azoto liquido alla stazione terminale del vuoto è molto simile alle tecniche utilizzate nella crioelettronica. Questo protocollo presenta la procedura per il trasferimento dei cristalli nell'ambiente del vuoto utilizzando gli strumenti e le attrezzature sviluppate presso Diamond Light Source. Iniziare separando il coperchio dalla base del CombiPuck in modo che i portacampioni rimangano attaccati alla base e i flaconcini siano trattenuti nel coperchio.Immergere il coperchio con flaconcini in azoto liquido, quindi collegare un portacampioni e un adattatore a una bacchetta magnetica e raccogliere i cristalli. Raffreddare a filo ogni campione direttamente nel CombiPuck, notando la posizione del campione. Per chiudere il disco, utilizzare una bacchetta per fissare la base al coperchio.Trasferire il CombiPuck dall'azoto liquido allo spedizioniere secco o allo stoccaggio. Posizionare la base del disco di blocco già popolato con blocchi di trasferimento vuoti sulla sua base di supporto in un contenitore di schiuma, quindi riempire con azoto liquido. Quindi, posizionare il CombiPuck nel contenitore di schiuma riempito con azoto liquido, assicurandosi che la base del disco sia fissata al supporto magnetico all'interno del contenitore di schiuma.Pre-raffreddare tutti gli strumenti necessari in azoto liquido. Quindi, separare il coperchio dalla base utilizzando lo strumento separatore a disco sull'impostazione alta, in modo che la base rimanga attaccata al supporto magnetico, esponendo i portacampioni all'interno dell'azoto liquido. Posizionare la bacchetta del separatore sul supporto del campione e sull'adattatore il più in basso possibile, assicurandosi che la bacchetta sia verticale.Spostare la piccola leva sulla bacchetta del separatore verso il basso con il pollice fino a quando non scatta per fissare il supporto del campione all'interno e tirare il supporto del campione dall'adattatore. Abbassare il separatore sulla posizione desiderata del blocco di trasferimento, assicurandosi che uno dei tre rebbi si adatti all'interno del foro centrale del blocco di trasferimento. Rilasciare il supporto del campione spostando nuovamente la leva verso l'alto.Per caricare i campioni nel blocco di trasferimento successivo, utilizzare lo strumento chiave carosello per ruotare un blocco di trasferimento vuoto in posizione orizzontale. Una volta trasferiti tutti i portacampioni, chiudere il disco di blocco posizionando il coperchio in azoto liquido. Attendere che la temperatura si equilibri, quindi montare il coperchio sulla base e sollevare delicatamente per rilasciare dalla giostra.Collegare la navetta alla stazione. Aprire le valvole azoto gas e aria e assicurarsi che i gas scorrano. Quindi, accendere il CTS.Raffreddare sia il bagno che la navetta con azoto liquido. Posizionare l'imbuto fornito nella porta di riempimento sulla navetta e versare lentamente azoto liquido nell'imbuto mentre si monitora il livello sullo schermo. Fermati quando l'indicatore passa dal rosso al blu.Riempire il bagno con azoto liquido usando l'imbuto. Trasferire un disco di blocco dall'azoto liquido al bagno CTS utilizzando lo strumento separatore di puck collegato. Rimuovere il coperchio del disco di blocco e chiudere il coperchio del bagno CTS.Per introdurre un blocco di trasferimento nella navetta, sbloccare la maniglia della navetta ruotando di 90 gradi in senso orario e farla avanzare verso il bagno in modo che la traccia guidata sulla maniglia imponga il percorso corretto di viaggio. Una volta raffreddato il coperchio del blocco, far avanzare la maniglia per introdurre il blocco nella navetta. Per bloccare il blocco di trasferimento sulla navetta, ruotare la maniglia di 180 gradi in senso orario.Ritrarre la maniglia nella posizione posteriore originale e bloccarla in posizione ruotando di 90 gradi in senso antiorario. Premere Chiudi pompa valvola shuttle sullo schermo di visualizzazione per avviare l'evacuazione della navetta. Una volta che i messaggi Shuttle pronto a muoversi e Non spostare asta, valvola chiusa vengono visualizzati sul touch screen, premere la leva sotto la navetta e sollevarla con cura utilizzando la maniglia in alto.Portare la navetta all'airlock sulla stazione terminale del vuoto in posizione verticale e collegarla. Selezionare una posizione di blocco vuoto all'interno della nave premendo il pulsante corrispondente sul touch screen e spostando l'hotel campione nella posizione di caricamento corretta. Una volta che un hotel campione è in posizione, premere il pulsante Apri per avviare la sequenza di interblocco del vuoto.Dopo che la sequenza è completa e lo stato cambia in Airlock aperto, blocca in navetta, ruota la maniglia di 90 gradi in senso orario per sbloccare l'asta. Spingere delicatamente l'asta nella nave in modo che la traccia guidata imponga il percorso corretto di viaggio verso l'hotel campione. Inserisci lentamente il blocco di trasferimento nell'hotel utilizzando il feed video visualizzato sullo schermo come guida, assicurandoti che l'icona della posizione del blocco sul display touch sia attivata.Una volta attivato, ruotare la maniglia di 180 gradi in senso antiorario per rilasciare il blocco di trasferimento e tirare fuori l'asta dal recipiente. Una volta completamente retratto, ruotare la maniglia di 90 gradi in senso antiorario per bloccare l'asta. Premere il pulsante Chiudi per chiudere la valvola del vuoto della stazione finale e sfiatare lo spazio tra la navetta e il recipiente alla pressione atmosferica.Rimuovere la navetta quando il display airlock mostra lo stato OK da scollegare. Riportare la navetta al bagno CTS e premere Open Shuttle Valve per evacuare la navetta prima di caricare il blocco di campione successivo. Una volta che il semaforo è verde e viene visualizzato il messaggio OK per spostare l'asta, il blocco di trasferimento successivo può essere introdotto nella navetta.Per preparare il blocco di trasferimento successivo, ruotare il disco di blocco all'interno del bagno. Spingere la chiave di rotazione incorporata sulla parte superiore del coperchio acrilico verso il basso nella serratura al centro del disco del blocco. Tenendolo premuto, ruotare la chiave per posizionare il blocco di trasferimento desiderato nella posizione di prelievo.Una volta trasferiti tutti i blocchi, assicurarsi che la valvola shuttle sia aperta, premere il pulsante Bake sul touch screen, selezionare sia Bath che Shuttle, quindi premere Start Bake. La beamline di cristallografia macromolecolare a lunghezza d'onda lunga I23 a Diamond Light Source può accedere ai bordi di assorbimento di elementi di elevata importanza biologica, come calcio, potassio, cloro, zolfo e fosforo, dando un segnale anomalo potenziato che può essere utilizzato per la fasatura o la localizzazione di questi elementi all'interno di macromolecole. I dati di diffrazione sono stati raccolti da un singolo cristallo di taumatina a lunghezza d'onda 2,75 angstrom, scelto come compromesso tra l'aumento del segnale anomalo e gli effetti di assorbimento del campione a lunghezze d'onda più lunghe.La configurazione del vuoto assicura che solo i raggi X dispersi dal campione raggiungano il rivelatore, fornendo uno sfondo basso attorno ai riflessi di Bragg. Il set di dati ha prodotto un segnale anomalo molto forte, facilitando la soluzione della struttura mediante la pipeline di fasatura automatica CRANK2. L'alta qualità della mappa della densità elettronica risultante ha permesso la costruzione di modelli automatici di successo, con il corretto posizionamento per il 100% della sequenza di amminoacidi della taumatina.I 16 residui di cisteina all'interno della taumatina formano otto ponti disolfuro, che sono tutti chiaramente visibili nella mappa della densità elettronica. Poiché la cristallografia proteica a lunghezza d'onda lunga nel vuoto è un campo nuovo, abbiamo sviluppato nuovi strumenti e attrezzature per la gestione dei campioni. Questo protocollo guida gli utenti nel trasferimento sicuro dei campioni nella stazione terminale del vuoto sulla beamline I23 presso Diamond Light Source.L'ambiente del vuoto apre opportunità uniche per eseguire esperimenti di diffrazione in un intervallo di lunghezze d'onda non accessibile ad altre linee di fascio. La cristallografia a raggi X a lunghezza d'onda lunga consente la fasatura sperimentale di macromolecole direttamente dai cristalli nativi. Permette inoltre l'identificazione univoca degli ioni legati alle molecole.

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Flusso di lavoro e strumenti per lo screening dei frammenti cristallografici presso l'Helmholtz-Zentrum di Berlino

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Questo articolo descrive l'intero processo XChem per lo screening dei frammenti a base di cristalli, a partire dalla richiesta di accesso e da tutte le fasi successive alla diffusione dei dati.

Ottenere uno screening efficiente dei frammenti presso l'impianto XChem di Diamond Light Source

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Cristallizzazione e raccolta dati a temperatura ambiente in situ utilizzando l'impianto di cristallizzazione di Harwell e Beamline VMXi, sorgente luminosa diamantata

Impara il protocollo di preparazione e trasferimento criogenico di cristalli macromolecolari per cristallografia a lunghezza d'onda lunga in vuoto. Questo metodo consente il fasing sperimentale e l'identificazione di elementi leggeri biologicamente rilevanti.

Protocollo di preparazione e trasferimento dei campioni per cristallografia a lunghezza donda lunga sotto vuoto su Beamline I23 presso Diamond Light Source (Video) | JoVE Journal

Protocollo di preparazione e trasferimento dei campioni per cristallografia a lunghezza d'onda lunga sotto vuoto su Beamline I23 presso Diamond Light Source

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