Name: Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Impara a preparare montaggi piatti retinici con immunofluorescenza per studiare la vascolarizzazione nel modello murino di retinopatia indotta da ossigeno. Questo metodo preserva l'integrità tissutale e consente confronti affidabili.

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Ringraziamo tutti i membri del nostro laboratorio e del laboratorio oftalmico per animali del Centro oftalmico di Zhongshan per la loro assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Prof. Chunqiao Liu per il supporto sperimentale. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Pechino, Cina), la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong, Cina (Grant No.2019A1515011347) e il progetto di costruzione di ospedali di alto livello dello State Key Laboratory of Ophthalmology presso il Centro oftalmico di Zhongshan (Grant No. 303020103; Guangzhou, provincia del Guangdong, Cina).

Tutte le procedure che prevedono l'uso di topi sono state approvate dal comitato etico sperimentale sugli animali del Centro oftalmico di Zhongshan, Sun Yat-sen University, Cina (numero autorizzato: 2020-082) e in conformità con le linee guida approvate del Comitato per la cura e l'uso degli animali del Centro oftalmico di Zhongshan e la dichiarazione dell'Associazione di ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.
1. Induzione del modello OIR del topo
<ol><li>Utilizzare topi con un tasso inferiore di malformazione congenita degli occhi, ad esempio topi C57BL / 6J, e accoppiarli con un rapporto maschio / femmina = 1: 2. Fai nascere i cuccioli lo stesso giorno e inizia a indurre il modello OIR a P7. Registra il peso corporeo dei cuccioli di topo rigorosamente prima della modellazione. NOTA: Notare il giorno di nascita come P0. Registra regolarmente il peso di ciascun mouse. Il peso corporeo dei cuccioli appena nati è molto importante durante l'induzione dell'OIR poiché la sensibilità dei topi in diversi stati all'ossigeno è diversa. Escludere i cuccioli più di 5 g a P7 per garantire risultati comparabili.</li>
	<li>Fornire un ambiente di vita adatto per le madri che allattano e i loro cuccioli, come impostare la temperatura a 23 ° C ± 2 ° C, controllare l'umidità al 40% -65%, alternare 12 ore di luce e 12 ore di buio ogni giorno, aggiungere un po 'di cotone idrofilo alla gabbia per nidificare, garantire cibo e acqua sterilizzati adeguati e tenerli in gabbie ventilate individualmente (IVC).</li>
	<li>Monitorare il livello di umidità e temperatura all'interno della camera. Controllare l'umidità tra il 40% e il 65% e mantenere la temperatura a 23 °C ± 2 °C.</li>
	<li>Controllare l'apporto di ossigeno con sensori di ossigeno, mantenere un livello di ossigeno costante al 75% e controllare la portata di ossigeno a 0,5-0,75 L / min. Mettere 50 g di calce gassata sul fondo della camera per assorbire l'eccesso di CO2 e mantenere i valori di CO2 al di sotto del 3%22.</li>
	<li>Monitorare i comportamenti delle madri che allattano come il comportamento di costruzione del nido, mordere i loro cuccioli e rifiutare l'allattamento almeno una volta al giorno. Eliminare le madri che allattano con scarsa maternità.</li>
	<li>Mettere i cuccioli P7 (maschi e femmine) e le loro madri che allattano in una camera di ossigeno in cui il livello di ossigeno è del 75% per 5 giorni a P12. Evitare l'apertura non necessaria della camera durante il periodo di induzione del modello. Assicurarsi che ci siano madri surrogate extra per la sostituzione, nel caso in cui le madri che allattano muoiano a causa di lesioni polmonari durante l'iperossia. NOTA: Per garantire la comparabilità dell'esperimento, limitare il numero a 6-8 cuccioli per ogni madre. Prestare attenzione al potenziale problema della tossicità dell'ossigeno, che causa la morte di alcune madri che allattano. I segni di danno polmonare iperossico nelle madri che allattano includono, ma non sono limitati a, frequenza respiratoria fluttuante, diminuzione dell'attività e diminuzione dell'alimentazione. Quando si verifica il fenomeno di cui sopra, eutanasia la madre che allatta con 1% di pentobarbital sodico (50 mg / kg) il più presto possibile. Preparare alcune madri surrogate, ad esempio 129S1 / SvImJ per la sostituzione e usarle solo se necessario. Non è consigliabile sostituire le madri che allattano come routine, in quanto ciò porterà a frequenti aperture di una camera di ossigeno, con conseguenti livelli di ossigeno instabili e aggressività materna.</li>
	<li>Riportare i cuccioli e le loro madri che allattano all'aria della stanza a P12 e monitorare continuamente il peso di tutti i cuccioli fino a P17. Raggruppa i cuccioli in base al peso per assicurarti che ogni gruppo sperimentale abbia una distribuzione del peso simile.</li>
</ol>2. Preparazione di supporti interi retinici e colorazione con immunofluorescenza
<ol><li>Registra il peso corporeo dei cuccioli. Sacrificare i cuccioli con un sovradosaggio di anestetico (1% pentobarbital sodico 50 mg/kg) o per inalazione di CO2 . Altri metodi di eutanasia, come la lussazione cervicale e la toracotomia bilaterale, possono essere utilizzati se necessario.</li>
	<li>Utilizzare forbici curve per rilasciare la connessione tra bulbi oculari e tessuto orbitale. Quindi, inserire una pinza curva nella parte posteriore del bulbo oculare, bloccare il nervo ottico e sollevare rapidamente l'occhio dall'orbita. Lavare i bulbi oculari in una soluzione salina tampone fosfato 1x pre-raffreddata (PBS) per rimuovere i capelli e il sangue dalla superficie dei bulbi oculari.</li>
	<li>Posizionare i bulbi oculari puliti in una provetta da microcentrifuga da 2 ml riempita con paraformaldeide (PFA) al 4% e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente su uno shaker ad una velocità di 12-15 giri al minuto (rpm) (fissazione iniziale). ATTENZIONE: La paraformaldeide è nota per essere allergenica, generalmente tossica ed estremamente citotossica. Seguire rigorosamente le istruzioni di sicurezza ed evitare l'inalazione e il contatto con la pelle.</li>
	<li>Utilizzare un piatto di coltura e mettere una goccia di 1x PBS nella parte centrale ed eseguire i seguenti passaggi al microscopio da dissezione e posizionare un bulbo oculare in questa goccia. Tenere il bulbo oculare con un paio di pinze e perforare accuratamente la cornea al limbus corneale usando un ago da siringa da 1 ml. Inserire la punta delle forbici in questo foro e tagliare con cura la cornea lungo il limbus corneale. Fare attenzione a non tagliare la retina.</li>
	<li>Rimuovere l'iride e la lente con un paio di pinze. Quindi posizionare la concia oculare rimanente nel PFA al 4% e fissare nuovamente per altri 45 minuti a temperatura ambiente su uno shaker ad una velocità di 12-15 giri / min (fissazione secondaria).</li>
	<li>Usa un piatto di coltura e metti una goccia di 1x PBS nella parte centrale. Posiziona il bulbo oculare fisso in questa goccia. Tenere il bulbo oculare con un paio di pinze. Separare delicatamente gli strati di retina e sclera usando due pinze. Posizionare la punta delle forbici tra gli strati di retina e sclera e tagliare la sclera verso il nervo ottico. Staccare la sclera dalla retina e ottenere la coppa retinica. NOTA: Tenere la coppa posteriore per il nervo ottico con una pinza, quindi utilizzare l'estremità curva di un'altra pinza per premere verso il basso sulla sclera alla testa del nervo ottico e massaggiare delicatamente la retina in un movimento ampio in avanti come alternativa per rilasciare la retina.</li>
	<li>Utilizzare una pinza per rilasciare la connessione tra i vasi ialoidi radiali e la retina periferica, bloccare la radice dei vasi ialoidi che è vicina alla testa del nervo ottico e tagliare accuratamente i vasi ialoidi.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta da 2 mL con la punta tagliata per trasferire la coppa retinica. Posizionare la coppa retinica in un pozzetto in una piastra da 48 pozzetti e lavarla per 3 x 5 minuti con 1x PBS a temperatura ambiente su uno shaker ad una velocità di 12-15 giri / min.</li>
	<li>Incubare la coppa retinica in una soluzione mista di Triton X-100 all'1% (in PBS) e siero d'asino normale al 5% (in PBS) per una notte a 4 °C.<ol><li>In alternativa, bloccare e permeabilizzare le retine a temperatura ambiente per 1 ora in alternativa. Cambiare il siero bloccante in base alla fonte dell'anticorpo secondario.</li>
	</ol></li>
	<li>Se si marca la vascolarizzazione retinica utilizzando Isolectina B4, incubare la retina in un pozzetto di 48 pozzetti con 0,1% di siero normale d'asino (400 μL) e IsolectinB4-594 (1:400) per una notte a 4 °C su uno shaker ad una velocità di 12-15 rpm. NOTA: Se si marcano i vasi sanguigni con altri marcatori, come CD31, o si etichettano altre cellule, utilizzare anticorpi primari specifici per etichettarli.</li>
	<li>Incubare la retina con anticorpi primari specifici 1:100-1:500 (in 400 μL 0,1% siero normale dell'asino) a 4 °C su uno shaker ad una velocità di 12-15 rpm per 48 h. (opzionale)</li>
	<li>Dopo essere tornati alla temperatura ambiente, lavare la retina con 0,1% PBST (0,1% TritonX-100 in PBS) per 3 x 20 minuti su uno shaker ad una velocità di 12-15 rpm.</li>
	<li>Incubare la retina con anticorpi secondari 1:1.000 (in 400 μL 0,1% siero normale dell'asina) per una notte a 4 °C su uno shaker ad una velocità di 12-15 rpm. (facoltativo)<ol><li>In alternativa, incubare la retina con anticorpi secondari ad alta affinità a temperatura ambiente per 1 ora.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubare la retina con DAPI (1:1.000) a temperatura ambiente per 20-25 minuti per marcare il nucleo. NOTA: Testare i rapporti di diluizione ottimali per tutti gli anticorpi utilizzati nelle fasi 10-11 e 13-14 nel pre-esperimento.</li>
	<li>Lavare la retina per 3 x 30 minuti con PBST allo 0,1% su uno shaker ad una velocità di 12-15 rpm a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire la coppa retinica in un vetrino pulito con l'apertura rivolta verso l'alto. Tagliare la retina radialmente a ore 3, 6, 9 e 12 da periferica a centrale tagliando a circa 1-1,5 mm di distanza dalla testa del nervo ottico.</li>
	<li>Aggiungere alcune gocce di 1x PBS per risciacquare la retina tre volte. Utilizzare carta posata all'aria per asciugare e appiattire la retina. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio (vedere Tabella dei materiali) al centro del vetrino e interrompere l'aggiunta fino a quando il diametro della goccia aumenta fino a metà del vetrino. Capovolgere rapidamente il coprislip e posizionarlo sopra la retina diffusa. Evitare di formare bolle.</li>
	<li>Scattare immagini dei supporti piatti retinici o conservare e proteggere i vetrini dalla luce a 4 °C.</li>
</ol>3. Analisi e quantificazione di supporti piatti retinici
NOTA: Per il modello murino OIR, i ricercatori registrano spesso l'area di occlusione vascolare retinica centrale e neovascolarizzazione patologica retinica periferica durante P12-P25. Studi precedenti hanno dimostrato che l'area avascolare centrale della retina raggiunge il massimo a P12 e gradualmente si restringe da P13 a P17; allo stesso tempo, la retina dei topi OIR raggiunge il picco dell'area di neovascolarizzazione intorno a P1722,29. Da P17, i neovasi regrediscono gradualmente e i vasi funzionali ricrescono nell'area avascolare. La vascolarizzazione retinica ritorna fondamentalmente alla normalità a P2533.
<ol><li>Scattare immagini di supporti piatti retinici con un microscopio a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali) con obiettivo 10x. Innanzitutto, scegli il canale DAPI e imposta la testa del nervo ottico al centro del campo visivo. Quindi, regolare gli altri canali e concentrarsi sulla vascolarizzazione superficiale della retina. Seleziona i riquadri in un software fotografico (vedi Tabella dei materiali) e imposta il numero di foto che devono essere unite. Fare clic su Avvia esperimento per catturare l'intera retina.</li>
	<li>Utilizzare un programma di elaborazione delle immagini (vedere la tabella dei materiali) per quantificare l'area di vaso-obliterazione (VO) e neovascolarizzazione (NV) dopo la colorazione con immunofluorescenza.<ol><li>Innanzitutto, fai clic sullo strumento bacchetta magica e imposta una tolleranza appropriata in base alla differenza di luminosità e sposta il cursore sullo sfondo e fai clic con il mouse. Quindi, scegliere Seleziona Inversa per ottenere un contorno di base della retina. Utilizzare lo strumento lazo per delineare ulteriormente i dettagli della retina. Utilizzando la funzione Istogramma , registrare il valore in pixel dell'intera retina e scriverlo o generare una tabella in un programma di database.</li>
		<li>Dividi l'immagine della retina in quattro quadranti. In ogni quadrante, usate lo strumento lazo per disegnare l'area VO (Figura 2A-C) e usate lo strumento bacchetta magica per selezionare l'area NV (Figura 2D-F). Attraverso le informazioni sui pixel nell'istogramma, calcolare il rapporto pixel di VO e NV per l'intera retina, ovvero la percentuale di VO o NV area relativa all'intera retina. NOTA: esiste anche una pipeline open source e completamente automatizzata per la quantificazione delle aree VO e NV nelle immagini OIR utilizzando reti neurali di deep learning (http://oirseg.org/), che fornisce un modo affidabile e che consente di risparmiare tempo per i ricercatori e unifica lo standard della quantificazione34.</li>
	</ol></li>
	<li>Registra le informazioni sui pixel in una tabella di fogli di calcolo, che è conveniente per l'analisi successiva.</li>
</ol>4. Imaging in vivo con fluorangiografia del fondo oculare (FFA)
NOTA: Per i topi OIR, sia la perfusione FITC che la colorazione con immunofluorescenza possono essere utilizzate solo per una volta a causa della morte di animali da esperimento. Rispetto a questo, uno dei vantaggi di FFA è l'osservazione dei cambiamenti dinamici dei vasi retinici del topo durante lo sviluppo e lo stato patologico in vivo35,36.
<ol><li>Pesare i cuccioli prima dell'anestesia.</li>
	<li>Anestetizzare i cuccioli mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico allo 0,3% alla dose di 30-50 mg/kg. NOTA: Per i topi entro 1 mese, prestare attenzione alle dosi di anestetico. Utilizzare concentrazioni e dosi più basse di anestetico per ridurre la morte dei topi causata dall'anestesia. Dopo che i cuccioli sono stati anestetizzati, utilizzare una piccola piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea. L'ipotermia non solo influisce sulla funzione fisiologica dei cuccioli, ma porta anche a cambiamenti nella cristallina e accelera lo sviluppo della cataratta.</li>
	<li>Utilizzare 20 μL di collirio midriatico (0,5% tropicamide + 0,5% fenilefrina cloridrato) per ogni cucciolo e attendere 5 minuti per ottenere una dilatazione della pupilla di lunga durata (Figura 3A,B).</li>
	<li>Portare i cuccioli anestetizzati davanti al dispositivo di imaging (vedi Tabella dei materiali). Tieni i cuccioli su una piccola piastra elettrica, posizionali in una posizione stabile e usa regolarmente lacrime artificiali per mantenere l'umidità nella cornea. Fare clic sulla modalità di Infrared Fundus Imaging (IR) per regolare la testa del nervo ottico al centro dello schermo. NOTA: Quando si osserva un occhio dei cuccioli, non dimenticare di proteggere l'altro occhio. Utilizzare collirio ipromellosico per evitare che la cornea si sbianca a causa della secchezza.</li>
	<li>Dopo l'iniezione intraperitoneale di 0,15 mL di soluzione di sale sodico di fluoresceina allo 0,5%, fare clic sul pulsante FA e sul pulsante Iniezione immediatamente sul pannello a sfioramento del dispositivo di imaging per avviare la temporizzazione. Registrare le immagini dopo 3 minuti quando la circolazione sanguigna della retina entra nella fase venosa e osservare la retina non meno di 6-8 minuti. NOTA: Dopo l'iniezione intraperitoneale di soluzione di sale sodico di fluoresceina, la pelle, la mucosa e l'urina dei cuccioli mostrano un evidente verde giallastro. La maggior parte della fluoresceina viene escreta dai cuccioli entro un giorno. L'iniezione della fluoresceina sodica per via intraperitoneale a giorni alterni per sei volte non causa effetti collaterali significativi37.</li>
	<li>Spostare la testa del nervo ottico al centro dell'area di acquisizione dell'immagine e scattare la prima immagine della retina centrale. Quindi, spostare la lente del dispositivo di imaging orizzontalmente sul lato nasale dell'occhio fino a quando la testa del nervo ottico si trova nel punto medio di un lato dell'area di acquisizione dell'immagine e prendere la seconda immagine. Continuare a scattare immagini della retina temporale, superiore e inferiore, rispettivamente utilizzando questo metodo (Figura 3C). NOTA: Scatta immagini con "cinque orientamenti" entro 12 minuti quando si verifica la fase di regressione. La posizione della testa del nervo ottico nell'immagine inferiore è consentita per non cadere sulla linea laterale a causa della limitata regolazione dell'angolo dell'obiettivo.</li>
	<li>Salvare le immagini e utilizzare un programma di elaborazione delle immagini per la cucitura.</li>
</ol>5. Elaborazione dell'immagine dell'angiografia del fondo oculare con fluoresceina (FFA)
<ol><li>Aprire il programma di elaborazione delle immagini e fare clic su Nuovo nel file per creare una nuova tela con uno sfondo nero (Figura 4A).</li>
	<li>Apri prima un'immagine della retina centrale nel livello di sfondo. Clicca su File e aggiungi la seconda immagine. Regola l'opacità della seconda immagine al 60%, sposta e ridimensiona la seconda immagine fino a quando le stesse parti delle due immagini si sovrappongono notevolmente. Fare clic sul pulsante Passa tra le modalità trasformazione libera e alterazione e apportare lievi regolazioni ai vasi, se necessario. Quindi, riportare l'opacità della seconda immagine al 100% (Figura 4A,B).</li>
	<li>Selezionare due immagini contemporaneamente e fare clic su Livelli di fusione automatica. Selezionate Panorama come metodo di blend e selezionate le due frasi seguenti. Fare clic su OK e completare la cucitura dell'immagine delle prime due immagini (Figura 4C, D).</li>
	<li>Prendi le prime due immagini cucite nel loro insieme, aggiungi la terza immagine e continua a fondere. Ripetere i metodi precedenti per completare la cucitura di cinque immagini (Figura 4E).</li>
	<li>Usa lo strumento Ritaglia per tagliare immagini di FFA in diversi punti temporali con dimensioni uniformi e osserva i cambiamenti dinamici della vascolarizzazione retinica da P15 a P25 sia nei cuccioli normali che OIR.</li>
</ol>6. Analisi statistica
<ol><li>Valori attuali come media ± deviazione standard (d.s.).</li>
	<li>Usa il test t di Student per confrontare due campioni indipendenti. Utilizzare One-Way ANOVA per confrontare più set di dati e combinarli con il test di Dunnett o Tukey, che è un test di confronto multiplo comunemente usato.</li>
	<li>Per i dati non normalmente distribuiti, utilizzare il test U di Mann-Whitney o il test di Kruskal Wallis. Considerare differenze statistiche significative quando P < 0,05.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La suscettibilità dei topi all'OIR è influenzata da molti fattori. I cuccioli di diverso background genetico e ceppi non possono essere confrontati. Nei topi albini BALB/c, i vasi ricrescono rapidamente nell'area VO con ciuffi neovascolari significativamente ridotti38, che portano alcune difficoltà alla ricerca. Nei topi C57BL/6, c'è un aumento del danno ai fotorecettori rispetto al ceppo murino BALB/cJ39,40. Lo stesso vale per diversi tip...

La neovascolarizzazione retinica (RNV), definita come uno stato in cui nuovi vasi patologici hanno origine da vene retiniche esistenti, di solito si estende lungo la superficie interna della retina e cresce nello spazio vitreo (o sottoretinico in alcune condizioni)1. È un segno distintivo e una caratteristica comune di molte retinopatie ischemiche, tra cui la retinopatia del prematuro (ROP), l'occlusione venosa retinica (RVO) e la retinopatia diabetica proliferativa (PDR)2.
Numerose osservazioni cliniche e sperimentali hanno indicato che l'ischemia è la causa principale della neovascolarizzazione retinica 3,4. Nella ROP, i neonati sono esposti ad ossigeno ad alto livello in incubatori chiusi per aumentare i tassi di sopravvivenza, che è anche un importante fattore per l'arresto della crescita vascolare. Dopo il trattamento, le retine dei neonati sperimentano un periodo relativamente ipossico5. Altre situazioni sono osservate nell'occlusione delle vene retiniche centrali o ramificate nella RVO e si osserva anche un danno dei capillari retinici causato dalla microangiopatia nella PDR2. L'ipossia aumenta ulteriormente l'espressione di fattori angiogenici come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) attraverso la via di segnalazione del fattore 1α indotto dall'ipossia (HIF-1α) che a sua volta guida le cellule endoteliali vascolari a crescere nell'area ipossica e formare nuovi vasi 6,7.
La ROP è una sorta di retinopatia proliferativa vascolare nei neonati pretermine e una delle principali cause di cecità infantile 8,9, che è caratterizzata da ipossia retinica, neovascolarizzazione retinica e iperplasia fibrosa10,11,12. Nel 1950, i ricercatori hanno scoperto che un'alta concentrazione di ossigeno può migliorare significativamente i sintomi respiratori dei neonati prematuri13,14. Di conseguenza, l'ossigenoterapia è stata sempre più utilizzata nei neonati prematuri in quel momento15. Tuttavia, in concomitanza con l'uso diffuso dell'ossigenoterapia nei neonati pretermine, l'incidenza della ROP è aumentata di anno in anno. Da allora, i ricercatori hanno collegato l'ossigeno alla ROP, esplorando vari modelli animali per comprendere la patogenesi di ROP e RNV16.
Nell'uomo, la maggior parte dello sviluppo vascolare retinico è completato prima della nascita, mentre nei roditori la vascolarizzazione retinica si sviluppa dopo la nascita, fornendo un sistema modello accessibile per studiare l'angiogenesi nella vascolarizzazione retinica2. Con il continuo progresso della ricerca, i modelli di retinopatia indotta da ossigeno (OIR) sono diventati modelli importanti per imitare l'angiogenesi patologica derivante dall'ischemia. Non ci sono specie animali specifiche nello studio del modello OIR e il modello è stato sviluppato in varie specie animali, tra cui gattino 17, ratto18, topo19, cucciolo di beagle 20 e zebrafish21. Tutti i modelli condividono lo stesso meccanismo con cui sono esposti all'iperossia durante lo sviluppo precoce della retina e poi restituiti all'ambiente normossico. Smith et al. hanno osservato che l'esposizione di cuccioli di topo all'iperossia da P7 per 5 giorni ha indotto una forma estrema di regressione dei vasi nella retina centrale e riportandoli all'aria della stanza a P12 ha gradualmente innescato ciuffi neovascolari, che sono cresciuti verso il corpo vitreo19. Questo era un modello di topo OIR standardizzato chiamato anche modello di Smith. Connor et al. hanno ulteriormente ottimizzato il protocollo e fornito un metodo universalmente applicabile per quantificare l'area di VO (vaso-obliterazione) e NV (neovascolarizzazione) nel 2009, che ha aumentato l'accettazione e l'utilizzo del modello22. Il modello murino OIR è ancora il modello più utilizzato ora a causa delle sue piccole dimensioni, della riproduzione veloce, del chiaro background genetico, della buona ripetibilità e dell'alto tasso di successo.
Nei topi, la vascolarizzazione retinica inizia dopo la nascita con la crescita dei vasi dalla testa del nervo ottico nella retina interna verso l'ora serrata. Durante il normale sviluppo retinico, i primi vasi retinici spuntano dalla testa del nervo ottico intorno alla nascita, formando una rete in espansione (il plesso primario) che raggiunge la periferia intorno al giorno postnatale 7 (P7) 23. Quindi i vasi iniziano a crescere nella retina per formare uno strato profondo, penetrare nella retina e stabilire una rete laminare attorno allo strato nucleare interno (INL) come nell'uomo24. Entro la fine della terza settimana postnatale (P21), lo sviluppo del plesso più profondo è quasi completato. Per il modello murino OIR, l'occlusione vascolare appare sempre nella retina centrale a causa della rapida degenerazione di un gran numero di reti vascolari immature nella regione centrale durante l'esposizione all'iperossia. Quindi, la crescita della neovascolarizzazione patologica si verifica anche nella retina medio-periferica, che è il confine dell'area di non perfusione e dell'area vascolare. Tuttavia, i vasi retinici umani si sono quasi formati prima della nascita. Per quanto riguarda i neonati prematuri, la retina periferica non è completamente vascolarizzata quando esposta all'iperossia25,26. Quindi l'occlusione vascolare e la neovascolarizzazione compaiono principalmente nella retina periferica27,28. Nonostante queste differenze, il modello OIR murino ricapitola da vicino gli eventi patologici che si verificano durante la neovascolarizzazione indotta da ischemia.
L'induzione del modello OIR può essere suddivisa in due fasi29: nella fase 1 (fase iperoxia), lo sviluppo vascolare retinico viene arrestato o ritardato con occlusione e regressione dei vasi sanguigni a seguito del declino del VEGF e dell'apoptosi delle cellule endoteliali 24,30; Nella fase 2 (fase ipossia), l'apporto di ossigeno retinico diventerà insufficiente in condizioni di aria ambiente29, che è essenziale per lo sviluppo neurale e l'omeostasi 19,31. Questa situazione ischemica di solito si traduce in neovascolarizzazione anomala non regolata.
Attualmente, il metodo di modellazione comunemente usato è l'alternanza di esposizione all'ossigeno alto/basso: le madri e i loro cuccioli sono esposti al 75% di ossigeno per 5 giorni a P7 seguiti da 5 giorni in aria ambiente fino a quando P17 ha dimostrato risultati comparabili22, che è il punto finale dell'induzione del modello murino OIR. (Figura 1). Oltre a simulare la ROP, questa neovascolarizzazione patologica mediata da ischemia può essere utilizzata anche per studiare altre malattie ischemiche della retina. Le principali misurazioni di questo modello includono la quantificazione dell'area di VO e NV, che vengono analizzate da supporti piatti retinici mediante colorazione con immunofluorescenza o perfusione FITC-destrano. Ogni topo può essere studiato solo una volta a causa dell'operazione letale. Allo stato attuale, ci sono pochi metodi per osservare continuamente i cambiamenti dinamici della vascolarizzazione retinica durante il processo di regressione vascolare e angiogenesi patologica32. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato di induzione del modello OIR, analisi di supporti piatti retinici e un flusso di lavoro di angiografia del fondo oculare (FFA) con fluoresceina sui topi che sarebbe utile per ottenere una comprensione più completa dei cambiamenti dinamici vascolari durante due fasi del modello murino OIR.

<table><tbody><tr><td>Siringa sterile da 1 mL</td><td>Solarbio</td><td>YA0550</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche e iniezione intraperitoneale</td></tr><tr><td>1& Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>&nbsp; FG701-01</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 2 ml</td><td>Corning</td><td>MCT-200-C</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche Piastre</td></tr> a <tr><td>pozzetti multipli trattate con TC</td> trasparenti <td>Corning</td><td>3548</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche Vetrini</td></tr><tr><td>per microscopio adesivi</td><td>Vari</td><td></td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CC 2019</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Per l'analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Gas di anidride carbonica</td><td>Vari</td><td></td><td>Per sacrificio</td></tr><tr><td>Vetrino di copertura</td><td>Vari</td><td></td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Pinze curve</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche Soluzione</td></tr><tr><td>colorante DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td>Per la marcatura del nucleo su montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Fluoresceina sodica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>Per in vivo imaging</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>&nbsp; Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td>Per l'acquisizione di immagini di fluorescenza di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Mezzi di montaggio</td><td>SouthernBiotech</td><td>&nbsp; 0100-01</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Idrossipropilmetilcellulosa</td><td>Maya</td><td>89161</td><td>Per l'imaging in vivo</td></tr><tr><td>Anticorpo Isolectina B4 594</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Per la marcatura della vascolarizzazione retinica su montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Topi C57/BL6J</td><td>GemPharmatech della provincia</td><td></td> di Jiangsu <td>Per l'induzione del modello OIR</td></tr><tr><td>Micro dissezione forbici-lama dritta</td><td>World Precision Instruments</td><td>503242</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>No.4 pinze diritte</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501978-6</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Abcam</td><td>ab7475</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Sensore O2</td><td>Varie</td><td></td><td>Per il monitoraggio del livello di O2</td></tr><tr><td>OxyCycler</td><td>Biospherix</td><td>A84XOV</td><td>Per l'induzione del modello OIR</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Per la fissazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodico</td><td>Vari</td><td></td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>Soda lime</td><td>Vari</td><td></td><td>Per assorbire l'eccesso di CO2 nella camera di ossigeno</td></tr><tr><td>SPECTRALIS HRA+OCT</td><td>Heidelberg</td><td>HC00500002</td><td>Per imaging in vivo</td></tr><tr><td>SPSS Statistics 22.0</td><td>IBM</td><td></td><td>Per analisi statistiche</td></tr><tr><td>Agitatore di declorazione Tansference</td><td>Kylin-Bell</td><td>ZD-2008</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Piatto di coltura tissutale (attacco basso)</td><td>Corning</td><td>3261-20EA</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche Pipette</td></tr> di <tr><td>trasferimento</td><td>Varie</td><td></td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; SLBW6818</td><td>Per la preparazione di montature piatte retiniche</td></tr><tr><td>Tropicamide</td><td>Vari</td><td></td><td>Per l'imaging in vivo</td></tr><tr><td>ZEN Software di imaging</td><td>ZEISS</td><td>Per l'acquisizione e l'esportazione</td> di <td></td> immagini</tr></tbody></table>

monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

La retinopatia indotta da ossigeno (OIR) è ampiamente utilizzata per studiare la crescita anormale dei vasi nelle malattie ischemiche della retina, tra cui la retinopatia della prematurità (ROP), la retinopatia diabetica proliferativa (PDR) e l'occlusione venosa retinica (RVO). La maggior parte degli studi OIR osserva la neovascolarizzazione retinica in punti temporali specifici; tuttavia, la crescita dinamica dei vasi nei topi vivi lungo un corso temporale, che è essenziale per comprendere le malattie dei vasi correlate all'OIR, è stata poco studiata. Qui, descriviamo un protocollo passo-passo per l'induzione del modello murino OIR, evidenziando le potenziali insidie e fornendo un metodo migliorato per quantificare rapidamente le aree di vaso-obliterazione (VO) e neovascolarizzazione (NV) utilizzando la colorazione con immunofluorescenza. Ancora più importante, abbiamo monitorato la ricrescita dei vasi in topi vivi da P15 a P25 eseguendo l'angiografia del fondo oculare con fluoresceina (FFA) nel modello murino OIR. L'applicazione di FFA al modello murino OIR ci consente di osservare il processo di rimodellamento durante la ricrescita dei vasi.

Nel modello murino OIR, il risultato più importante e basilare è la quantificazione dell'area VO e NV. Dopo aver vissuto nell'ambiente iperossia per 5 giorni da P7, la retina centrale dei cuccioli ha mostrato la più grande area di non perfusione. Sotto la stimolazione dell'ipossia in altri 5 giorni, è stata gradualmente prodotta la neovascolarizzazione retinica che ha fluorescenza più intensamente rispetto ai vasi normali circostanti. Dopo P17, il segnale di fluorescenza della neovascolarizzazione patologica è regredito ...

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione e la colorazione con immunofluorescenza dei supporti piatti retinici dei topi e l'analisi. Anche l'uso della fluorangiografia del fondo oculare (FFA) per i cuccioli di topo e l'elaborazione delle immagini sono descritti in dettaglio.

Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

Questo protocollo può aiutare i ricercatori a separare facilmente le retine dei topi e osservare i cambiamenti dinamici nella vascolarizzazione retinica del modello murino OIR. I principali vantaggi di questo metodo sono la conservazione dell'integrità delle retine separate e la possibilità che ogni topo funga da controllo proprio, il che rende i risultati più comparabili. I ricercatori che provano questo metodo per la prima volta potrebbero avere difficoltà durante l'acquisizione delle cinque immagini di orientamento perché è un po 'difficile posizionare i cuccioli nella posizione corretta.Per raccogliere il tessuto per l'intero montaggio della retina, utilizzare forbici curve per scollegare i bulbi oculari dal tessuto orbitale di un cucciolo di C57-Black / 6 eutanasia. Quindi, inserire una pinza curva nella parte posteriore del bulbo oculare, bloccando il nervo ottico e sollevando rapidamente l'occhio dall'orbita. Posizionare i bulbi oculari in PBS pre-raffreddato per rimuovere eventuali peli e sangue dalla superficie.Quando tutti i bulbi oculari sono stati raccolti, trasferire i bulbi oculari puliti in un tubo di microcentrifuga da due millilitri contenente il 4% di paraformaldeide e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente e da 12 a 15 giri al minuto. Alla fine dell'incubazione, aggiungere una goccia di PBS al centro di un piatto di coltura al microscopio da dissezione e posizionare un bulbo oculare nella goccia. Tenendo il bulbo oculare con un paio di pinze, utilizzare un ago da siringa da un millilitro per perforare accuratamente la cornea al limbus corneale.Inserire la punta di un paio di forbici nella puntura e tagliare la cornea lungo il limbus corneale, facendo attenzione a non tagliare la retina. Utilizzare una pinza per rimuovere l'iride e la lente e posizionare la concia oculare rimanente in paraformaldeide al 4% per un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente sullo shaker. Alla fine dell'incubazione, posizionare la coppa oculare fissa in una goccia fresca di PBS al centro di un nuovo piatto di coltura.Tenendo la concia oculare con un paio di pinze, utilizzare un secondo paio di pinze per separare delicatamente gli strati di retina e sclera. Posizionare la punta delle forbici tra gli strati di retina e sclera e tagliare la sclera verso il nervo ottico. Staccare la sclera dalla retina per ottenere la coppa retinica.Utilizzando una pinza, rilasciare la connessione tra i vasi ialoidi radiali e la retina periferica. Utilizzare una pipetta da due millilitri con la punta tagliata per trasferire la coppa retinica in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti per tre lavaggi di cinque minuti in PBS a temperatura ambiente sullo shaker. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la tazza in 1% Triton X-100 e 5% siero d'asino normale in PBS durante la notte a quattro gradi Celsius.Per etichettare la vascolarizzazione retinica con isolectina B4, incubare la retina in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti in 400 microlitri 0,1% siero normale d'asina integrato con isolectina B4-594 durante la notte a 4 gradi Celsius su uno shaker. Se necessario, è possibile aggiungere contemporaneamente un altro anticorpo primario. Il giorno seguente, lavare la retina con tre lavaggi di 20 minuti in 0,1% PBST sullo shaker.Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la retina con un anticorpo secondario appropriato ad alta affinità per un'ora a temperatura ambiente prima di marcare il campione con DAPI per 20-25 minuti. Alla fine dell'incubazione, lavare la retina con tre lavaggi di 30 minuti in 0,1% PBST a temperatura ambiente con agitazione. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la coppa retinica su un vetrino pulito con l'apertura rivolta verso l'alto e utilizzare il microscopio per tagliare la retina radialmente nelle posizioni a tre, sei, nove e 12 ore dalla periferia verso il centro, fino a uno a 1,5 millimetri dalla testa del nervo ottico.Risciacquare la retina tre volte con alcune gocce di PBS per lavaggio prima di utilizzare carta posata all'aria per asciugare e appiattire la retina. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio al centro del coprislip fino a quando il diametro della goccia copre metà del coprifoglio. Quindi posizionare rapidamente il lato medio di montaggio del coprislip verso il basso sulla retina diffusa.Una volta che tutti i supporti piatti retinici sono stati preparati, i campioni possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza confocale. Per l'imaging in vivo, aggiungere 20 microlitri di collirio midriatico per ottenere una dilatazione della pupilla di lunga durata. Dopo cinque minuti, posizionare i cuccioli in una posizione stabile su una piccola piastra elettrica davanti al dispositivo di imaging.Per mantenere l'umidità nelle cornee, aggiungere regolarmente lacrime artificiali durante la procedura di imaging. Quindi, fare clic su Infrared Fundus Imaging sul dispositivo per regolare la testa del nervo ottico al centro dello schermo. Iniettare per via intraperitoneale 150 microlitri di soluzione di sale sodico di fluoresceina allo 0,5% e fare immediatamente clic sui pulsanti FA e Iniezione sul pannello a sfioramento del dispositivo di imaging per avviare il timer.Dopo tre minuti, quando la circolazione sanguigna della retina è entrata nella fase venosa, acquisire la prima immagine della retina centrale. Spostare la lente del dispositivo di imaging orizzontalmente sul lato nasale dell'occhio fino a quando la testa del nervo ottico si trova nel punto medio di un lato dell'area di acquisizione dell'immagine e scattare la seconda immagine. Continua a muovere l'obiettivo e acquisisci immagini della retina temporale, superiore e inferiore allo stesso modo.Per elaborare le immagini retiniche in un programma di elaborazione delle immagini appropriato, aprire il menu File e fare clic su Nuovo per creare una nuova area di disegno con uno sfondo nero. Apri l'immagine della retina centrale. Quindi fare clic su File per aggiungere una seconda immagine.Regola l'opacità della seconda immagine al 60% e sposta e ridimensiona l'immagine fino a quando le due immagini non si sovrappongono. Fate clic su Passa tra le modalità Trasformazione libera (Free Transform) e alterazione (Warp Mode) e, se necessario, apportate lievi regolazioni ai recipienti. Quindi impostate nuovamente l'opacità della seconda immagine su 100%Selezionare entrambe le immagini e fare clic su Livelli di fusione automatica.Selezionare Panorama come metodo di fusione, quindi selezionare le caselle Toni e colori senza soluzione di continuità e Aree trasparenti di riempimento sensibili al contenuto. Fare clic su OK per completare l'unione delle prime due immagini. Quindi, aggiungi la terza immagine e unisci questa immagine alle prime due immagini come dimostrato fino a quando tutte e cinque le immagini di una singola retina sono state cucite.Quando tutte le immagini dell'analisi sono state elaborate, utilizzare lo strumento di ritaglio per ritagliare le immagini FFA a una dimensione uniforme per facilitare l'osservazione dei cambiamenti nelle dinamiche vascolarizzanti retiniche in diversi punti temporali dello sviluppo. Dopo cinque giorni di esposizione all'iperossia, le retine centrali dei cuccioli postnatali del giorno 12 mostrano un'ampia area di non perfusione. Dopo il trasferimento a cinque giorni di condizioni ipossiche, le retine gradualmente neovascolarizzano, mostrando un aumento del segnale di fluorescenza più forte di quello osservato nei vasi normali circostanti.Dopo il giorno 17 postnatale, la neovascolarizzazione patologica regredisce rapidamente e la retina mostra un aspetto completamente normale entro il giorno 25 postnatale. Una buona ripetibilità e stabilità del modello di retinopatia indotta dall'ossigeno può essere ottenuta controllando le dimensioni della cucciolata e l'aumento di peso postnatale dei cuccioli. Come osservato, la vaso-obliterazione raggiunge tipicamente il picco al giorno postnatale 12 e scompare al giorno postnatale 25, mentre la neovascolarizzazione raggiunge il picco al giorno postnatale 17 e regredisce entro il giorno postnatale 25.Nel giorno postnatale da 15 a 25 topi con retinopatia indotta da ossigeno, il diametro dei vasi sanguigni retinici aumenta e diventa altamente tortuoso rispetto a quello osservato per le retine dei topi normali. Le pinze della mano sinistra svolgono principalmente un ruolo di supporto. Fare attenzione a non spremere il bulbo oculare, che può deformarlo o romperlo.

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