Approccio alla perdita di funzione nella retina embrionale del pulcino utilizzando l'espressione transgenica mediata dal trasposone Tol2 di microRNA artificiali

Questa metodologia fornisce un approccio basato sulla perdita di funzione per gli studi sullo sviluppo della retina nel pulcino. Questa tecnica supporta la soppressione rapida e persistente dei geni bersaglio in un'area specifica della retina. Questo approccio può essere applicato anche ad altre parti dell'embrione di pulcino, compresi i tessuti neurali e non neurali.

Per l'elettroporazione in ovo, preparare una soluzione Fast Green allo 0,25% sciogliendo 25 milligrammi di Fast Green FCF in 10 millilitri di PBS, quindi filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,2 micron. Successivamente, preparare la soluzione iniettabile del cocktail di DNA mescolando il plasmide GFP smeraldo del microRNA con il plasmide di espressione della trasposasi Tol2 con un rapporto di due a uno. Quindi aggiungere la soluzione Fast Green preparata al cocktail di DNA con un rapporto di uno a 10 per la visualizzazione dell'area iniettata.

Successivamente, impostare l'apparecchio di microiniezione. L'apparecchio è costituito da una siringa Hamilton, un ago da due pollici calibro 18, un tubo in cloruro di polivinile lungo due centimetri e un ago per micropipetta. Riempire la siringa Hamilton con olio minerale pesante, quindi collegare l'ago calibro 18 alla siringa e riempire lo spazio interno dell'ago con olio premendo lo stantuffo della siringa.

Quindi, collegare il tubo di cloruro di polivinile all'estremità dell'ago e riempire il tubo con l'olio. Collegare l'ago della micropipetta tirato al tubo. Quindi, sotto il microscopio da dissezione, utilizzando una pinza fine, rompere la punta dell'ago a un diametro di 10-20 micrometri per fare una piccola apertura.

Riempi l'intero ago con olio. Quindi, metti cinque microlitri del cocktail di DNA colorato su una capsula di Petri. Sotto il microscopio da dissezione, posizionare la punta dell'ago della micropipetta nella soluzione di DNA sulla capsula di Petri e aspirare lentamente la soluzione nell'ago.

Dopo che la pressione si è equilibrata all'interno e all'esterno dell'ago, estrarre la punta dell'ago dalla soluzione di DNA e tenerla immersa in PBS sterile in un piccolo becher fino all'iniezione. Quindi, per installare l'apparecchio di elettroporazione, posizionare saldamente una coppia di elettrodi di platino con un portaelettrodo su un micromanipolatore. Regolare la distanza tra la punta degli elettrodi a due millimetri e collegare gli elettrodi a un generatore di impulsi a onda quadra con cavi.

Successivamente, per la microiniezione di DNA, rimuovere un uovo di Livorno bianco fecondato dall'incubatrice e pulire la superficie dell'uovo con carta velina imbevuta di etanolo al 70%. Quindi collegare un ago calibro 18 a una siringa da 10 millilitri e inserire l'ago attraverso l'estremità smussata dell'uovo, inclinato verso il basso per evitare di danneggiare il tuorlo. Dopo aver prelevato due o tre millilitri di albumina dall'uovo, sigillare il foro con un pezzo di scotch e accendere l'uovo con una candela luminosa per assicurarsi che l'embrione e la membrana vitellina si stacchino dal guscio.

Successivamente, usando una pinza, rimuovere un pezzo di guscio d'uovo dalla parte superiore dell'ovulo, esponendo l'embrione. Non finestrare più di cinque ovuli alla volta per evitare che gli embrioni si secchino durante l'elettroporazione. Inserire la punta dell'ago nella vescicola ottica dal suo lato prossimale con un angolo di 45 gradi e iniettare il cocktail di DNA premendo lentamente lo stantuffo fino a quando la soluzione di colore blu riempie il lume.

Estrarre l'ago e riposizionare la punta nel PBS. Per l'elettroporazione, impostare la tensione dell'impulso su 15 volt, la lunghezza dell'impulso su 15 millisecondi, l'intervallo dell'impulso su 915 millisecondi e il numero di impulsi su cinque. Dopo aver aggiunto alcune gocce di HBSS sulla membrana vitellina sopra l'embrione, utilizzare il micromanipolatore per abbassare gli elettrodi nell'HBSS perpendicolarmente all'asse antero-posteriore dell'embrione.

Posizionare gli elettrodi su entrambi i lati della vescicola ottica, assicurandosi che gli elettrodi non tocchino l'embrione o i vasi sanguigni, quindi applicare campi elettrici pulsati. Al termine dell'elettroporazione, rimuovere gli elettrodi e pulirli delicatamente con un batuffolo di cotone sterile imbevuto d'acqua per evitare l'accumulo di albumina. Sigillare la finestra con dello scotch e reincubare l'embrione fino allo stadio di sviluppo desiderato.

La trasfezione di singole sequenze di pre-microRNA in cellule HEK293T esprimenti Nel AP ha provocato una significativa soppressione dell'espressione di Nel da parte dei costrutti contro i nucleotidi da 482 a 502, da 910 a 930 e da 2461 a 2481. Il concatenamento di due sequenze di microRNA ha migliorato significativamente l'efficienza di knockdown. Tutte e tre le combinazioni hanno mostrato una maggiore attività di soppressione rispetto alle singole sequenze di pre-microRNA non concatenate.

Una robusta soppressione è stata osservata almeno 13 giorni dopo la trasfezione. Quando un costrutto di pre-microRNA Nel che ha come bersaglio i nucleotidi da 482 a 502 e da 2461 a 2481 è stato co-trasfettato con il vettore di espressione della trasposasi nella retina del pulcino, l'espressione di Nel nell'epitelio pigmentato retinico è stata significativamente ridotta nelle cellule esprimenti GFP smeraldo al giorno embrionale 4.5. Negli embrioni di otto giorni, l'espressione di Nel è diminuita anche nelle cellule gangliari retiniche.

Al contrario, l'espressione del Nel nella retina non è stata influenzata dall'introduzione del microRNA di controllo. Seguendo questa procedura, gli effetti sulla soppressione del gene bersaglio possono essere esaminati utilizzando vari metodi come gli esami della proliferazione e della differenziazione cellulare, della morte cellulare e del tracciamento di cellule e assoni.