Analisi della composizione lipidica dei micobatteri mediante cromatografia a strato sottile

I lipidi dei micobatteri sono una caratteristica importante del genere e sono fondamentali nelle interazioni dei micobatteri dell'ospite. Velocità e versatilità sono i principali vantaggi di questa procedura. Questo metodo può essere utilizzato per comprendere il ruolo dei lipidi e la patogenicità dei micobatteri e il loro effetto immunostimolante.

Per l'estrazione di lipidi legati non covalenti, aggiungere 15 millilitri di uno o due cloroformio alla soluzione di metanolo a un tubo di vetro con un tappo a vite in PTFE sotto una cappa a flusso laminare. Quindi, grattare 200 milligrammi di micobatteri da un mezzo solido e aggiungere i micobatteri al tubo di vetro. Incubare il tubo durante la notte con agitazione costante.

Il giorno successivo, filtrare i solventi organici attraverso un imbuto di vetro rivestito con carta da filtro in un tubo di vetro. Dopo aver utilizzato il flusso di gas di azoto, per evaporare la fase liquida nel tubo, riempire il tubo con gas azoto, per conservare il tubo a quattro gradi Celsius. Quindi, aggiungere 15 millilitri di cloroformio due a uno alla soluzione di metanolo ai detriti cellulari e incubare il tubo durante la notte con agitazione costante.

La mattina successiva, lasciare riposare la miscela per un'ora, prima di utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire i solventi organici in un imbuto di vetro rivestito di carta da filtro nello stesso tubo di raccolta del vetro. Quindi, evaporare la fase liquida come dimostrato, prima di riempire il tubo con azoto gassoso per lo stoccaggio di quattro gradi Celsius. Per l'estrazione dell'acido micolico, aggiungere da due a cinque millilitri di una soluzione stirificante e 200 milligrammi di biomassa di micobatteri in un tubo di vetro ermetico con un tappo a vite in PTFE e mescolare il contenuto mediante vortice.

Incubare la miscela all'interno di un bagno secco a 80 gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo, quando il tubo si è raffreddato a temperatura ambiente, aggiungere due millilitri di N esano e mescolare il contenuto per 30 secondi vorticosamente. Lasciare che il tubo si depositi fino a quando non compaiono due fasi chiare e trasferire la fase di N esano superiore in un nuovo tubo.

Mescolare due millilitri aggiuntivi di N esano con il contenuto del tubo e raccogliere nuovamente lo strato superiore. Quindi, evaporare il contenuto del tubo mediante flusso di azoto e conservare il campione coperto di azoto a quattro gradi Celsius come dimostrato. Per analizzare i campioni con TLC coprire una parete della camera TLC con un pezzo di carta da filtro, aggiungere vaselina sugli angoli della camera per sigillare la camera, per lattina la miscela di solvente sopra la carta da filtro e aggiungere il volume rimanente del solvente sul fondo della camera TLC.

Chiudere la camera TLC per almeno 20 minuti a saturo. Nel frattempo, sciogliere i lipidi nel tubo di vetro in 200-1000 microlitri di cloroformio e utilizzare un tubo di vetro capillare per applicare 10 microlitri della sospensione lipidica di cloroformio direttamente sulla piastra TLC. Dopo aver permesso al campione di asciugarsi per cinque minuti, inserire la piastra nella camera TLC satura e lasciare che la fase mobile attraversi la TLC.

Quando il solvente raggiunge un centimetro dall'estremità superiore della piastra, posizionare la piastra sotto il flusso laminare fino a quando la silice non è completamente asciutta. Quindi, spruzzare la piastra essiccata con 15-20 millilitri di idrato di acido fosforico al 10% di dati molari in etanolo fino a quando la piastra è di colore giallo brillante e riscaldare la piastra per due-cinque minuti a 120 gradi Celsius. In questa analisi rappresentativa, l'acido micolico estratto da varie specie di micobatteri, sono stati analizzati attraverso TLC unidimensionali utilizzando due diversi sistemi di eluizione e TLC bidimensionali.

Sono stati inoltre eseguiti due tipi di procedure di metilazione per confermare la presenza di acido micolico di tipo cinque. In entrambi i sistemi di eluizione, gli acidi micolici si trovavano approssimativamente al centro della piastra, anche se, il punto corrispondente all'acido micolico di tipo cinque, è stato osservato solo dopo la saponificazione. La TLC bidimensionale consente inoltre l'identificazione dei singoli tipi di acido micolico.

Ad esempio, mycobacterium brumae esprime solo acidi micolici di tipo uno, mycobacterium bovis BCG esprime il tipo uno e quattro, mycobacterium fortuitum esprime il tipo uno e cinque e mycobacterium abcessus esprime profili di acido micolico di tipo uno e due. Gli estratti lipidici totali di varie specie di micobatteri sono stati analizzati in funzione della loro polarità e dimensione. Rivela che la maggior parte dei lipidi polari A, come i PDIM, sono presenti nel mycobacterium bovis BCG, ma non nel mycobacterium fortuitum, nel mycobacterium brumae e nel morfotipo liscio di M abcessus.

Glicolipidi fenolici sono presenti solo nel mycobacterium bovis BCG, mentre i GlycoPeptidoLipids sono osservati solo in campioni di mycobacterium abcessus. Simile agli acidi micolici, gli acilgliceroli e i PDIM, i PIM, possono anche essere facilmente visualizzati attraverso l'analisi TLC unidimensionale o TLC 2D. Due tipi di macchie sono stati utilizzati per rivelare i PIM in TLC unidimensionali.

La cosa più importante da ricordare quando si tenta questo protocollo è di non utilizzare strumenti di plastica durante la procedura.