Ottenere uno screening efficiente dei frammenti presso l'impianto XChem di Diamond Light Source

L'impianto XChem di Diamond Light Source fornisce uno screening di routine di frammenti grafici di cristalli su larga scala, supportando l'intero processo di deposizione del cristallo. La cristallografia a raggi X è una parte essenziale del kit di strumenti FBDD. È abbastanza sensibile da identificare i leganti deboli e fornisce direttamente informazioni strutturali sulle interazioni a livello molecolare.

La scoperta di farmaci basata su frammenti è una strategia ampiamente utilizzata per la scoperta di lead. Ha consegnato sei farmaci per uso clinico e più di 50 molecole sono state avanzate agli studi clinici. L'impatto dei progressi e dell'efficienza forniti dalla piattaforma XChem rispetto ai metodi tradizionali di ammollo, raccolta dati e metodi di analisi è stato dimostrato al meglio visivamente.

Inizia scegliendo i cristalli e la posizione del composto. Apri TextRank da un PC e seleziona il vassoio di cristallo, dall'elenco in basso a destra o digitando il codice a barre nella casella in alto a sinistra. Selezionare il formato dell'immagine corretto e la vista a pozzetto singolo.

Per aggiungere solvente o composti a una goccia senza colpire il cristallo, fare clic con il pulsante destro del mouse all'interno della goccia, ma lontano dal cristallo quando viene trovato un cristallo adatto per un esperimento mentre ci si sposta tra le immagini di rilascio. Aprire il software Echo e selezionare nuovo per erogare le soluzioni utilizzando l'erogatore acustico. Scegliere la piastra del pozzetto sorgente corretta e la classe del liquido.

Assicurarsi che sia selezionato il tipo di piastra corretto come piastra di destinazione. Quindi seleziona la casella personalizzata e continua. Selezionare Importa e scegliere il file batch pertinente.

Quindi completare i passaggi di importazione come richiesto dal software. Utilizzare le mappe delle piastre per verificare la soluzione da erogare e le posizioni di destinazione. Quindi eseguire il protocollo seguendo le istruzioni man mano che vengono visualizzate.

Le soluzioni della piastra di origine verranno erogate nelle gocce di cristallo scelte. Conservare la piastra nell'incubatrice per il tempo necessario. Per raccogliere i cristalli utilizzando il dispositivo semiautomatico di raccolta dei cristalli, premere il pulsante di avvio del flusso di lavoro per passare alla prima posizione del pozzetto selezionata.

Se il cristallo è sopravvissuto, montalo nell'anello e immergilo nell'azoto liquido, posizionandolo nella posizione uno del primo disco della lista. Selezionare la descrizione appropriata per il cristallo dall'interfaccia. Se la goccia è un ammollo composto, registrare la descrizione dello stato composto.

Se il cristallo è stato montato correttamente, selezionare montato, altrimenti selezionare fail. Una volta che i cristalli sono stati raccolti, porta i dischi allo scanner di codici a barre e mettili nel supporto uno alla volta per scansionare i codici a barre del disco e del pin. Una volta completata la scansione, posizionare i coperchi sui dischi e conservarli in un contenitore di azoto liquido.

Per ricordare i campioni centrati in modo errato, osservare la vista del cambio campione in ISPyB e selezionare la classificazione in base alla risoluzione AP per classificare i campioni in base alla risoluzione elaborata automaticamente in una graduazione di colore dal verde al rosso. Fare clic sui campioni per verificare la presenza di eventuali campioni rossi o gialli. Quindi controlla le istantanee del cristallo per vedere se il cristallo è stato centrato.

Per recuperare e analizzare i risultati dell'elaborazione automatica di Diamond tramite XChem Explorer o XCE, in un terminale vai alla sottocartella di elaborazione e usa l'alias XCE per aprire XChem Explorer. Selezionare il pulsante Aggiorna tabelle dall'origine dati nella scheda Panoramica per aggiornare il riepilogo dei dati sperimentali. Nella scheda delle impostazioni, seleziona la directory di raccolta dati, apri la scheda dei set di dati.

Scegliere la destinazione dal menu a discesa Seleziona destinazione, selezionare Ottieni nuovi risultati dall'elaborazione automatica dal menu a discesa dei set di dati e fare clic su Esegui. Per calcolare le mappe iniziali utilizzando Dimple, apri la scheda mappe, scegli il modello di riferimento dal menu a discesa e seleziona i set di dati desiderati seguiti da Esegui Dimple sui file MTZ selezionati. Per generare vincoli di ligando, selezionare i set di dati desiderati seguiti da creare un file SCF o PDB o PNG dei composti selezionati dall'elenco a discesa delle mappe e dei vincoli.

Per identificare i risultati utilizzando Panda, seleziona la scheda Pandas, assicurati che la directory di output sia definita correttamente ed esegui panda. Analizza dal menu a discesa Identificazione hit. Per analizzare i risultati identificati da Panda, esegui panda.

Ispeziona dal menu a discesa Identificazione hit. Per aprire Coot con il pannello di controllo Panda. Carica le mappe medie e 2mFo-DFc da Dimple per il confronto con la mappa degli eventi e il modello.

Una volta che un ligando è stato adattato, fare clic su Unisci ligando con il modello e salvare il modello prima di passare a un altro evento per evitare di perdere le modifiche apportate al modello di stato associato. Annotare l'evento di associazione utilizzando il campo di commento dell'evento e annotare i siti di associazione utilizzando le informazioni sul sito di record. Una volta che tutti i ligandi vitali sono stati modellati, uniti e salvati in base alla mappa degli eventi, chiudere panda.inspect.

Esporta i modelli di ispezione Panda nella directory del progetto e avvia un primo ciclo di perfezionamento per i set di dati selezionati, e il perfezionamento sarà ora visibile nella scheda di perfezionamento. La pipeline XChem per lo screening dei frammenti mediante cristallografia a raggi X è stata ampiamente semplificata, consentendone l'adozione da parte della comunità scientifica. Questo grafico dimostra l'adozione e il consolidamento del programma utente dal 2015 al 2019 con la creazione di gruppi di allocazione dei blocchi nel 2019 e la resilienza della piattaforma durante la pandemia di COVID-19 nel 2020.

Le campagne di successo producono una mappa tridimensionale dei potenziali siti di interazione sulla proteina bersaglio. Un risultato tipico è lo screening XChem della proteasi principale di SARS-CoV-2. I siti di interesse noti, come i siti attivi enzimatici e le sottotasche, sono mostrati in giallo.

I siti allosterici putativi, come quelli coinvolti nelle interazioni proteina-proteina, sono mostrati in magenta e le interfacce di impacchettamento dei cristalli, generalmente considerate falsi positivi, sono mostrate in verde. Storicamente, l'uso della cristallografia come screening di frammenti primari è stato difficile. Questo studio ha documentato i protocolli della pipeline XChem dalla preparazione del campione alle strutture finali.

Lo screening dei frammenti cristallografici è complementare ad altre tecniche biofisiche ed è solitamente essenziale per far progredire i frammenti in composti guida. Può essere applicato a qualsiasi classe target per la scoperta di farmaci.