Dissezione del sacco endolinfatico da topi

Il sacco endolinfatico è necessario per il normale sviluppo dell'orecchio interno. Poiché è inaccessibile in situ per studi strutturali, fisiologici e molecolari, la sua dissezione da modelli animali, in particolare modelli murini, è essenziale. La dissezione e la preparazione del sacco endolinfatico sono estremamente difficili a causa della sua struttura epiteliale sottile e delicata e della sua vicinanza e aderenza ai tessuti adiacenti.

Il nostro approccio facilita la visualizzazione e l'identificazione di un sacco e la sua separazione dai tessuti adiacenti. Malattie e disturbi che influenzano la normale funzione del sacco endolinfatico possono portare alla perdita dell'udito e dell'equilibrio. La nostra tecnica è essenziale per chiarire i processi cellulari, molecolari e fisiologici alla base delle funzioni del sacco endolinfatico.

A dimostrare la procedura sarà Hyun Jae Lee, un visiting fellow post-dottorato del mio laboratorio. Iniziare con la disposizione della preparazione dell'orecchio interno in una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri contenente PBS con la radice dell'ottavo nervo cranico orientata verso l'alto. Utilizzando una pinza n. 4, tenere il tessuto alla coclea e identificare l'acquedotto vestibolare, i canali semicircolari anteriori e posteriori, la crus comune e il seno sigmoideo.

Quindi utilizzare un ago calibro 27 montato su una siringa da un millilitro per incidere la dura madre e l'acquedotto vestibolare, nonché i tessuti connettivi sottostanti che circondano il sacco endolinfatico. Dopo aver praticato un'incisione nel tessuto connettivo laterale al sacco endolinfatico, utilizzare una pinza per trattenere il tessuto connettivo e staccarlo tirandolo via dall'osso temporale. Rimuovere con cura eventuali detriti rimanenti e separare l'epitelio del sacco endolinfatico dai tessuti circostanti.

Per la dissezione del sacco endolinfatico aperto, tenere la parte dello stelo del preparato per osservare la sezione trasversale del lume. Quindi inserire un ago calibro 27 nel lume e spostarlo per tagliare il sacco endolinfatico in due fogli. Tenere il bordo di ciascun tessuto simile a un foglio con una pinza e separarli l'uno dall'altro.

Nell'analisi rappresentativa, una sezione medio-sagittale del cranio di questi topi prima e dopo la rimozione di metà cervello è stata visualizzata con la fluorescenza tdTomato. Il sacco endolinfatico era facilmente visibile anche senza dissezione. Sono state isolate le orecchie interne dei topi al giorno 16,6 embrionale e al giorno 5 e 30 postnatale.

Le sacche endolinfatiche sono state osservate con un ingrandimento più elevato. Per i topi P30, il dotto endolinfatico è difficile da isolare a causa del suo incapsulamento nell'osso. L'immunoistochimica delle sacche endolinfatiche intatte da E16.5 e P5 è stata studiata con marcatura di anticorpi anti-SLC26A4 e falloidina.

La falloidina è stata utilizzata per evidenziare il sacco endolinfatico e il tessuto congiuntivo che lo circonda. Le immagini ad alto ingrandimento dell'epitelio del sacco endolinfatico aperto a P5 mostrano che il SLC26A4 marcato in verde è localizzato nella regione apicale di un sottogruppo di cellule. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è di essere molto delicati per evitare di danneggiare il sacco endolinfatico.

Un tessuto del sacco endolinfatico fisso isolato con questo approccio può essere utilizzato per l'ibridazione in situ, l'endoscopio dell'RNA e l'immunoistochimica. Il tessuto vivo può essere utilizzato per preparare l'RNA per l'analisi del trascrittoma e per la fisiologia. Questo approccio è stato utilizzato per studiare il trascrittoma del sacco endolinfatico, sia nel suo insieme che nell'analisi RNA-seq a singola cellula per contribuire a caratterizzare i suoi diversi tipi cellulari.