Dissezione delle proprietà meccanoenzimatiche delle miosine processive con spettroscopia ultraveloce a force-clamp

La spettroscopia force-clamp ultraveloce è una tecnica a singola molecola basata su pinzette laser che consente di studiare la chemiomeccanica dei motori di miosine sotto carico con la massima risoluzione temporale. Questa tecnica consente di sondare eventi molto rapidi nella produzione di forza mantenendo costante la forza durante ogni fase dell'interazione motoria con pieno controllo sulla direzionalità della forza. Apportando le opportune regolazioni, questo protocollo potrebbe essere facilmente applicato ad altri tipi di motori processivi, tra cui chinesine e dineine, per scoprire la regolazione con la forza.

Dopo aver montato un set di deflettori acusto-ottici su un traslatore lineare, prendi un diaframma e regola la sua apertura per adattarla alle dimensioni dell'apertura posteriore dell'obiettivo. Sostituite l'obiettivo con il diaframma centrato sull'alloggiamento filettato dell'obiettivo. Spostare il traslatore verso il raggio laser fino a quando la porzione del raggio bloccata dal cristallo piezoelettrico è visibile dopo l'iride e ruotare leggermente indietro il traslatore fino a quando il raggio riempie completamente l'apertura del diaframma.

Per preparare le perle di silice in acetato di pentile, prima diluire 20 microlitri di perle di silice solida al 10% da 1,2 micron in 1-1,5 millilitri di acetone con vortice e 30 secondi di sonicazione. Dopo la sonicazione, raccogliere le perle mediante centrifugazione e risospendere il pellet di perline in 1 millilitro di acetone fresco per un secondo lavaggio. Dopo il secondo lavaggio dell'acetone, lavare le perle tre volte in 1 millilitro di acetato di pentile fresco per lavaggio nelle stesse condizioni di centrifugazione e risospendere il pellet in 100 microlitri di 1% di nitrocellulosa e 900 microlitri di acetato di pentile.

Quindi, utilizzare un pezzo di tessuto da laboratorio imbevuto di etanolo puro per pulire accuratamente un coprivetro da 24 x 24 millimetri prima di utilizzare una pinzetta pulita per sciacquare il vetro direttamente nell'etanolo e lasciare asciugare il coprislip sotto un delicato flusso di azoto. Vortice e sonicare il brodo di perline di silice preparato per 30 secondi e utilizzare un coprislip da 24 x 60 millimetri pulito con etanolo per spalmare 2 microlitri di soluzione di perline di silice sulla superficie del coprislip più piccolo. Mentre le perline si stanno asciugando, pulire una diapositiva di 26 x 76 millimetri come dimostrato e posizionare due linee spesse 60-100 micron di 3 millimetri a doppia faccia nastrate sui bordi lunghi della diapositiva.

Usando una pinzetta pulita, posizionare il coprislip rivestito di perline sul nastro con le perline rivolte verso l'interno della camera di scorrimento e riempire la camera con tampone fosfato 15 millimolare e soluzione di perline di polistirene galleggiante. Quindi, sigillare la camera con grasso al silicone. Per calibrare il rapporto pixel-nanometro della fotocamera a campo chiaro, acquisire una prima immagine di una perla di silice sulla superficie del coprislip a circa 5 micron dal centro del campo visivo.

Sposta il palco per spostare il tallone di 10 micron verso il centro del campo visivo e scatta una seconda immagine. Calcolare la costante di calibrazione della fotocamera misurando la distanza in pixel tra due posizioni del tallone. Per calibrare la posizione della trappola, intrappolare una singola particella galleggiante in una trappola e spostare i deflettori acusto-ottici in passi di 0,2 megahertz, acquisendo un'immagine della particella e la frequenza corrispondente dei deflettori per ogni passo.

Quindi, ripetere la calibrazione per la seconda trappola nello stesso modo. Per calibrare la potenza e la rigidità della trappola, intrappolare una singola particella in ciascuna trappola e spostare entrambe le trappole usando i deflettori acusto-ottici in incrementi di 0,2 megahertz, registrando un moto browniano della particella in entrambe le trappole con rivelatori a fotodiodi a quadrante e la frequenza corrispondente dei deflettori acusto-ottici. Ottenere costanti di calibrazione adattando una funzione lorentziana ad uno spettro di potenza del moto browniano registrato.

Per assemblare un campione per la misurazione, aggiungere 1 milligrammo per millilitro di BSA biotinilato in una nuova camera con perline di silice sulla superficie del coperchio. Dopo 5 minuti, lavare la camera con tampone AB e aggiungere 1 milligrammo per millilitro di streptavidina alla camera. Dopo 5 minuti, lavare la camera come dimostrato e aggiungere 3 nanomolari biotinilati Myosin-5B pesante meromiosina in tampone M5B integrato con 2 micromolari Calmodulin.

Dopo 5 minuti, lavare la camera tre volte con 1 milligrammo per millilitro di BSA biotinilato integrato con 2 micromolari di calmodulina in tampone AB e attendere 3 minuti dopo il lavaggio finale. Far scorrere la miscela di reazione e sigillare la camera con grasso al silicio. Per misurare il campione, posizionare la camera sullo stadio del microscopio e spostare l'obiettivo fino a quando le perle galleggianti di alfa-actina sono a fuoco.

Accendi una trappola e intrappola una perlina. Una volta occupata la prima trappola, spostare il traduttore per posizionare il tallone intrappolato vicino alla superficie del coprislip per evitare di intrappolare più perline e intrappolare una perlina nella seconda trappola. Spostare il campione attraverso i trasduttori a lungo raggio per individuare filamenti di actina di almeno 5 micron di lunghezza all'interno della soluzione.

Quando è stato individuato un filamento, spostare il campione per consentire a una perla intrappolata di avvicinarsi a un'estremità del filamento. Una volta che il filamento è stato attaccato, regolare la distanza del tallone alla lunghezza approssimativa del filamento e spostare il palcoscenico per creare un flusso nella direzione del tallone non legato. Il filamento si allungherà dal flusso e alla fine si legherà alla seconda perla.

Il complesso risultante è chiamato manubrio"Per stabilire il contatto actina-miosina, separare delicatamente le due trappole e impostare il filamento a livelli di pretensione fino a circa 3 piconewton. Per sondare la rigidità del manubrio, far oscillare una trappola in un'onda triangolare cambiando la frequenza di un deflettore acusto-ottico e verificando la conseguente trasmissione del moto al tallone di coda attraverso il suo segnale di posizione. Spostare il palco per posizionare il manubrio in prossimità di una perla di silice a piedistallo e regolare l'altezza del manubrio in modo che il filamento di actina entri in contatto con la superficie del tallone di silice.

Come osservato in questo record di posizione rappresentativa, quando il motore della miosina non interagisce con il filamento di actina, le perle intrappolate si muovono a velocità costante contro la forza di trascinamento viscoso della soluzione. Una volta che il motore della miosina inizia a interagire con il filamento, la forza trasportata dal filamento in movimento viene trasferita molto rapidamente alla proteina e la velocità del sistema scende a zero, con gli eventi di passo che si verificano sotto forza costante fino alla fine della corsa. La forza viene commutata dalla direzione positiva a quella negativa dal sistema di feedback, che cambia la direzione della forza quando il tallone raggiunge il bordo dell'intervallo di oscillazione impostato dall'utente.

Quando la miosina si lega e sposta il filamento verso la direzione positiva, spinge il tallone verso il bordo superiore dell'intervallo di oscillazione. Se ciò avviene sotto la forza assistiva, la corsa della miosina sarà interrotta dall'inversione della direzione della forza sul bordo dell'oscillazione, limitando la lunghezza della corsa all'ampiezza dell'oscillazione del manubrio. L'allineamento preciso del sistema ottico è necessario per ottenere la risoluzione spaziale e temporale ottimale, mentre è necessaria una calibrazione accurata per determinare con precisione i valori delle forze applicate.

Questa tecnica è stata adattata per studiare la ricerca scorrevole e mirata di fattori di trascrizione nel DNA e le interazioni dinamiche tra proteine meccanotrasduttrici che inducono su filamenti di microtubuli.