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Questo lavoro è stato supportato da fondi di NIGMS R35GM133488 e dal Roy J. Carver Charitable Trust a V.V.

1. Preparazione del campione NMR
<ol><li>Esprimere e purificare un campione di 2H,15N-labled della proteina di interesse. NOTA: Mentre un campione diproteine con etichetta N può essere utilizzato per l'acquisizione dell'esperimento CPMG RD, la perditauterazione (ove possibile) aumenta notevolmente la qualità dei dati ottenuti. I protocolli per la produzione di proteine peruteuterate sono disponibili nella letteratura13.</li>
	<li>Tamponare lo scambio del campione proteico purificato in un buffer NMR degassato.</li>
	<li>Trasferire il campione NMR nel tubo NMR. NOTA: La concentrazione del campione NMR deve essere attentamente ottimizzata al fine di massimizzare il rapporto segnale-rumore e ridurre al minimo il verificarsi di interazioni proteina-proteina. In generale, l'intervallo di concentrazione tipico per gli esperimenti CPMG è di 0,1-1,0 mM.</li>
</ol>2. Prima configurazione dell'esperimento NMR
<ol><li>Scaricare e decomprimere i file supplementari.</li>
	<li>Copiare i file bits.vv e trosy_15N_cpmg.vv (che si trovano nella cartella denominata pulseprogram) nella directory del programma pulse (<path>/exp/stan/nmr/lists/pp/user). NOTA: assicurarsi che il percorso di bits.vv elencato nella prima riga del file trosy_15N_cpmg.vv sia corretto.</path></li>
	<li>Aprire il software di acquisizione e copiare un esperimento HSQC H-15N eseguito in precedenza in un nuovo esperimento utilizzando il comando edc.</li>
	<li>Utilizzando il comando pulprog, caricare il programma pulse trosy_15N_cpmg.vv nell'esperimento appena creato.</li>
	<li>Impostare l'esperimento CPMG utilizzando le istruzioni fornite alla fine del file del programma pulse (trosy_15N_cpmg.vv).</li>
</ol>3. Configurazione di routine dell'esperimento NMR
<ol><li>Introdurre il campione nel magnete ed eseguire tutti i passaggi di base per l'acquisizione di qualsiasi esperimento NMR: bloccare e shim il campione; abbinare e sintonizzare i canali 1H e 15N.</li>
	<li>Impostare p1 e p7 sulla durata degli impulsi 1H e 15N duri 90°, rispettivamente. NOTA: Per risultati ottimali, è importante calibrare l'impulso di 15N 90° con grande cura. La calibrazione viene solitamente eseguita utilizzando un campione di 100 mM di ureacon etichetta N in DMSO come descritto nel manuale dello spettrometro. Inoltre, è possibile ricontrollare la calibrazione direttamente sul campione NMR funzionante acquisendo il primo incremento di uno spettro HSQC da 1H-15N in cui l'impulso di 15N 90 ° del primo blocco INEPT viene commutato a un impulso di 180°. Se la calibrazione è corretta, è necessario ottenere un nullo.</li>
	<li>Nella finestra di acquisizione, impostate la larghezza centrale e spettrale per le dimensioni 1H e 15N. NOTA: Centrare lo spettro 1H alla frequenza del segnale d'acqua per una soppressione ottimale dell'acqua.</li>
	<li>Impostare il ritardo di rilassamento (d30) pari a 0,7 T2, dove T2 è il tempo di rilassamento trasversale previsto di 15N della proteina. NOTA: Il valore di d30 può essere ottimizzato empiricamente per ottenere i migliori risultati.</li>
	<li>Utilizzare il comando vclist per creare un elenco di numeri interi corrispondenti al parametro n nella figura 1A e nella figura 1B. Assicurarsi che ogni voce dell'elenco corrisponda a un campo CPMG diverso (νcpmg) secondo νcpmg = 4 x n / d30. Assicurarsi che il primo numero nell'elenco sia 0 (corrisponde all'esperimento di riferimento per il quale il blocco CPMG viene saltato e d30 = 0 s) e di non utilizzare numeri maggiori di 1.000 x d30 / 4. Numeri superiori a questa soglia si traducono in νcpmg &gt; 1 kHz e potrebbero danneggiare la sonda.</li>
	<li>Impostare l8 sul numero di voci nell'elenco vclist, l3 sul numero di punti reali per la dimensione indiretta (di solito è impostato un intervallo di 64-200 per l3) e 1 td uguale a l8 x l3 x 2. NOTA: Eseguire i passaggi 3.7-3.11 per ottimizzare la soppressione dell'acqua.</li>
	<li>Impostare il guadagno del ricevitore (rg) su 1; Aprire il file del programma pulse (edcpul), passare alla riga 91, rimuovere il punto e virgola precedente al goto 999e salvare il file.</li>
	<li>Utilizzando il comando gs regolate i parametri spdb0 (o spdw0) per ridurre al minimo l'intensità del segnale FID.</li>
	<li>Reintrodurre il punto e virgola alla riga 91 del file del programma pulse e salvare il file.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.7-3.9 per ottimizzare spdb11 (riga 168 del file del programma pulse), spdb2 (riga 179 del file del programma pulse) e pldb2 (riga 184 del file del programma pulse).</li>
	<li>Eseguire il comando rga per ottimizzare il guadagno del ricevitore.</li>
	<li>Impostare il numero di scansioni (ns) su un multiplo di 8.</li>
	<li>Eseguire il comando zg per avviare l'esperimento.</li>
</ol>4. Elaborazione e analisi dei dati NMR
<ol><li>Copiare la cartella Process (Supplemental Files) nella directory contenente il file ser.</li>
	<li>Utilizzare i file sep_fid.com e ft2D.com per elaborare i dati NMR. NOTA: le istruzioni su come modificare gli script di elaborazione vengono fornite all'interno sep_fid.com e ft2D.com file.</li>
	<li>Aprire i file ucsf contenuti nella directory CPMG_Sparky_files in Sparky. NOTA: i file ucsf vengono creati dagli script di elaborazione. È presente un file ucsf per ogni voce nell'elenco vclist. Il primo file ucsf (test_1.ucsf) contiene l'esperimento di riferimento. I file ucsf successivi (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) sono ordinati dal valore più basso a quello più grande di νcpmg.</li>
	<li>Selezionare i picchi incrociati NMR sullo spettro NMR di riferimento (test_1.ucsf).</li>
	<li>Selezionare tutti i picchi incrociati selezionati utilizzando il comando Sparky pa.</li>
	<li>Eseguire il comando Sparky rh. Questo comando apre una finestra di dialogo. Selezionare le altezze delle opzioni nella stessa posizione in ogni spettro. Fare clic su Setup e controllare tutti gli spettri NMR. Fare clic su Aggiorna e salvare il file di output nella directory di lavoro. Il file di output contiene la matrice delle intensità del segnale su tutti gli spettri NMR aperti. NOTA: Protocolli più accurati che utilizzano il raccordo a forma di linea per recuperare le intensità da esperimenti pseudo-3D interfogliati sono stati descritti nella letteratura14. Il software liberamente disponibile per il raccordo a forma di linea è disponibile presso https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) e all'interno di NMRPipe (modulo nLinLS) e SPARKY (modulo it).</li>
	<li>Per ogni campo CPMG, convertire le intensità del segnale in velocità R2 utilizzando la formula , dove <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq03.jpg"> I0 e Id30 sono rispettivamente l'intensità degli spettri NMR di riferimento (vc = 0) e rilassati (vc &gt; 0). NOTA: nei file supplementariviene fornito un modello del file di foglio di calcolo (R2_calc.xls) utilizzato per convertire le intensità del segnale in velocità R2 e per visualizzare i profili RD.</li>
	<li>Leggere il livello di rumore nello spettro di riferimento utilizzando il comando Sparky st e propagare l'errore sulle velocità R2. NOTA: nei file supplementari viene fornitoun modello del file di foglio di calcolo (R2_calc.xls) utilizzato per propagare l'errore sulle velocità R2 misurate.</li>
</ol>5. Montaggio di curve RD
<ol><li>Copiare la cartella denominata RD_fitting (File supplementari) nella directory di lavoro.</li>
	<li>Per ogni picco NMR assegnato, stimare Rex calcolando <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq04.jpg"> il . e sono i tassi R <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"> 2 misurati al più basso e più alto νcpmg nel vclist.
</li>
	<li>Ispezionare visivamente le curve RD con Rex più grande di due volte l'errore stimato ed eliminare tutte le curve RD troppo rumorose per essere modellate con precisione. NOTA: Il rumore su Rex può essere propagato dagli errori su <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> e <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"> .</li>
	<li>Preparare un file di input per lo script di raccordo utilizzando tutte le curve RD con Rex più grande di due volte l'errore stimato. NOTA: Istruzioni dettagliate sulla preparazione dei file di input sono fornite all'interno degli script di fitting. I file di input di esempio vengono forniti come file supplementari. Comunemente, i dati RD vengono misurati in due diversi campi statici e installati contemporaneamente. In questo protocollo sono necessari due diversi file di input (File supplementari).</li>
	<li>Adattare i dati di Desktop remoto utilizzando gli script forniti in File supplementari. NOTA: vengono forniti due script diversi per eseguire rispettivamente un adattamento basato sui residui o globale delle curve RD. Entrambi gli script si adattano alle curve RD usando un modello di scambio a due siti e l'equazione di Carver-Richards. Istruzioni più dettagliate sono fornite all'interno degli script di raccordo. Ulteriori pacchetti software come Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) e CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/ ) sono disponibili per eseguire il montaggio dei dati utilizzando le equazioni di Block-McConnell.</li>
	<li>Verificare l'affidabilità dei parametri montati stimando il ridotto χ2 in funzione di pb e kex. NOTA: Il ridotto χ2 è fornito nel file di output. pb e kex possono essere trattenere a valori specifici utilizzando limiti inferiori e superiori nelle procedure di raccordo. Nei nostri script, i limiti inferiore e superiore per pb sono rispettivamente lb(2) e ub(2). I limiti inferiore e superiore per kex sono rispettivamente lb(3) e ub(3).</li>
	<li>Stimare l'errore sui parametri montati. Questa impostazione può essere eseguita impostando il valore di MC_fac nello script su 1 e ripetendo il raccordo più volte (in genere &gt;20 ripetizioni). L'errore su ogni parametro è stimato come deviazione standard della distribuzione. NOTA: L'impostazione MC_fac su 1 genera un set di dati sintetico in cui un errore distribuito gaussiano (calcolato in base all'errore sperimentale) viene aggiunto ai dati sperimentali.</li>
</ol>

<ol><li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li>
<li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li>
<li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li>
<li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer%2Fdimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li>
<li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960(2015).</li>
<li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li>
<li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+slow+%28micros-ms%29+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+%2815%29N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li>
<li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+thermophilic%2Fmesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li>
<li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relaxation-compensated+Carr%E2%88%92Purcell%E2%88%92Meiboom%E2%88%92Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li>
<li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li>
<li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li>
<li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li>
<li>Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li>
<li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li>
<li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li>
<li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Contrast%27+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd%2FCeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li>
<li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li>
<li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy%3A+application+to+a+723-residue+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li>
<li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+backbone+%2813%29CO+and+%2815%29N+relaxation+dispersion+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li>
<li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+%2813%29C-detected+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747(2019).</li>
</ol>

Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto. Non dichiariamo conflitti di interesse.

Questo manoscritto descrive il protocollo implementato in laboratorio per l'acquisizione e l'analisi di 15dati N RD sulle proteine. In particolare, sono trattate le fasi cruciali per la preparazione del campione NMR, la misurazione dei dati NMR e l'analisi dei profili rd. Di seguito vengono discussi alcuni aspetti importanti riguardanti l'acquisizione e l'analisi degli esperimenti di ricerca e sviluppo. Tuttavia, per una descrizione più approfondita dell'esperimento e dell'analisi dei dati, è altamente raccoma...

Gli esperimenti di dispersione di rilassamento Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) (RD) vengono utilizzati su una base di routine per caratterizzare gli equilibri conformazionali che si verificano sulla scala cronologica μs-ms mediante spettroscopia NMRsoluzione 1,2,3,4,5. Rispetto ad altri metodi per lo studio della dinamica conformazionale, le tecniche CPMG sono relativamente facili da implementare sui moderni spettrometri NMR, non richiedono fasi specializzate di preparazione del campione (cioè cristallizzazione, congelamento o allineamento del campione e / o coniugazione covalente con un tag fluorescente o paramagnetico) e forniscono una caratterizzazione completa degli equilibri conformazionali che ritornano informazioni strutturali, cinetiche e termodinamiche sui processi di scambio. Affinché un esperimento CPMG riferisci su un equilibrio conformazionale, devono essere applicate due condizioni: (i) gli spin NMR osservati devono possedere diversi cambiamenti chimici negli stati sottoposti a scambio conformazionale (microstati) e (ii) lo scambio deve avvenire ad una scala di tempo che va da ~ 50 μs a ~ 10 ms. In queste condizioni, il tasso di rilassamento trasversale osservato è <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> la somma dell'intrinseco R2 (l'R2 misurato in assenza di dinamica μs-ms) e il <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> contributo di scambio al rilassamento trasversale (Rex). Il contributo Rex a R2obs può essere progressivamente spento riducendo la spaziatura tra gli impulsi di 180° che costituiscono il blocco CPMG della sequenza di impulsi, e le curve RD risultanti possono essere modellate usando la teoria di Bloch-McConnell per ottenere la differenza di spostamento chimico tra i microstati, la popolazione frazionata di ogni microstato e i tassi di scambio tra microstati(Figura 1)1,2,3.
Diverse sequenze di impulsi e protocolli di analisi sono stati riportati in letteratura per esperimenti CPMG 15N. Qui viene descritto il protocollo implementato in laboratorio. In particolare, saranno introdotte le fasi cruciali per la preparazione del campione NMR, l'installazione e l'acquisizione degli esperimenti NMR e l'elaborazione e l'analisi dei dati NMR(figura 2). Per facilitare il trasferimento del protocollo ad altri laboratori, il programma pulse, gli script di elaborazione e analisi e un set di dati di esempio sono forniti come file supplementari e sono disponibili per il download all'https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html. La sequenza di impulsi fornita incorpora un ciclo di fase in quattro fasi nel blocco CPMG per la soppressione degli artefatti dipendenti dall'offset6 ed è codificata per l'acquisizione di diversi esperimenti interfogliati. Questi esperimenti interfogliati hanno un periodo di rilassamento identico ma un numero diverso di impulsi di rifocalizzazione al fine di ottenere diversi campi CPMG7. È anche importante notare che il programma di impulsi descritto misura il 15N R2 della componente TROSY del segnale NMR8. Nel complesso, il protocollo è stato applicato con successo per la caratterizzazione dello scambio conformazionale in proteine di medie e grandidimensioni 4,5,9,10. Per i sistemi più piccoli (&lt;20 kDa), è consigliabile l'uso di una sequenza di impulsi basata sulla coerenza quantistica singola (HSQC) eteronucleare (HSQC)11,12.

<table><tbody><tr><td>Criosonda</td><td>Bruker</td><td>5mm TCI 800 H-C/N-D criosonda</td><td>Migliora la sensibilità</td></tr><tr><td>Ossido di deuterio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>756822-1</td><td>>99,8% puro, utilizzato nella preparazione di campioni NMR e colture deuterate</td></tr><tr><td>Centrifuga manuale</td><td>United Scientific</td><td>fornisce CENTFG1</td><td>Utilizzato per rimuovere eventuali bolle d'aria o liquidi residui bloccati sulle pareti del tubo NMR.</td></tr><tr><td>Spettrometro NMR ad alto campo</td><td>Bruker</td><td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td><td>Acquisizione dei dati NMR</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td><td>Modellazione dei dati NMR</td></tr><tr><td>Pasteur NMR Pipetta</td><td>Corning Incorporation</td><td>7095D-NMR</td><td>Pipetta per pastore in vetro Pyrex per trasferire il campione liquido in tubo NMR</td></tr><tr><td></td><td>Precisione Willmad</td><td>535-PP-7</td> 5mm <td>parete sottile 7'' tubo cilindrico di vetro</td></tr><tr><td>NMRPipe</td><td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td><td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td><td>NMR elaborazione dati NMR</td></tr><tr><td>SPARKY</td><td>Università della California, San Francisco</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td> <td>Analisi dei dati NMR</td></tr><tr><td>Tospin 3.2 (o più recente)</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td><td>Software di acquisizione</td></tr></tbody></table>

15 di cui: la commissione per i n cpmg relaxation dispersion per lo studio delle dinamiche conformazionali proteiche sulla scala cronologica μs-ms

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Le dinamiche conformazionali proteiche svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della catalisi enzimatica, del legame del ligando, della legasteria e della segnalazione, che sono importanti processi biologici. Comprendere come l'equilibrio tra struttura e dinamica governa la funzione biologica è una nuova frontiera nella moderna biologia strutturale e ha acceso diversi sviluppi tecnici e metodologici. Tra questi, i metodi NMR della soluzione di dispersione di rilassamento CPMG forniscono informazioni uniche a risoluzione atomica sulla struttura, la cinetica e la termodinamica degli equilibri conformazionali proteici che si verificano sulla scala cronologica μs-ms. Qui, lo studio presenta protocolli dettagliati per l'acquisizione e l'analisi di un esperimento di dispersione di rilassamento 15N. Ad esempio, viene mostrata la pipeline per l'analisi della dinamica μs-ms nel dominio C-terminale dei batteri Enzima I.

Il protocollo qui descritto si traduce nell'acquisizione di profili RD per ogni picco nello spettro 1H-15N TROSY (Figura 3A). Dai profili RD acquisiti è possibile stimare il contributo di scambio al rilassamento trasversale di 15N di ciascun gruppo dorsale di ammide(Figura 3A,3B). Tracciandol'ex R sulla struttura 3D della proteina in esame, è possibile identificare le regioni strutturali sottoposte a s...

Qui viene fornita una descrizione dettagliata del protocollo implementato in laboratorio per l'acquisizione e l'analisi di profili di dispersione di rilassamento 15N mediante spettroscopia NMR soluzione.

15 di cui: la commissione per i N CPMG Relaxation Dispersion per lo studio delle dinamiche conformazionali proteiche sulla scala cronologica μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Questo protocollo può essere utilizzato per il rilevamento e la caratterizzazione di dinamiche conformazionali proteiche, che sono essenziali per comprendere una grande varietà di processi cellulari. Rispetto ad altri metodi, questo metodo non richiede fasi specializzate di preparazione del campione e fornisce una caratterizzazione completa della cinetica, della termodinamica e degli aspetti strutturali dell'equilibrio confermazionale. La dispersione di rilassamento cpmg può essere applicata più ampiamente per la caratterizzazione della dinamica di conferma negli acidi nucleici e in altre biomolecole, così come per la caratterizzazione delle interazioni con le nanoparticelle ligandi.Il nostro protocollo è rivolto agli utenti CPMG per la prima volta. Si tratta quindi di un buon punto di partenza. Tuttavia, ci aspettiamo che gli utenti conoscano i passaggi di base per l'esecuzione di esperimenti NMR convenzionali.Per configurare un esperimento NMR per la prima volta, scaricare e decomprimere questi file supplementari. Copiare i bit. vv e trosy_15N_CPMG.vv nella cartella del programma pulse nella directory del programma pulse. Aprire il software di acquisizione e utilizzare il comando EDC per copiare un esperimento HSQC a azoto idrogeno 15 eseguito in precedenza in un nuovo esperimento. Utilizzare il comando del programma pulse per caricare il trosy_15N_CPMG.vv pulse nell'esperimento appena creato. Quindi utilizzare le istruzioni dalla fine del file del programma pulse per impostare l'esperimento CPMG. Per impostare un esperimento NMR di routine, introdurre il campione al magnete ed eseguire tutte le fasi di acquisizione nmr di base.Impostare P1 sulla durata degli impulsi duri a 90 gradi di idrogeno e P7 sulla durata degli impulsi a azoto 15 duri a 90 gradi. Nella finestra di acquisizione, impostare la larghezza centrale e spettrale per le dimensioni idrogeno e azoto 15. Impostare il ritardo di rilassamento su 0,7 T2 e utilizzare il comando elenco VC per creare un elenco di numeri interi corrispondenti a N.Dopo aver confermato che ogni voce nell'elenco corrisponde a un campo CPMG diverso in base a CPMG archiviato è uguale a 4N diviso per D30, verificare che il primo numero nell'elenco sia zero.Impostare L8 sul numero di voci nell'elenco VC, L3 sul numero di punti reali per la dimensione indiretta e 1TD su L8 per L3 per due. Per ottimizzare la soppressione dell'acqua, impostare il guadagno del ricevitore su uno e digitare EDC pull per aprire il file del programma di impulsi. Sulla riga 91 rimuovere i punti e virgola precedenti al goto 999 e salvare il file.Utilizzando il comando GS, regolare i parametri SPDB0 per ridurre al minimo l'intensità del segnale FID. Quando l'intensità del segnale è stata modificata, reintrodurre un punto e virgola alla riga 91 del file del programma di impulsi e salvare il file. Per ottimizzare SPDB11, impostare il guadagno del ricevitore su uno e il tipo EDC pull per aprire il file del programma pulse.Sulla riga 168 rimuovere i punti e virgola precedenti al goto 999 e salvare il file. Utilizzando il comando GS, regolare i parametri SPDB11 per ridurre al minimo l'intensità del segnale FID. Quando l'intensità del segnale è stata modificata, reintrodurre i punti e virgola alla linea 168 e salvare il file.Per ottimizzare SPDB2, impostare il guadagno del ricevitore su uno e immettere EDC pull per aprire il file del programma pulse. Sulla riga 179 rimuovere i punti e virgola precedenti al goto 999 e salvare il file. Utilizzando il comando GS, regolare i parametri SPDB2 per ridurre al minimo l'intensità del segnale FID.Quando l'intensità del segnale è stata modificata, re-introdurre i punti e virgola alla riga 179 del file del programma di impulsi e salvare il file. Per ottimizzare PLDB2, impostare il guadagno del ricevitore su uno e immettere EDC pull per aprire il file del programma pulse. Sulla riga 184 rimuovere i punti e virgola precedenti il goto 999 e salvare il file.Utilizzando il comando GS, regolare i parametri PLDB2 per ridurre al minimo l'intensità del segnale FID. Quando l'intensità del segnale è stata modificata, reintrodurre i punti e virgola alla riga 184 del file del programma di impulsi e salvare il file. Eseguire il comando RGA per ottimizzare il guadagno del ricevitore.Quindi eseguire il comando ZG per avviare l'esperimento. In questa figura, si possono osservare i risultati dei profili di dispersione del rilassamento acquisiti per ogni picco nello spettro dell'azoto idrogeno 15 Trosy. Dai profili di dispersione del rilassamento acquisiti, è possibile stimare il contributo di scambio al rilassamento trasversale dell'azoto 15 di ogni gruppo AMI dorsale.Tracciando il rilassamento trasversale sulla struttura 3D della proteina in esame è possibile identificare le regioni strutturali in fase di scambio confermazionale sulla scala temporale del microsecondo millisecondo. La modellazione delle curve di dispersione di rilassamento usando le equazioni di Carver-Richards restituisce i parametri termodinamici e cinetici sul processo di scambio, come le popolazioni frazionarie degli stati in equilibrio e il tasso di cambio tra questi stati. La dipendenza dalla temperatura di questi parametri termodinamici e cinetici può quindi essere modellata usando rispettivamente le equazioni van't Hoff e I-ring per ottenere informazioni dettagliate sugli energetici dello scambio confermazionale.È fondamentale ottimizzare attentamente tutti i parametri di acquisizione, in particolare P7. È anche importante produrre campioni altamente puri e omogenei per evitare dispersioni spurie. I parametri cinetici, termodinamici e chimici dei chip ottenuti utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per ricavare informazioni energetiche e strutturali sulle specie sottoposte allo scambio confermazionale. La caratterizzazione della dinamica di conferma proteica ottenuta con i metodi CPMG fornisce informazioni cruciali per comprendere la segnalazione e l'attività enzimatica, nonché nuove prospettive per la progettazione dei farmaci.

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