Name: Dissezione del sacco endolinfatico da topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: Impara la microdissezione del sacco endolinfatico da topi per studi di biologia dell'orecchio interno. Questo metodo consente analisi molecolari e cellulari dettagliate su modelli murini.

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<ol><li>Dror, A. A., Brownstein, Z., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+human+and+mouse+genetics+reveals+pendrin+function+in+hearing+and+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Integration of human and mouse genetics reveals pendrin function in hearing and deafness.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 28 (3), 535-544 (2011).</li>
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<li>Gurkov, R., Pyyko, I., Zou, J., Kentala, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+Meniere%27s+disease%3F+A+contemporary+re-evaluation+of+endolymphatic+hydrops%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">What is Meniere's disease? A contemporary re-evaluation of endolymphatic hydrops.</a> Journal of Neurology. 263, Suppl 1 71-81 (2016).</li>
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<li>Miyashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+FXYD6+in+the+endolymphatic+sac+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of FXYD6 in the endolymphatic sac epithelia.</a> Neuroscience Letters. 513 (1), 47-50 (2012).</li>
<li>Royaux, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+functional+studies+of+pendrin+in+the+mouse+inner+ear+provide+insight+about+the+etiology+of+deafness+in+pendred+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Localization and functional studies of pendrin in the mouse inner ear provide insight about the etiology of deafness in pendred syndrome.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 4 (3), 394-404 (2003).</li>
<li>Kim, H. M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+stretching+and+luminal+acidification+lead+to+a+retarded+development+of+stria+vascularis+and+deafness+in+mice+lacking+pendrin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell stretching and luminal acidification lead to a retarded development of stria vascularis and deafness in mice lacking pendrin.</a> PLoS One. 6 (3), 17949(2011).</li>
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<li>Honda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+underlying+fluid+absorption+by+the+developing+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture underlying fluid absorption by the developing inner ear.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td>Crystalgen</td><td>221-057</td><td></td></tr><tr><td>Siringa TUBERCULIN da 1 mL con 27G x 13mm</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Piastra in vetro spot a 9 pozzetti</td><td>Pyrex</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-falloidina coniugata</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Artery&nbsp; Forbici&nbsp;- Punta a sfera</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera per catturare immagini in luce incidente</td><td>Leica</td><td>DFC 495</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera per catturare immagini fluorescenti</td><td>Leica</td><td>DFC 7000 GT</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga 15 mL</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi/Dispasi</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>Corning</td><td>2940-223</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forcipe</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>per le scienze fini Strumenti</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinze</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Bonn extra fini</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Alternativa: Forbici per micro dissezione extra fine; Diritto; punte acuminate; Lunghezza lama 20 mm; 3 1/2" Lunghezza totale</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio Alexa Fluor 488-coniugato anticorpo secondario</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>MicroSlides Superfrost</td><td>VWR</td><td>48311-702</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale, ad esempio Mini Shaker</td><td>Daigger</td><td>980275</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA) 16% Soluzione acquosa</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (10X) pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant con DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td></td> Anticorpi <td></td><td>anti-Pendrin di coniglio</td><td>RRID:AB_2713943, PB826 (Choi et al., 2011)</td></tr><tr><td>Ring Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore a dondolo, ad esempio GyroMini</td><td>Labnet</td><td>S0500</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio dotato di obiettivo PlanApo 1.0x</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame a bordo singolo in acciaio inossidabile, .009"</td><td>GEM Personna</td><td>62-0176</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Smalto</td><td></td><td></td> trasparente<td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS Organics</td><td>32737-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione del sacco endolinfatico da topi

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

Ogni fase di questa microdissezione di un sacco endolinfatico wild type da un topo postnatale del giorno 5 (P5) è dettagliata nel video associato e le istantanee delle fasi chiave di questa dissezione e dell'apertura del sacco endolinfatico sono presentate nella Figura 1 e nella Figura 2. 
I risultati rappresentativi delle dissezioni del sacco endolinfatico con fluorescenza di tdTomato al giorno embrionale 16.5 (E16.5), P5 e P30, seguendo questo protocollo, sono presentati nella Figura 3 e nella Figura 1 e nella Figura 2 supplementare. Utilizzando un microscopio da dissezione con fluorescenza, il sacco endolinfatico può essere facilmente visualizzato nel cranio dopo la rimozione del cervello nei topi portatori del transgene Tg(ATP6V1B1-Cre) in presenza del reporter dell'espressione di Cre: Ai9 (LSL-RCL-tdT) (vedi Figura 3A-B e Figura supplementare 1 per le immagini catturate in luce incidente e fluorescenza tdTomato del sacco endolinfatico in diverse fasi della dissezione). In questi topi, Cre è espresso come un mosaico nelle cellule lungo tutto il sacco endolinfatico e il dotto (Figura 3, vedere anche la Figura 2 supplementare per la visualizzazione del sacco endolinfatico con rispetto a senza reporter fluorescente). Sebbene l'espressione di questo reporter non sia specifica per l'espressione endogena di Atp6v1b1, che è limitata alle cellule ricche di mitocondri del sacco endolinfatico16, uno dei due tipi cellulari di questo epitelio (Figura 5E), è un aiuto utile per identificare e sezionare il sacco endolinfatico.
Le orecchie interne sezionate da un modello murino per l'allargamento dell'acquedotto vestibolare sono presentate nella Figura 4. Rispetto ai compagni di cucciolata di controllo, le sacche endolinfatiche e i dotti dei topi carenti di SLC26A4 (pendrin) sono ingranditi.
Le immagini rappresentative dell'immunoistochimica del sacco endolinfatico intatto con e senza tessuto congiuntivo sono mostrate nella Figura 5. Vengono presentati anche i risultati dell'immunoistochimica del sacco endolinfatico aperto di un topo wild type P5 (Figura 5F-G). Il sacco endolinfatico è composto da un singolo strato di epitelio piegato in una struttura a forma di sacca, contenente nel suo lume endolinfa. Questo epitelio è costituito da due tipi di cellule, cellule ricche di mitocondri e cellule ricche di ribosomi (Figura 5E). Un sacco endolinfatico a montaggio intero sarà appiattito perché l'endolinfa non è più presente. Il sacco apparirà come due strati intrecciati di epitelio, rendendo difficile determinare la localizzazione subcellulare delle proteine espresse in questo epitelio. Aprendo il sacco endolinfatico, l'epitelio a singolo strato può essere facilmente visualizzato e la distribuzione relativa delle proteine di interesse, rispetto al lume del sacco endolinfatico, può essere determinata in modo più definitivo. Un potenziale arricchimento apicale (luminale, dove si troverebbe l'endolinfa) rispetto a quello basale di queste proteine può essere determinato in modo più accurato. Ad esempio, SLC26A4 è arricchito sul lato apicale delle cellule ricche di mitocondri (Figura 5F).
<img alt="Diagrammi di dissezione dell'orecchio interno, mappatura dettagliata della coclea e del nervo, impostazione dello studio anatomico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1. Dissezione a montaggio intero del sacco endolinfatico di un topo wild type al 5° giorno postnatale (P5). (A) Schema del labirinto membranoso di un orecchio interno di topo sviluppato (a destra). Sono indicate la posizione del sacco endolinfatico e la coclea e le strutture vestibolari. Questa cifra è stata modificata da Honda et al.16. (B) Sezione medio-sagittale che mostra l'emicranio sinistro. La posizione del sacco endolinfatico è indicata (freccia). (O, occipitale; F, frontale) (C) Capsula otica insieme alla parte squamosa dell'osso temporale. (D) Punti di riferimento importanti sovrapposti al riquadro tratteggiato nel pannello C. (ES, sacco endolinfatico; ED, dotto endolinfatico; VA, acquedotto vestibolare; ASC, canale semicircolare anteriore; PSC, canale semicircolare posteriore; CC, cru comuni; SS, seno sigmoideo) (E) Illustrazione schematica della sezione trasversale insieme alla linea bianca continua sul pannello D attraverso il sacco endolinfatico. Il lato prossimale del sacco endolinfatico è coperto da un canale osseo chiamato acquedotto vestibolare, insieme al dotto endolinfatico. Nella parte distale, il sacco endolinfatico, circondato da tessuto congiuntivo (CT), si estende e sporge verso l'esterno del labirinto osseo ed è inserito tra la dura madre (DM) e il seno sigmoideo con la parte squamosa dell'osso temporale (TB). (F) Un ago sottile viene utilizzato per tagliare intorno al sacco endolinfatico (seguendo le linee gialle tratteggiate sul pannello D). (G) Il preparato viene accuratamente rimosso dall'osso temporale tenendo il tessuto nella posizione indicata dall'asterisco (*, mostrato anche nel pannello E) e staccandolo. (H) Un sacco endolinfatico intero isolato con tessuti circostanti. (I) Versione schematica di questo sacco endolinfatico isolato con i tessuti circostanti. (J) Sacco endolinfatico isolato senza tessuti circostanti. Barre della scala: 2 mm (B), 1 mm (J). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Serie di dissezioni, esposizione dell'esofago, diagrammi anatomici, campioni di tessuto, strumenti chirurgici utilizzati." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2. Dissezione del sacco endolinfatico aperto di un topo wild type P5. (A) Al punto 2.4, la linea di incisione sull'acquedotto vestibolare è posizionata leggermente anteriormente (linea tratteggiata rossa) per praticare un'incisione nel lume del sacco endolinfatico. (B) Tenere la parte del gambo del preparato, inserire un ago calibro 27 nel lume e spostarlo per tagliare il sacco endolinfatico in due fogli. (C) Illustrazione schematica del pannello B. (D) Tenere il bordo di ogni foglio con una pinza e separarli l'uno dall'altro. (E) Illustrazione schematica del pannello D. (F) Il sacco endolinfatico è separato in due fogli, compreso l'epitelio e i tessuti circostanti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Sviluppo del cervello del topo, microscopia a fluorescenza, stadi da E16.5 a P30, imaging del tessuto neurale." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3. Dissezione di R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/sacco endolinfatico di topo Mn a E16.5, P5 e P30. Tutte le immagini presentate mostrano la fluorescenza di tdTomato ottenuta utilizzando uno stereomicroscopio con un obiettivo 1 x equipaggiato per la rilevazione della fluorescenza di tdTomato. (A, B) Sezione sagittale media del cranio di un E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn prima (A) e dopo (B) rimozione del semicervello. tdLa fluorescenza del pomodoro delinea la posizione dell'orecchio interno. Il sacco endolinfatico è facilmente visibile anche senza dissezione (punta di freccia). (C, E, G) Orecchie interne isolate da topi E16.5, P5 e P30, rispettivamente. (D, F e H) Immagini con ingrandimento più elevato delle sacche e dei dotti endolinfatici microdissezionati corrispondenti. A P30, il dotto endolinfatico è incapsulato nell'osso, rendendolo particolarmente difficile da isolare. Barre della scala: 2 mm (A, B, C, E, G), 500 μm (D, F, H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Due sezioni dell'orecchio interno, Slc26a4+/− e Slc26a4−/-, mostrate nell'immagine del microscopio per lo studio genetico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4. Anatomia macroscopica della capsula otica con un sacco endolinfatico allargato. Orecchie interne di Slc26a4+/- (a sinistra) e Slc26a4-/- (a destra) di cucciolate di topo a P105. L'acquedotto vestibolare e il sacco e il dotto endolinfatico (linee tratteggiate nere) sono ingranditi nel topo Slc26a4-/- rispetto a quelli di un topo Slc26a4+/- . Barra della scala: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Saggio di immunofluorescenza, proteine SLC26A4 e ACTB, diagramma cellulare epiteliale, risultati della microscopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5. SLC26A4 espressione di cellule ricche di mitocondri nell'epitelio del sacco endolinfatico a E16.5 e P5. (A, B) Sacco endolinfatico isolato da topo E16.5 marcato con anticorpo anti-SLC26A4 (verde) e falloidina che marcano β-actina (ACTB, rosso). (C) Un'immagine a basso ingrandimento del sacco endolinfatico aperto da un topo P5 marcato con un anticorpo anti-SLC26A4 (verde). La falloidina (ACTB, rosso) può essere utilizzata per evidenziare la presenza del sacco endolinfatico e del tessuto congiuntivo che lo circonda. (D) Sacco endolinfatico isolato marcato con un anticorpo anti-SLC26A4 (verde). (E) Illustrazione schematica dell'epitelio del sacco endolinfatico evidenziando la presenza di due tipi di cellule: le cellule ricche di mitocondri, la cui superficie apicale è ricoperta di microvilli, e le cellule ricche di ribosomi. (F-G) Immagini ad alto ingrandimento dell'epitelio del sacco endolinfatico a P5, dopo che il sacco endolinfatico è stato aperto e marcato con un anticorpo anti-SLC26A4 (verde) e falloidina (ACTB, rosso). Un'immagine rappresentativa a livello della membrana apicale è mostrata in G, e una sezione trasversale ricostruita da z-stack a livello della linea bianca puntata è mostrata in F. Il nucleo delle cellule è marcato con DAPI (blu). Barre di scala: 100 μm (A, B); 200 μm (C, D) ; 20 μm (F, G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig5v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1. Luce incidente e corrispondenti immagini a fluorescenza tdTomato di un P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn orecchio interno del topo a tre fasi della dissezione. Il sacco endolinfatico e il dotto possono essere facilmente visualizzati utilizzando la fluorescenza tdTomato. (A-B) Regione dell'orecchio interno nella parte posteriore di un mezzo cranio intatto di un P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn mouse. (C-D) La rimozione della pelle e di parte del cranio consente una migliore visualizzazione della regione del sacco endolinfatico. (E, F) Orecchio interno isolato con il sacco endolinfatico ancora associato al tessuto congiuntivo. (A, C, E) Immagini catturate in luce incidente. (B, D, F) tdFluorescenza del pomodoro del tessuto corrispondente. Barre della scala: 2 mm (A-B), 1 mm (C-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/JoVE_HondaLee_SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 2. Confronto della fluorescenza di sacche endolinfatiche isolate di R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn e R26LSL-RCL-tdT/+ compagni di cucciolata a E16.5 e P5. tdLa fluorescenza del pomodoro facilita notevolmente il riconoscimento del sacco endolinfatico e del dotto. (A-C) Sacche endolinfatiche microdissezionate di E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (A) e R26LSL-RCL-tdT/+ topi compagni di cucciolata (B, C). (D-F) Sacche endolinfatiche microdissezionate di P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (D) e R26LSL-RCL-tdT/+ topi compagni di cucciolata (E, F). (A, B, D, E) tdFluorescenza del pomodoro. (C, F) Immagini a luce incidente corrispondenti a B ed E. Barre di scala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/JoVE_HondaLee_SupplementaryFigure2.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Dissezione del sacco endolinfatico da topi

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L'ostruzione del dotto endolinfatico è un metodo chirurgico relativamente nuovo per i pazienti affetti dalla malattia di Ménière. A seguito di una mastoidectomia regolare, il dotto endolinfatico viene identificato e legato utilizzando un emoclip in titanio regolare. L'efficacia di questa procedura è attualmente in fase di valutazione in uno studio randomizzato.

Ostruzione del dotto endolinfatico come opzione di trattamento chirurgico per la malattia di Ménière

Qui discutiamo le caratteristiche cliniche e radiologiche dei tumori del sacco endolinfatico e riportiamo la metodologia e i risultati di una rimozione chirurgica in un caso in cura presso il nostro centro di riferimento otologico.

Trattamento chirurgico di un tumore del sacco endolinfatico

La stria vasculare è vitale per la generazione del potenziale endococleare. Qui, presentiamo la dissezione della stria vasculare del topo adulto per il sequenziamento a singolo nucleo o l'immunocolorazione.

Dissezione della stria vascolare del topo adulto per sequenziamento di singoli nuclei o immunocolorazione

Qui, descriviamo una tecnica per il prelievo di organi terminali vestibolari umani in condizioni fisiologiche durante la labirintectomia e la loro analisi mediante immunocolorazione.

Prelievo di organi terminali vestibolari in condizioni fisiologiche durante la labirintectomia

Qui viene presentato un protocollo per valutare i vasi linfatici meningei (MLV) dei muri, che svolgono un ruolo importante in molteplici malattie neurologiche. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo integrato che consenta sia la valutazione funzionale del drenaggio dei tracce sia la caratterizzazione morfologica dettagliata della rete di MLV dorsali.

Protocollo integrato per la valutazione dei linfatici meningei: iniezione di cisterna magna, imaging dei linfonodi, dissezione meningea e colorazione dell'intero montaggio

Impara la microdissezione del sacco endolinfatico da topi per studi di biologia dell'orecchio interno. Questo metodo consente analisi molecolari e cellulari dettagliate su modelli murini.

Dissezione del sacco endolinfatico da topi

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