Protocollo di preparazione e trasferimento dei campioni per cristallografia a lunghezza d'onda lunga sotto vuoto su Beamline I23 presso Diamond Light Source

La cristallografia macromolecolare a lunga lunghezza d'onda sfrutta il segnale anomalo proveniente da atomi di luce nativamente presenti nelle proteine e negli acidi nucleici. Questa tecnica viene utilizzata per risolvere sperimentalmente il problema della faccia cristallografica e per determinare l'identità e la posizione di questi elementi. Beamline I23 at Diamond Light Source è uno strumento di sincrotrone unico ottimizzato per esperimenti a lunghezze d'onda lunghe fino a cinque angstrom.

Permette l'accesso ai bordi di assorbimento di elementi di elevata rilevanza biologica, come calcio, potassio, cloro, zolfo e fosforo. A causa del significativo assorbimento dei raggi X da parte dell'aria nel regime a lunghezza d'onda lunga, questi esperimenti vengono eseguiti in un ambiente di vuoto. Per mantenere i campioni a temperature criogeniche all'interno dell'ambiente sottovuoto, i cristalli sono montati su portacampioni dedicati e termicamente conduttivi.

Il trasferimento del campione criogenico dall'azoto liquido alla stazione terminale del vuoto è molto simile alle tecniche utilizzate nella crioelettronica. Questo protocollo presenta la procedura per il trasferimento dei cristalli nell'ambiente del vuoto utilizzando gli strumenti e le attrezzature sviluppate presso Diamond Light Source. Iniziare separando il coperchio dalla base del CombiPuck in modo che i portacampioni rimangano attaccati alla base e i flaconcini siano trattenuti nel coperchio.

Immergere il coperchio con flaconcini in azoto liquido, quindi collegare un portacampioni e un adattatore a una bacchetta magnetica e raccogliere i cristalli. Raffreddare a filo ogni campione direttamente nel CombiPuck, notando la posizione del campione. Per chiudere il disco, utilizzare una bacchetta per fissare la base al coperchio.

Trasferire il CombiPuck dall'azoto liquido allo spedizioniere secco o allo stoccaggio. Posizionare la base del disco di blocco già popolato con blocchi di trasferimento vuoti sulla sua base di supporto in un contenitore di schiuma, quindi riempire con azoto liquido. Quindi, posizionare il CombiPuck nel contenitore di schiuma riempito con azoto liquido, assicurandosi che la base del disco sia fissata al supporto magnetico all'interno del contenitore di schiuma.

Pre-raffreddare tutti gli strumenti necessari in azoto liquido. Quindi, separare il coperchio dalla base utilizzando lo strumento separatore a disco sull'impostazione alta, in modo che la base rimanga attaccata al supporto magnetico, esponendo i portacampioni all'interno dell'azoto liquido. Posizionare la bacchetta del separatore sul supporto del campione e sull'adattatore il più in basso possibile, assicurandosi che la bacchetta sia verticale.

Spostare la piccola leva sulla bacchetta del separatore verso il basso con il pollice fino a quando non scatta per fissare il supporto del campione all'interno e tirare il supporto del campione dall'adattatore. Abbassare il separatore sulla posizione desiderata del blocco di trasferimento, assicurandosi che uno dei tre rebbi si adatti all'interno del foro centrale del blocco di trasferimento. Rilasciare il supporto del campione spostando nuovamente la leva verso l'alto.

Per caricare i campioni nel blocco di trasferimento successivo, utilizzare lo strumento chiave carosello per ruotare un blocco di trasferimento vuoto in posizione orizzontale. Una volta trasferiti tutti i portacampioni, chiudere il disco di blocco posizionando il coperchio in azoto liquido. Attendere che la temperatura si equilibri, quindi montare il coperchio sulla base e sollevare delicatamente per rilasciare dalla giostra.

Collegare la navetta alla stazione. Aprire le valvole azoto gas e aria e assicurarsi che i gas scorrano. Quindi, accendere il CTS.

Raffreddare sia il bagno che la navetta con azoto liquido. Posizionare l'imbuto fornito nella porta di riempimento sulla navetta e versare lentamente azoto liquido nell'imbuto mentre si monitora il livello sullo schermo. Fermati quando l'indicatore passa dal rosso al blu.

Riempire il bagno con azoto liquido usando l'imbuto. Trasferire un disco di blocco dall'azoto liquido al bagno CTS utilizzando lo strumento separatore di puck collegato. Rimuovere il coperchio del disco di blocco e chiudere il coperchio del bagno CTS.

Per introdurre un blocco di trasferimento nella navetta, sbloccare la maniglia della navetta ruotando di 90 gradi in senso orario e farla avanzare verso il bagno in modo che la traccia guidata sulla maniglia imponga il percorso corretto di viaggio. Una volta raffreddato il coperchio del blocco, far avanzare la maniglia per introdurre il blocco nella navetta. Per bloccare il blocco di trasferimento sulla navetta, ruotare la maniglia di 180 gradi in senso orario.

Ritrarre la maniglia nella posizione posteriore originale e bloccarla in posizione ruotando di 90 gradi in senso antiorario. Premere Chiudi pompa valvola shuttle sullo schermo di visualizzazione per avviare l'evacuazione della navetta. Una volta che i messaggi Shuttle pronto a muoversi e Non spostare asta, valvola chiusa vengono visualizzati sul touch screen, premere la leva sotto la navetta e sollevarla con cura utilizzando la maniglia in alto.

Portare la navetta all'airlock sulla stazione terminale del vuoto in posizione verticale e collegarla. Selezionare una posizione di blocco vuoto all'interno della nave premendo il pulsante corrispondente sul touch screen e spostando l'hotel campione nella posizione di caricamento corretta. Una volta che un hotel campione è in posizione, premere il pulsante Apri per avviare la sequenza di interblocco del vuoto.

Dopo che la sequenza è completa e lo stato cambia in Airlock aperto, blocca in navetta, ruota la maniglia di 90 gradi in senso orario per sbloccare l'asta. Spingere delicatamente l'asta nella nave in modo che la traccia guidata imponga il percorso corretto di viaggio verso l'hotel campione. Inserisci lentamente il blocco di trasferimento nell'hotel utilizzando il feed video visualizzato sullo schermo come guida, assicurandoti che l'icona della posizione del blocco sul display touch sia attivata.

Una volta attivato, ruotare la maniglia di 180 gradi in senso antiorario per rilasciare il blocco di trasferimento e tirare fuori l'asta dal recipiente. Una volta completamente retratto, ruotare la maniglia di 90 gradi in senso antiorario per bloccare l'asta. Premere il pulsante Chiudi per chiudere la valvola del vuoto della stazione finale e sfiatare lo spazio tra la navetta e il recipiente alla pressione atmosferica.

Rimuovere la navetta quando il display airlock mostra lo stato OK da scollegare. Riportare la navetta al bagno CTS e premere Open Shuttle Valve per evacuare la navetta prima di caricare il blocco di campione successivo. Una volta che il semaforo è verde e viene visualizzato il messaggio OK per spostare l'asta, il blocco di trasferimento successivo può essere introdotto nella navetta.

Per preparare il blocco di trasferimento successivo, ruotare il disco di blocco all'interno del bagno. Spingere la chiave di rotazione incorporata sulla parte superiore del coperchio acrilico verso il basso nella serratura al centro del disco del blocco. Tenendolo premuto, ruotare la chiave per posizionare il blocco di trasferimento desiderato nella posizione di prelievo.

Una volta trasferiti tutti i blocchi, assicurarsi che la valvola shuttle sia aperta, premere il pulsante Bake sul touch screen, selezionare sia Bath che Shuttle, quindi premere Start Bake. La beamline di cristallografia macromolecolare a lunghezza d'onda lunga I23 a Diamond Light Source può accedere ai bordi di assorbimento di elementi di elevata importanza biologica, come calcio, potassio, cloro, zolfo e fosforo, dando un segnale anomalo potenziato che può essere utilizzato per la fasatura o la localizzazione di questi elementi all'interno di macromolecole. I dati di diffrazione sono stati raccolti da un singolo cristallo di taumatina a lunghezza d'onda 2,75 angstrom, scelto come compromesso tra l'aumento del segnale anomalo e gli effetti di assorbimento del campione a lunghezze d'onda più lunghe.

La configurazione del vuoto assicura che solo i raggi X dispersi dal campione raggiungano il rivelatore, fornendo uno sfondo basso attorno ai riflessi di Bragg. Il set di dati ha prodotto un segnale anomalo molto forte, facilitando la soluzione della struttura mediante la pipeline di fasatura automatica CRANK2. L'alta qualità della mappa della densità elettronica risultante ha permesso la costruzione di modelli automatici di successo, con il corretto posizionamento per il 100% della sequenza di amminoacidi della taumatina.

I 16 residui di cisteina all'interno della taumatina formano otto ponti disolfuro, che sono tutti chiaramente visibili nella mappa della densità elettronica. Poiché la cristallografia proteica a lunghezza d'onda lunga nel vuoto è un campo nuovo, abbiamo sviluppato nuovi strumenti e attrezzature per la gestione dei campioni. Questo protocollo guida gli utenti nel trasferimento sicuro dei campioni nella stazione terminale del vuoto sulla beamline I23 presso Diamond Light Source.

L'ambiente del vuoto apre opportunità uniche per eseguire esperimenti di diffrazione in un intervallo di lunghezze d'onda non accessibile ad altre linee di fascio. La cristallografia a raggi X a lunghezza d'onda lunga consente la fasatura sperimentale di macromolecole direttamente dai cristalli nativi. Permette inoltre l'identificazione univoca degli ioni legati alle molecole.