Name: Generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Scopri come generare xenografti larvali di zebrafish con cellule tumorali umane per analizzare in vivo proliferazione, angiogenesi e metastasi. Questo protocollo standardizzato consente screening farmacologici ad alto rendimento e applicazioni di medicina personalizzata.

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Ringraziamo fondazione Champalimaud, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, cofinanziata da FCT/Lisboa2020) per il finanziamento. Borse FCT per VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Tutti i membri del Fior Lab per le discussioni critiche; B. Costa e C. Rebelo de Almeida per la condivisione dei dati; e i nostri membri del laboratorio C. Rebelo de Almeida, M. Barroso e L. Leite per la loro partecipazione al video. Ringraziamo il team CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) e Champalimaud Communication, Events and Outreach team in particolare Alexandre Azinheira per il fantastico cinema e Catarina Ramos e Teresa Fernandes per il loro aiuto.

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</ol>

La crescente importanza del pesce zebra come modello per lo sviluppo del cancro e lo screening farmacologico ha portato a numerosepubblicazioni 3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Tuttavia, l'iniezione di cellule tumorali negli embrioni di zebrafish è una tecnica che richiede un alto livello di destrezza che può essere impegnativo per i ricercatori. In questo protocollo miriamo a fornire informazioni pratiche e alcuni suggerimenti che possono aiutare a superare le sfide iniziali della creazione di xenografti embrionale zebrafish.
Manipolazione cellulare prima dell'iniezione Questo protocollo ottimizzato per la generazione di xenografti zebrafish con linee cellulari può essere adattato a vari tipi di cellule (tumorali) con morfologie diverse. Si consiglia che tutte le linee cellulari utilizzate per gli xenografti zebrafish siano senza micoplasma. A differenza di altre contaminazioni batteriche, la presenza di micoplasma nella coltura cellulare non genera cambiamenti che possono essere facilmente rilevati almicroscopio 22. La contaminazione da micoplasma può influenzare il potenziale di innesto delle linee cellulari, la loro sensibilità ai farmaci e la vitalità degli embrioni di zebrafish.
Sebbene le cellule possano continuare a proliferare per un periodo prolungato, il loro fenotipo e genotipo può essere soggetto a cambiamenti. È importante familiarizzare con la morfologia e il comportamento delle linee cellulari in coltura. Si consiglia di mantenere il numero di passaggi cellulari dopo lo scongelamento tra 3-12 per ottenere risultati riproducibili. Pertanto, devono essere eseguiti regolari test del micoplasma.
Le cellule devono essere nella fase di log (fase di crescita esponenziale prima di raggiungere la confluenza ~70%) il giorno dell'iniezione. Ciò consentirà un adeguato innesto e un corretto sviluppo dei tratti distintivi del tumore. Per prevenire variazioni nel fenotipo delle cellule all'interno dello xenograft, è fondamentale mantenere la confluenza per la costante di iniezione tra gli esperimenti. Il numero di cellule iniettate può essere adattato alle caratteristiche di ogni linea cellulare in quanto alcune possono richiedere densità di iniezione più elevate per prosperare negli embrioni di zebrafish.
Considerazioni sull'etichettatura delle celle Per visualizzare meglio le cellule tumorali umane per l'iniezione e l'analisi futura, le cellule tumorali possono essere etichettate con coloranti fluorescenti. A causa delle differenze nelle dimensioni cellulari, il numero totale di cellule /cm2 nelle colture aderenti varia tra le linee cellulari. Ciò influirà sull'efficacia del protocollo di colorazione e sul numero di cellule raccolte per iniezione. Le celle di grandi dimensioni che producono numeri bassi per pallone (cioè Hs578T) o crescono in cluster (ad esempio, BFTC905) richiederanno la messa in comune di diversi contenitori per un singolo esperimento. In questo caso, la colorazione delle cellule non dovrebbe essere eseguita direttamente nel pallone in quanto ciò causerà l'uso di quantità eccessive di colorante (costo elevato). D'altra parte, le cellule altamente sensibili ai cicli eccessivi di centrifugazione e quelle che producono numeri elevati per pallone (cioè HCT116) possono essere macchiate direttamente nel pallone e quindi staccate con EDTA /raschietto a celle (per ulteriori informazioni vedere tabella 1).
Quando possibile, invece di utilizzare un approccio enzimatico, utilizzare EDTA per staccare le cellule il giorno dell'iniezione, in modo che le cellule recuperino più rapidamente le loro giunzioni cellulare-cellulari e siano sottoposte a passaggi meno centrifugati. Tuttavia, se le cellule sono sensibili all'EDTA, molto aderenti o crescono in cluster - può essere applicato un metodo enzimatico. L'ottimizzazione della concentrazione ideale per iniezione e del mezzo di iniezione dipende dalle caratteristiche di ciascuna linea cellulare, per cui potrebbe essere necessario alcuni aggiustamenti(tabella 1).
Calibrazione della microiniezione Contrariamente alla consegna di oligonucleotidi o farmaci nell'embrione zebrafish, un graticule non viene utilizzato per calibrare l'ago quando si lavora con linee cellulari per xenografti. Dopo un po 'di tempo durante l'iniezione, le cellule inizieranno a intasarsi ed è necessario tagliare la punta dell'ago per aumentarne il diametro o cambiare del tutto l'ago. Questa procedura ostacola la calibrazione del graticolato.
Per risolvere questo problema, il numero di cellule erose è regolato dalla pressione di espulsione e dal tempo necessario per raggiungere una dimensione simile all'occhio dell'embrione entro 1-3 impulsi. Quindi, per controllare ulteriormente la dimensione del tumore, a 1 dpi, gli xenoinnesti vengono ordinati in base alla dimensione tumorale come mostrato nella figura 6 B-B". Come rappresentato nell'esempio della figura 6C, questo metodo di ordinamento è efficiente nel ridurre la variazione delle dimensioni del tumore: se le uniamo tutte insieme (+, ++, +++) la STEV è ~double della classe ++(~906 cellule a ~422 cellule) e la variazione del coefficiente è di ~31,9% rispetto al 14,5% della classe ++. Poiché il riferimento per l'iniezione è il volume, il numero totale di cellule varia molto tra i tipi di cella, dipendendo dalle dimensioni e dalla forma delle cellule. Ad esempio, le grandi cellule con un sacco di citoplasma come il cancro al seno Hs578T, producono tumori molto più piccoli (~ 600 cellule). Inoltre, ogni riga di cella richiede un numero diverso di celle. Ad esempio, le linee cellulari di cellule tumorali della vescica urinaria HT29 CRC e RT112 hanno dimostrato che maggiore è il numero di cellule iniettate, maggiore è la mortalità dei pesci zebra. Pertanto, è necessario un periodo di ottimizzazione durante lo sviluppo degli xenoinnesti per verificare se la linea cellulare ha effetti tossici nell'embrione o richiede densità di iniezione più elevate / inferiori.
Sito di iniezione Una delle discrepanze più comuni quando si generano xenografti di embrioni di zebrafish è il sito di iniezione. Il tuorlo è di solito il luogo di scelta per l'iniezione grazie alla sua facile accessibilità. Tuttavia, abbiamo osservato che le cellule iniettate nel tuorlo hanno una maggiore tendenza a morire. Anche se tecnicamente più difficile, si consiglia di iniettare nel PVS e il più lontano possibile dal cuore. All'interno del PVS, le cellule possono aggregare, reclutare vasi e cellule immunitarie e migrare, intravascolarizzare, estrapolare e formare micrometastasi, se mostrano caratteristiche metastatiche8,11.
Efficienza di innesto Le differenze nell'efficienza di innesto e nella dimensione del tumore tra le linee cellulari a 4 dpi sono previste a causa dei loro distinti gradi di morte /sopravvivenza / proliferazione delle cellule basali, ma anche a causa dell'immunogenicità innata che ogni linea cellulare puòmostrare 9.
metastasi La metastasi comprende una cascata multistep di eventi che possono essere divisi in due stadi arbitrari. Nella prima fase, le cellule tumorali devono staccarsi dal sito primario, migrare e invadere i tessuti adiacenti e poi intravascolarizzarsi nel flusso sanguigno. Nel secondo stadio, le cellule tumorali devono sopravvivere in circolazione, estrapolare dal sangue o dai vasi linfatici e infine colonizzare nei siti secondari23. Per distinguere tra questi eventi precominali e tardive e affrontare il potenziale / competenza delle diverse cellule tumorali per eseguire questi passaggi, abbiamo progettato un semplice test.
In generale, quando iniettate nel PVS, le cellule tumorali possono entrare direttamente in circolazione e quindi rimanere fisicamente intrappolate nel tessuto ematopoietico caudale (CHT) (regione della coda). Tuttavia, in base alle caratteristiche di ogni cellula tumorale - abbiamo visto che alcune cellule tumorali rimangono al CHT 4 dpi e sono in grado di formare micrometastasi mentre altre cellule tumorali scompaiono (cancellate dopo essere state catturate nella CHT).
Pertanto, confrontando l'efficienza della micrometastasi (a 4 dpi) quando le cellule sono state poste direttamente in circolazione - CIRC (le cellule devono solo passare attraverso i passaggi tardivi della metastasi) rispetto a quando no - NO CIRC (le cellule devono passare attraverso passaggi precoci e tardivi per essere in grado di formare una micrometastasi) possiamo valutare il loro potenziale metastatico precoce o tardivo. Abbiamo osservato cellule tumorali che possono formare efficacemente micrometastasi nella CHT in entrambi i gruppi (CIRC e NO CIRC), suggerendo che queste cellule hanno la capacità di subire tutti i passaggi della cascata metastatica (SW480 e MDA-MB-468 per esempio)8,11. Al contrario, altre cellule tumorali hanno un potenziale metastatico molto basso in entrambi i gruppi, quasi mai facendo micrometastasi, anche se iniettate in circolazione (cioè, visibili nella CHT a 24 hpi, ma a 4 dpi non ci sono più, Hs578T peresempio) 8. Tuttavia, abbiamo chiaramente trovato un altro gruppo - uno che è in grado di formare micrometastasi solo quando iniettato in circolazione (possiamo osservare solo la micrometastasi nel gruppo CIRC). Ciò suggerisce che queste cellule hanno una bassa efficienza nell'eseguire i primi passi della cascata metastatica ma d'altra parte sono in grado di sopravvivere in circolazione, estrapolare e colonizzare un sito lontano.
Immunostaining e imaging Prima della fissazione, questo protocollo di iniezione può essere utilizzato per altri approcci di imaging dal vivo come microscopia DIC (Live Differential Interference Contrast), microscopia a disco rotante, imaging confocale vivo ad alta risoluzione e microscopia a fogli luminosi, ecc.
Le cellule morte e i detriti cellulari appaiono luminosi se osservati attraverso lo stereomicroscopio fluorescente e possono essere scambiati per cellule vive, specialmente se lo scopo dello studio è valutare il potenziale metastatico delle linee cellulari. Vorremmo sottolineare l'importanza di eseguire l'imaging confocale con specifici marcatori di vitalità e DAPI per valutare lo stato di sopravvivenza del tumore e della micrometastasi. Inoltre, è fondamentale utilizzare anticorpi umani specifici per rilevare cellule umane come i mitocondri anti-umani o l'HLA anti-umano. Quando si implementa il protocollo, addestrare gli occhi dello sperimentatore confrontando la colorazione nello stereomicroscopio con le immagini confocali. Dopo un po 'di tempo, gli sperimentatori possono distinguere chiaramente i detriti dalle cellule vive nello stereomicroscopio fluorescente.
Sebbene altri metodi per quantificare il carico tumorale come l'intera area di fluorescenza siano ampiamente utilizzati, si consiglia di eseguire l'immunostaining a montaggio intero e l'imaging confocale come metodo più accurato. Non solo l'efficienza della colorazione dei coloranti lipofili è molto variabile (cioè, alcune cellule sono molto ben macchiate mentre altre non sono - probabilmente a causa del contenuto lipidico delle loro membrane), ma anche molte volte i coloranti lipofili formano aggregati e le cellule morte tendono ad essere più luminose - creando diversi artefatti che possono essere scambiati per cellule vive.
Le cellule possono essere trasdotto con proteine fluorescenti per aiutare nel loro tracciamento e saltare l'etichettatura cellulare. Tuttavia, assicurarsi che le cellule trasdutte e non trasdutte producano gli stessi risultati negli xenografti zebrafish.
Inoltre, i macrofagi possono fagocitare questi detriti cellulari fluorescenti diventando marcati fluorescentmente e migrano, generando false cellule metastatiche positive. Pertanto, raccomandiamo una serie di strumenti analitici, che ovviamente possono essere estesi a molte altre letture per un'interpretazione più accurata del comportamento tumorale:
<ul style="list-style-type: square;"><li>
Proliferazione - quantificazione di figure mitotiche con anticorpo DAPI o anti-pHH3Ser10 (Merck Millipore Cat. #06-570),</li>
	<li>
Morte cellulare per apoptosi- Anticorpo antiattiva Caspase3Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) o equivalente,</li>
	<li>
Dimensione tumorale - Conteggio DAPI - le cellule tumorali umane mostrano un'organizzazione cromatica molto distinta, quindi si distinguono facilmente dalle cellule zebrafish ed è sempre possibile ricontrollare con il colorante (quando si allena l'occhio),</li>
	<li>
Per studi metastatici- per rilevare inequivocabilmente le cellule umane, - HLA anti-umano (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), mitocondri anti-umani (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).</li>
</ul>Per un'acquisizione confocale con intervallo di 5 μm tra fette nella pila Z delle cellule tumorali di controllo HCT116 (dimensione nucleare media di 10-12 μm di diametro) con controsottenimento DAPI, abbiamo osservato che ~50% delle cellule sono condivise tra due fette consecutive. Pertanto, se ogni fetta viene conteggiata, c'è un alto rischio di contare le stesse celle due volte. Andare avanti e indietro tra una sezione e l'altra per evitare problemi di quantificazione si traduce in una tecnica che richiede tempo e soggetta a errori. Per facilitare la quantificazione del numero totale di cellule e consentire una maggiore riproducibilità tra i ricercatori, abbiamo creato la formula delle dimensioni tumorali precedentemente descritta in questo protocollo8.
Abbiamo incluso un numero di correzione (1.5) per tenere conto delle celle ~50% condivise tra le sezioni. Abbiamo scoperto che l'errore medio del conteggio manuale dell'intero tumore tra i ricercatori era del 20%. Due ricercatori che hanno usato la formula hanno avuto un errore del 2%. L'uso di questa formula ha un tasso di precisione del 93% e un tasso di riproducibilità del 98%. Abbiamo anche testato metodi automatizzati, ma hanno dimostrato un errore superiore al 50% causato dalle impostazioni di soglia.
A causa delle caratteristiche delle cellule apoptotiche, la quantificazione delle cellule Caspasi 3 attivate è più difficile. Per ridurre il numero di errori e variazioni nei risultati, si consiglia di contare il controllo e i campioni sperimentali dallo stesso ricercatore. Inoltre, quando si impara questa tecnica, un nuovo ricercatore deve contare immagini che erano già state quantificate da ricercatori più esperti per confrontare i risultati e allenarsi.
La lunghezza del saggio può essere estesa se necessario. Tuttavia, è importante considerare che le larve di zebrafish richiedono un'alimentazione viva a partire da ~ 7 giorni dopo la fecondazione (5 giorni dopo l'iniezione). Inoltre, le linee guida e i regolamenti sul benessere degli animali applicati alle larve di età superiore a 6 giorni dopo la fecondazione possono variare.
Questo protocollo fornisce strumenti utili per consentire a un singolo ricercatore di iniettare circa ~ 200-300 larve di zebrafish all'ora; e i risultati per il saggio completo, compresa l'analisi e l'interpretazione statistica, ottenuti in tre settimane. Speriamo che questo protocollo possa aiutare i ricercatori a diventare esperti nella generazione di xenografti zebrafish. Non è facile; devi esercitarti ma ci arrivarai. Buona Fortuna!

Zebrafish (Danio rerio) sta emergendo come un potente organismo modello di vertebrato per studiare lo sviluppo e le malattie. Zebrafish condivide caratteristiche genetiche altamente conservate (~70% omologia genetica e ~84% geni correlati alle malattie) e caratteristiche morfologiche di base degli organicon l'uomo 1,2. Questa conservazione consente l'uso di zebrafish per modellare diverse malattie umane, tra cui ilcancro 3,4.
La manipolazione e la manutenzione del pesce zebra è molto più facile ed economica rispetto ai topi a causa delle loro piccole dimensioni, dell'elevata fecondità tutto l'anno e della fecondazioneesterna 3,5. Gli embrioni di zebrafish non richiedono un'alimentazione dal vivo durante i loro primi 5-7 giorni di vita e sono stati utilizzati come modello efficace per lo sviluppo, l'infezione eil cancro 1,4,6,7. Gli embrioni di zebrafish si schiudono a 48 ore dopo la fecondazione (HPF) e sono animali a nuoto libero con tutti gli organi formati, un cuore pulsante e un sistema circolatorio funzionale, fegato, cervello, midollo renale,ecc. 1,3. Inoltre, in questa fase di sviluppo è in gioco solo l'immunità innata, l'immunità adattiva è ancora in fase di sviluppo, consentendo un innesto generale ed efficiente delle cellule umane senza bisogno di utilizzare mutanti immunocompro compromessi7,8. Tuttavia, è importante notare che non tutte le cellule umane si innestoallo stesso modo 9 e che, ad esempio, per le cellule leucemie è stato dimostrato che i fagociti (neutrofili e macrofagi) devono essere esauriti per un efficiente innesto10.
La trattabilità genetica del pesce zebra e la trasparenza ottica dei suoi primi stadi embrionali consentono l'imaging intravitale a singola cellula ad alta risoluzione e quindi, per la creazione di tecniche di imaging all'avanguardia in diversi campi della biologia. Inoltre, nel contesto del cancro, queste caratteristiche sono utili per studi in tempo reale delle prime fasi delle interazioni ospite-tumore, come lo studio del potenziale angiogenico e metastatico, nonché delle interazioni con il sistema immunitario innato8,9,11,12,13.
Sebbene nel breve saggio xenograft non ci sia tempo per l'"evoluzione" metastatica- è possibile analizzare la capacità metastatica delle cellule tumorali (cioè la loro efficienza di passare attraverso passaggi metastatici come invasione, intravasazione, sopravvivenza in circolazione, estravasione e colonizzazione, e quindi studiare questi processi in vivo e in tempo reale8,11,13,14).
Le caratteristiche del suo ciclo vitale posizionare il pesce zebra come modello unico per la medicina personalizzata nel cancro. I saggi possono essere eseguiti in un arco di tempo più breve e i risultati ottenuti inpoche settimane 7,8,9,11,12,15,16. La sedano e la fattibilità di questi saggi offrono a medici e ricercatori la possibilità di ottenere risultati tras tras traslazione che possono essere utili per i pazienti oncologici, per i quali il tempo è un bisogno essenziale.
Nonostante i crescenti tentativi di generare xenografti embrionale zebrafish di successo, c'è ancora bisogno della standardizzazione della procedura di iniezione e della valutazione della vitalità cellulare e del comportamento tumorale dopo l'iniezione.
In questo protocollo forniamo ai ricercatori una guida dettagliata e chiara per l'iniezione di linee cellulari tumorali umane negli embrioni di zebrafish e la successiva fissazione, immunostaining, imaging e quantificazione del comportamento delle cellule tumorali.

<table><tbody><tr><td>Agar per batteriologia</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td>Piastra di agar</td></tr><tr><td>anti-Caspasi3Asp175 (Coniglio monoclonale)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>9661</td><td>Anticorpo primario per la colorazione immunologica a montatura intera (Diluizione 1:100)</td></tr><tr><td>HLA anti-umano (monoclonale di coniglio)</td><td>Abcam EP1395Y</td><td>ab52922</td><td>Anticorpo primario per la colorazione immunologica a montatura intera (Diluizione 1:100)</td></tr><tr><td>anti- 488 (Coniglio monoclonale)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35552</td><td>Anticorpo secondario per immunocolorazione a montatura intera (Diluizione 1:200)</td></tr><tr><td>anti- 594 (Coniglio monoclonale)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35560</td><td>Anticorpo secondario per immunocolorazione a montatura intera (Diluizione 1:200)</td></tr><tr><td>CellTracker Colorante rosso intenso</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34565</td><td>Colorante lipofilo (Diluizione 1:1000)</td></tr><tr><td>CellTracker Colorante CMFDA verde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Colorante lipofilo (diluizione 1:1000)</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga conica 50mL</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga conica 15mL</td><td>VWR</td><td>525-0604</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>Colorante per contropipette nucleari e cromosomiche</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette basato su laser P-2000</td><td>Micropipetta Sutter-Instrument</td><td></td><td> Estrattore</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga 1,5mL</td><td>Abdos</td><td>P10202</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio, bordo tagliato</td><td>RS France</td><td>BPB016</td><td>Vetrini per il montaggio</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Mezzo di montaggio</td></tr><tr><td>Pneumatico Picopump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>Microiniettore</td></tr><tr><td>Vetri di copertura rettangolari, Menzel Gl&auml; ser</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>631-9430</td><td>Vetrini coprioggetti per il montaggio</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>Piastra agar</td></tr><tr><td>Capillari in vetro a parete sottile</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>Capillari borosilicati</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605036</td><td>Soluzione di distacco enzimatico</td></tr><tr><td>Vaselina Vaselina</td><td></td><td></td><td> sigillante</td></tr><tr><td>Vybrant CM-DiI Colorante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22888</td><td>Colorante lipofilo (Diluizione 1:1000)</td></tr><tr><td>Vybrant DiO Soluzione per la marcatura cellulare</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td>Colorante lipofilo (Diluizione 1:1000)</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Zoom.V16 per Biologia</td><td>ZEISS</td><td></td><td>&nbsp; Microscopio zoom stereo a fluorescenza</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710</td><td>Microscopio confocale</td> <td>ZEISS</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Gli xenografti larvali zebrafish sono ampiamente utilizzati per la ricerca sul cancro per eseguire studi in vivo e in tempo reale sul cancro umano. La possibilità di visualizzare rapidamente la risposta alle terapie anti-cancro (chemio, radioterapia e biologia), angiogenesi e metastasi con risoluzione a singola cellula, pone il modello xenograft zebrafish come la scelta migliore per sviluppare studi preclinici.

Il saggio di xenograft larvale zebrafish presenta diversi vantaggi sperimentali rispetto ad altri modelli, ma probabilmente il più sorprendente è la riduzione della scala delle dimensioni e di conseguenza del tempo. Questa riduzione della scala consente l'imaging a singola cellula, l'uso di un numero relativamente basso di cellule umane (compatibili con le biopsie), screening farmacologici a media-alta produttività, ma soprattutto consente una significativa riduzione del tempo del saggio. Tutti questi vantaggi rendono il saggio di xenograft zebrafish estremamente attraente per le future applicazioni di medicina personalizzata.

Molti protocolli di xenoinnesto zebrafish sono stati sviluppati con un'ampia varietà di tumori umani; tuttavia, manca ancora un protocollo generale e standardizzato per generare in modo efficiente xenografti larvali di zebrafish. Qui forniamo un protocollo passo-passo, con suggerimenti per generare xenografti e linee guida per l'analisi del comportamento tumorale, l'immunofluorescenza a montaggio intero e la quantificazione dell'imaging confocale.

Qui, forniamo un protocollo passo-passo, con suggerimenti per generare xenografti e linee guida per l'analisi del comportamento tumorale, l'immunofluorescenza a montaggio intero e la quantificazione dell'imaging confocale.

Generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Gli xenografti Zebrafish sono ampiamente utilizzati per la ricerca sul cancro. Puoi prendere cellule tumorali umane e iniettarlo in piccole larve zebrafish, o anche negli adulti. Qui, quello che stiamo presentando è un protocollo passo-passo del modello larva, in cui possiamo studiare diversi segni distintivi del cancro umano in un animale vivente.Si può studiare la proliferazione, si può studiare l'angiogenesi, si può studiare la metastasi, e anche le interazioni all'interno del microambiente tumorale. E un grande vantaggio è che si può studiare questo in un lasso di tempo molto breve. Solo quattro giorni, per esempio.Un altro grande vantaggio è che puoi studiarlo dal vivo con una risoluzione a cella singola, usando un microscopio confocale o un microscopio a fogli luce. È possibile studiare come le cellule migrano, come le cellule interagiscono tra loro o anche come parlano tra loro. Quindi è un modello davvero potente per studiare la biologia del cancro.Gli xenograft Zebrafish possono essere utilizzati per studiare la risposta alle terapie anti-cancro, come la chemioterapia, la radioterapia o persino terapie mirate con anticorpi. E infine, anche questo protocollo può essere adattato per usare cellule derivate dal paziente da un campione chirurgico, o anche da biopsie, e quindi generare gli avatar zebrafish. Impostazione per l'iniezione.Due settimane prima dell'iniezione, espandere le cellule in coltura. Inizia con le cellule in eccesso e il pesce in eccesso fino a diventare abile con la tecnica, poiché molte cellule e pesci andranno persi durante l'allenamento. La tabella uno del PDF di accompagnamento ha una guida dettagliata delle percentuali ottimali di confluenza in vitro per l'iniezione di diverse linee cellulari.Tre giorni prima dell'iniezione, attraversare il pesce zebra dello sfondo desiderato. 24 ore prima dell'iniezione. Pulire le piastre embrionale zebrafish.Scartare tutti gli embrioni morti e non sviluppati e rinfrescare il mezzo E3. Nella stanza delle impostazioni cultura delle celle, scartare il mezzo di coltura cellulare. Lavare una volta con PBS 1X per rimuovere le cellule morte e aggiungere mezzo fresco.Preparare gli strumenti per la procedura di iniezione, come aghi di microiniezione, piastre di agarosio e forcine per allineare gli embrioni per l'iniezione. Per la preparazione del piatto, versare uno strato di 2%agarosio sciolto nel coperchio di una piastra di Petri pulita. Lascia che polimerizzi e con l'aiuto di un righello, crea da tre a quattro linee di agarosio dritte per l'allineamento degli embrioni.Giorno dell'iniezione. Separare gli embrioni nati dalle uova non odiate. L'aggiunta di Pronasi al mezzo embrione in questa fase può aumentare la schiusa.Posizionare gli embrioni nell'incubatrice a 28 gradi Celsius fino all'iniezione. Etichettatura cellulare per iniezione. Per facilitare la definizione di una tecnica di etichettatura delle celle riproducibile, controllare le tabelle uno e due del protocollo scritto per la compilazione di un elenco di linee cellulari e di diverse soluzioni di etichettatura.Rimuovere il mezzo di coltura cellulare e lavare il pallone due volte con PBS 1X. Etichettare le cellule con un colorante lipofilo, evitando l'esposizione alla luce, e incubare il pallone a 37 gradi. È inoltre possibile scegliere di etichettare le celle in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml al momento del distacco.Rimuovere la soluzione di etichettatura cellulare e lavare le celle con PBS 1X per esezione del colorante in eccesso. Aggiungere l'agente di distacco corrispondente e incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Facilitare il processo di distacco spazzolando il pallone con un raschietto sterile e raccogliere le cellule con una pipetta sierologica.Trasferire le celle in tubi di microcentrifugo da 1,5 ml e centrifuga. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet con il mezzo di coltura cellulare. Quantificare la vitalità cellulare usando una camera Neubauer con esclusione blu tripano o altro metodo di scelta.Centrifugare e sospendere di nuovo le cellule nel mezzo di iniezione. Le concentrazioni raccomandate di cellule in mezzo possono essere trovate nella tabella uno del manoscritto. Da questo punto in poi, le cellule devono essere tenute sul ghiaccio.Procedure di iniezione. Anestetizzare gli embrioni in tricaina 1X per 5 minuti. Quindi, trasferire una piccola quantità di embrioni anestetizzati su una piastra di agarosio e allinearli con l'aiuto di un anello di forcine.Assicurarsi di mantenere la distanza tra gli embrioni. Soprattutto tra il tuorlo di uno e la testa del prossimo. Per prevenire la mortalità, assicurarsi che gli embrioni allineati non si asciughino nella piastra di agarosio aggiungendo con cura una o tre gocce di soluzione di tricaina 1X alla piastra.Toccare leggermente il tubo di microcentrifugo per sospendere di nuovo le celle. Ricaricare l'ago di iniezione con una sospensione cellulare utilizzando una punta microloader, evitando bolle d'aria, in quanto possono compromettere l'integrità degli embrioni. Aprire la valvola di pressione dell'aria, impostare il microiniettore e posizionare con cura l'ago di microiniezione nel supporto.Tagliare l'ago di microiniezione vicino alla punta. Perforare con cura il tuorlo dell'embrione, abbassando l'angolo dell'ago e spingendo cautamente fino a quando la punta dell'ago raggiunge lo spazio perivitellino. Una volta che la punta è nello spazio perivitellino, iniettare le cellule.Cerca di iniettare un volume di cellule simile alle dimensioni dell'occhio dell'embrione e, per quanto possibile, dal cuore per prevenire l'edema cardiaco. Regolare la pressione del microiniettore, se necessario. Trasferire gli embrioni iniettati in una piastra di Petri pulita con soluzione di tricaina 1X e lasciarli riposare per cinque o 10 minuti.Questo darà alla ferita il tempo di chiudere. Rimuovere la soluzione di tricaina 1X e aggiungere un mezzo E3 fresco. Quindi, incubare gli embrioni a 34 gradi Celsius.Questa temperatura consentirà la sopravvivenza sia degli embrioni di zebrafish che delle cellule tumorali umane. Saggio metastatico. Se volete studiare il potenziale metastatico delle vostre linee cellulari, a circa un'ora dopo l'iniezione, vengono proiettati gli embrioni iniettati su uno stereomicroscopio a fluorescenza e ordinarli in due gruppi in base all'assenza o alla presenza di cellule tumorali in circolazione.Un giorno dopo l'iniezione. Su uno stereomicroscopio a fluorescenza, analizzare attentamente ogni embrione e selezionare quelli con tumori correttamente iniettati. Ordinare gli xenoinnesti selezionati in base alle dimensioni del tumore.Utilizzare la dimensione dell'occhio per il confronto. Scartare tutti gli embrioni con morfologia anomala, edema cardiaco o tuorlo, xenoinnesti con pochissime cellule tumorali o quelli con cellule tumorali solo all'interno del tuorlo. Distribuire gli xenoinnesti in base al layout sperimentale desiderato e iniziare il test del farmaco.Sostituire i farmaci e E3 media ogni giorno. Incubare gli xenoinnesti, mantenendo la temperatura di 34 gradi Celsius fino alla fine del saggio. Quattro giorni dopo l'iniezione.L'ultimo giorno del saggio, anestetizza gli xenoinnesti con la soluzione tricaina 1X e allineali attentamente sulla piastra di agar. Scartare eventuali xenoinnesti morti o gonfi. Questi xenoinnesti non sono considerati per la quantificazione dell'innesto.Su uno stereomicroscopio a fluorescenza, analizzare attentamente ogni xenograft e valutare l'assenza o la presenza di tumori nello spazio perivitellino. Secondo l'impostazione sperimentale, selezionare gli xenoinnesti di interesse ed eutanasiarli con tricaina 25X. Fissarli in formaldeide al 4% per almeno 4 ore a temperatura ambiente per procedere con l'immunosocienza.Altrimenti, conservare durante la notte a quattro gradi Celsius e il giorno successivo sostituire la formaldeide con il 100% di metanolo. Gli xenoinnesti fissati al 100% di metanolo possono essere conservati a 20 gradi indefinitamente. Immunostaining a montaggio intero per l'imaging confocale.L'intera tecnica di immunofluorescenza del supporto richiede tre giorni, così ripartiti. Il primo giorno è per la permeabilizzazione degli xenoinnesti e l'incubazione degli anticorpi primari. Il secondo giorno, per il lavaggio e l'incubazione secondaria degli anticorpi.E il terzo giorno, per il lavaggio, la fissazione degli xenoinnesti e lo stoccaggio nel mezzo di montaggio. Maggiori dettagli di questa procedura sono disponibili nel PDF di accompagnamento. Montaggio di xenoinnesti.Sigillare i bordi di un coperchio scivolare con vaselina o grasso siliconico, in modo che il mezzo di montaggio non perda. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire gli xenoinnesti allo scivolo del coperchio. Allinearli con cura con un tornante.Aggiungere il supporto di montaggio a un altro coperchio. Unire con cura entrambi i coperchi e posizionarli sopra una diapositiva del microscopio per consentire una manipolazione più semplice. Imaging confocale.Una lente obiettivo ad immersione 25X apocromatica con correzione dell'acqua è ottimale per l'imaging di tumori con una risoluzione a singola cellula. Acquisire i campioni utilizzando la funzione Z-Stack con un intervallo di cinque micron tra ogni fetta. Aprire i dati grezzi nel software Fiji.Selezionare tre fette rappresentative del tumore dall'alto, dal centro e dal basso, per z-stack, per xenograft. Aprire il plug-in Contatore celle dal software Fiji. Nello strumento Contatore celle fare clic su Inizializza, selezionare un tipo di contatore e fare clic sull'immagine per avviare manualmente la modalità di conteggio.Per ogni clic, il contatore chiede quante celle vengono conteggiate. Per ottenere il numero totale di cellule nel tumore, utilizzare la seguente formula. Per valutare il numero totale o la percentuale di marcatori, come cellule immunitarie, figure mitotiche, caspasi attivata, tra gli altri, quantificare manualmente le cellule positive all'etichettatura specifica, al marcatore o al transgene di interesse lungo tutte le fette dello z-stack con il plug-in Contatore di cellule.Tenere presente che alcune celle si trovano tra due sezioni. Andare avanti e indietro nello stack Z per assicurarsi che nessuna cella venga conteggiata due volte. Risultati rappresentativi.Gli xenograft della linea di cellule tumorali colorettali HCT 116 sono stati generati come descritto nel protocollo. Gli xenoinnesti sono stati distribuiti casualmente in controlli non trattati e chemioterapia FOLFIRI. L'immunofluorescenza è stata eseguita per rilevare le cellule apoptotiche, utilizzando anticorpi anti-cleaved caspasi-3 e DAPI per la controsottenimento nucleico.La quantificazione dell'indice mitotico, dell'apoptosi e delle dimensioni del tumore, ha rivelato che FOLFIRI induce una significativa diminuzione della mitosi e una significativa induzione dell'apoptosi, accompagnata da una riduzione del 54% delle dimensioni del tumore. Queste caratteristiche sono utili negli schermi dei farmaci fenotipici ad alta produttività, nonché per testare gli effetti intrinseci e fisiologici cellulari di diversi trattamenti oncologici in un breve lasso di tempo. Un altro grande vantaggio del modello di xenoinnesto zebrafish è che è possibile studiare le interazioni di diverse cellule tumorali e analizzare come ogni tipo di cellula può influenzare il comportamento dell'altra.Diverse cellule tumorali umane, cloni diversi dallo stesso tumore, o da tumori diversi, possono essere co-iniettati. In questo esempio, due linee cellulari di cancro colorettale derivate dallo stesso paziente sono state etichettate con diversi coloranti lipofili e mescolate in un rapporto uno a uno per iniezione. Speriamo che questo protocollo possa aiutare i ricercatori a diventare veri esperti nella generazione di xenografti zebrafish.Non è facile. Devi esercitarti, esercitarti. Non arrenderti.Sono sicuro che ci andrai. Buona Fortuna.

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Generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale

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