Name: Ottenere uno screening efficiente dei frammenti presso limpianto XChem di Diamond Light Source (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Scopri il processo XChem per lo screening di frammenti cristallografici presso Diamond Light Source. Questo metodo ottimizza la scoperta di farmaci basata su frammenti attraverso cristallografia a raggi X ad alta efficienza.

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Questo lavoro rappresenta un grande sforzo congiunto tra il Diamond Light Source e lo Structure Genomic Consortium. Gli autori desiderano ringraziare i vari gruppi di supporto di Diamond e il gruppo MX per il loro contributo all'automazione della linea di luce i04-1 e per aver fornito pipeline di raccolta dati e di elaborazione automatica semplificate, che sono comunemente eseguite su tutte le linee di luce MX. Vorrebbero anche ringraziare il gruppo SGC PX per la loro resilienza essendo i primi utenti a testare la configurazione ed Evotec per essere stato il primo serio utente industriale. Questo lavoro è stato supportato da iNEXT-Discovery (Grant 871037) finanziato dal programma Horizon 2020 della Commissione Europea.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Il processo descritto in questo documento è stato ampiamente testato dalla comunità degli utenti e l'adattabilità dei protocolli qui descritti è fondamentale per gestire l'ampia varietà di progetti tipicamente incontrati sulla piattaforma. Tuttavia, sono necessari alcuni prerequisiti del sistema cristallino.
Per qualsiasi campagna di screening dei frammenti effettuata utilizzando la cristallografia a raggi X, è fondamentale un sistema cristallino riproducibile e robusto. Poiché il protocollo XChem standard prevede l'aggiunta del frammento direttamente alla goccia di cristallo, l'ottimizzazione dovrebbe concentrarsi sul numero di gocce contenenti cristalli di alta qualità piuttosto che sul numero totale di cristalli. Se le gocce contengono più cristalli, sono effettivamente ridondanti anche se possono alleviare il processo di raccolta. Inoltre, il trasferimento del protocollo di cristallizzazione dall'istituto di provenienza alle strutture in loco può essere difficile. Ciò si ottiene generalmente al meglio utilizzando la semina dei cristalli per promuovere la nucleazione riproducibile54 e, pertanto, una buona pratica è che gli utenti forniscano scorte di semi insieme alle loro proteine e soluzioni di cristallizzazione.
Per garantire una buona solubilità e supporto del composto, le elevate concentrazioni di ammollo destinate a guidare il legame di frammenti deboli, librerie di frammenti sono fornite in solventi organici, in particolare DMSO e glicole etilenico. La fornitura di due diversi solventi offre agli utenti un'alternativa per i cristalli che non tollerano affatto il DMSO, o in cui occlude il legame dei frammenti in un sito di interesse. Gli utenti possono fornire librerie alternative in tampone acquoso: i composti erogheranno bene a condizione che siano completamente disciolti e formattati in piastre compatibili con il robot di erogazione del liquido.
Per i progetti in cui non è possibile trovare un solvente organico appropriato che solubilizzi la libreria e sia tollerato dal sistema cristallino, una procedura alternativa consiste nell'utilizzare composti essiccati come stabilito in BESSY55.
Nella comunità, c'è una questione di lunga data sulla possibilità di immergere i composti in cristalli cresciuti in condizioni di cristallizzazione contenenti alte concentrazioni di sale. In pratica, si osserva una maggiore precipitazione dei composti e una rapida formazione di cristalli di sale nella fase di raccolta, che viene ridotta applicando un ambiente umido intorno all'area di raccolta. Generalmente, le campagne di screening in sistemi cristallini da condizioni di cristallizzazione ad alto contenuto salino danno un tasso di successo paragonabile a quello in condizioni di basso sale.
Le fasi iniziali del processo XChem (test di tolleranza ai solventi e pre-screening) sono esperimenti relativamente rapidi e su piccola scala, ma consentono di prendere una chiara decisione di scelta o di non scelta per il progetto. La cosa più dolorosa è che sarà necessario trovare sistemi cristallini alternativi se nessuno dei due solventi è tollerato o se il pre-screening si traduce in un tasso di successo molto basso. Al contrario, se hanno successo, i risultati informano direttamente la condizione di ammollo da utilizzare per l'esperimento di screening e la migliore strategia per la raccolta dei dati. Poiché la qualità dei dati, in particolare la risoluzione, influenzerà la qualità della densità elettronica per l'identificazione e l'analisi dei colpi, l'obiettivo è quello di immergere alla massima concentrazione possibile di composti che non abbia un effetto deleterio sulla qualità della diffrazione (con la maggior parte dei set di dati (~80%) che diffragisce a una risoluzione di 2,8 Å o superiore).
Il processo di analisi dei dati è semplificato all'interno di XChemExplorer, che si basa sul software PanDDA per il rilevamento di leganti deboli e consente agli utenti di visualizzare e rivedere rapidamente i risultati della campagna di screening. XChemExplorer importa i risultati dell'elaborazione dei dati dai pacchetti disponibili su Diamond (DIALS 16, autoPROC30, STARANISO31 e Xia214) con limiti di risoluzione determinati dal metodo standard per ciascun pacchetto (ad esempio, CC1/2 = 0.3). Per impostazione predefinita, la selezione del set di dati si basa su un punteggio calcolato da I/sigI, completezza e una serie di riflessioni univoche, ma è possibile selezionare risultati di elaborazione specifici per l'uso sia a livello globale che per singoli campioni25. I dati sono inoltre esclusi dall'analisi da parte di PanDDA in base a criteri quali la risoluzione,l'assenza di R e la differenza nel volume unitario della cella tra i dati di riferimento e quelli di destinazione (i valori predefiniti sono rispettivamente 3,5 Å, 0,4 e 12%), in modo che i cristalli scarsamente diffranti, centrati o indicizzati in modo errato non influiscano sull'analisi.
L'algoritmo PanDDA sfrutta il numero considerevole di set di dati raccolti durante una campagna di frammento per rilevare ligandi di occupazione parziale che non sono visibili nelle mappe cristallografiche standard. Inizialmente, PanDDA utilizza i dati raccolti durante i test di tolleranza al solvente e le fasi di pre-screening per preparare una mappa di densità media che viene poi utilizzata per creare un modello dello stato fondamentale. Poiché questo modello verrà utilizzato per tutte le fasi successive dell'analisi, è fondamentale che rappresenti accuratamente la proteina non ligata nelle condizioni utilizzate per lo screening dei frammenti. PanDDA utilizza quindi un'analisi statistica per identificare i ligandi legati, generando una mappa degli eventi per lo stato legato del cristallo. Una mappa degli eventi viene generata sottraendo la frazione non legata del cristallo dal set di dati di occupazione parziale e presenta ciò che verrebbe osservato se il ligando fosse legato a piena occupazione. Anche i frammenti che appaiono chiari nelle mappe convenzionali2mF o-DF c potrebbero essere modellati in modo errato se le mappe degli eventi non vengono consultate32. Sebbene PanDDA sia un metodo potente per identificare i set di dati che differiscono dalle mappe medie (che di solito è indicativo dell'associazione dei frammenti) e vengano fornite metriche come RSCC, RSZD, rapporto del fattore B e RMSD durante il perfezionamento a vantaggio dell'utente, l'utente è in ultima analisi responsabile di decidere se la densità osservata rappresenta accuratamente il ligando atteso e la conformazione più adatta.
A seguito dell'analisi e del perfezionamento dei dati, è possibile per tutti gli utenti depositare contemporaneamente più strutture nella Protein Data Bank (PDB) utilizzando XChemExplorer. Per ogni frammento-schermo, vengono effettuate due deposizioni di gruppo. La prima deposizione contiene tutti i modelli associati a frammenti, con coefficienti per il calcolo delle mappe degli eventi PanDDA inclusi nei file MMCIF. La seconda deposizione fornisce il modello di stato fondamentale che lo accompagna, insieme ai fattori di struttura misurati di tutti i set di dati dell'esperimento: questi dati possono essere utilizzati per riprodurre l'analisi PanDDA e per sviluppare algoritmi futuri. Per quanto riguarda le strutture degli hit, quando l'occupazione dei frammenti è bassa, l'affinamento è meglio comportato se i modelli sono un composito delle strutture dello stato fondamentale legate al ligando e confondenti32; Ciononostante, la pratica è quella di depositare solo le frazioni dello stato limitato, poiché i modelli compositi completi sono in generale complessi e difficili da interpretare. Di conseguenza, alcuni indicatori di qualità ricalcolati dal PPB (in particolare, R/Rfree) sono talvolta leggermente elevati. È anche possibile fornire tutti i dati grezzi utilizzando piattaforme come Zenodo56, anche se questo non è attualmente supportato dalla pipeline XChem.
Nel complesso, dalla sua entrata in funzione nel 2016, i ligandi di frammento sono stati identificati in oltre il 95% dei bersagli utilizzando questa procedura. L'esperienza dei numerosi progetti che XChem ha sostenuto è stata distillata nelle migliori pratiche per la preparazione dei cristalli33, mentre è stata sviluppata una libreria di frammenti che ha implementato il concetto di equilibrio per aiutare la progressione dei frammenti29, contribuendo anche a stabilire la pratica di rendere pubblica la composizione della libreria. La piattaforma ha dimostrato l'importanza di un'infrastruttura ben mantenuta e di processi documentati, descritti in dettaglio qui, e ha permesso di valutare altre librerie di frammenti57,58, di confrontare le librerie48 e di informare la progettazione della libreria collaborativa EUOpenscreen-DRIVE 59,60.

La Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) è una strategia ampiamente utilizzata per la scoperta di piombi e, dalla sua comparsa 25 anni fa, ha fornito quattro farmaci per uso clinico e più di 40 molecole sono state avanzate agli studi clinici 1,2,3. I frammenti sono piccole entità chimiche di solito con un peso molecolare di 300 Da o meno. Sono selezionati per la loro bassa complessità chimica, che fornisce buoni punti di partenza per lo sviluppo di inibitori altamente efficienti dal ligando con eccellenti proprietà fisico-chimiche. Le loro dimensioni significano che campionano il paesaggio di legame delle proteine in modo più completo rispetto alle librerie di composti più grandi simili a farmaci o piombo, e quindi rivelano anche punti caldi e siti allosterici putativi. In combinazione con le informazioni strutturali, i frammenti forniscono una mappa dettagliata delle potenziali interazioni molecolari tra proteina e ligando. Tuttavia, rilevare e convalidare in modo affidabile tali entità, che tendono a legarsi debolmente alla proteina bersaglio, richiede una serie di metodi di screening biofisico robusti e sensibili come la risonanza plasmonica di superficie (SPR), la risonanza magnetica nucleare (NMR) o la calorimetria di titolazione isotermica (ITC)4,5.
La cristallografia a raggi X è una parte essenziale del toolkit FBDD: è abbastanza sensibile da identificare i leganti deboli e fornisce direttamente informazioni strutturali sulle interazioni a livello molecolare. È complementare ad altri screening biofisici e di solito è essenziale per far progredire i frammenti in composti di piombo; richiede sistemi cristallini di alta qualità, il che significa che la cristallizzazione è altamente riproducibile e i cristalli si diffrattano idealmente con una risoluzione migliore di 2,8 Å.
Storicamente, è stato molto difficile utilizzare la cristallografia come screening del frammento primario 6,7,8, sia nel mondo accademico che nell'industria. Al contrario, i sincrotroni hanno ottenuto miglioramenti dell'ordine di grandezza nella robotica, nell'automazione 9,10,11 e nella tecnologia dei rivelatori 12,13 e, combinati con una potenza di calcolo e algoritmi di elaborazione dei dati altrettanto accelerati14,15,16, i set di dati di diffrazione completi possono essere misurati in pochi secondi e un gran numero di essi completamente incustoditi, come sperimentato da LillyCAT7 e successivamente MASSIF17,18 (European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)). Ciò ha portato i sincrotroni a sviluppare piattaforme altamente semplificate per rendere accessibile a un'ampia comunità di utenti lo screening dei frammenti a base di cristalli come schermo primario (XChem at Diamond; CrystalDirect presso EMBL/ESRF19; BESSY all'Helmholtz-Zentrum di Berlino20; FragMax a MaxIV21).
Questo articolo documenta i protocolli che costituiscono la piattaforma XChem per lo screening dei frammenti mediante cristallografia a raggi X, dalla preparazione del campione ai risultati strutturali finali degli hit modellati in 3D. La pipeline (Figura 1) ha richiesto lo sviluppo di nuovi approcci per l'identificazione dei cristalli 22, l'ammollo 23 e la raccolta 24, nonché un software di gestione dei dati25 e un approccio algoritmico per l'identificazione dei frammenti 26 che è ora ampiamente utilizzato nella comunità. La tecnologia di raccolta dei cristalli è ora venduta da un fornitore (vedi Tabella dei materiali), e la disponibilità aperta degli strumenti ha permesso ad altri sincrotroni di adattarli per creare piattaforme equivalenti21. I progetti in corso riguardano l'analisi dei dati, il completamento del modello e la diffusione dei dati attraverso la piattaforma Fragalysis27. Il laboratorio di preparazione dei campioni è adiacente alla linea di luce I04-1, semplificando la logistica del trasferimento di centinaia di campioni congelati alla linea di luce e il tempo di trasmissione dedicato su I04-1 consente un rapido feedback a raggi X per guidare la campagna.
XChem è parte integrante del programma utente di Diamond, con due chiamate all'anno (inizio aprile e ottobre). Il processo di revisione paritaria è stato perfezionato in consultazione con esperti nella scoperta di farmaci provenienti dal mondo accademico e industriale. Insieme a un forte caso scientifico, il processo di proposta28 richiede ai candidati di autovalutare non solo la prontezza del sistema cristallino, ma anche la loro esperienza nei metodi biochimici e biofisici ortogonali e la capacità di far progredire i risultati di screening attraverso la chimica di follow-up. Anche le modalità di accesso si sono evolute per accogliere la comunità multidisciplinare degli utenti:
Il livello 1 (progetto singolo ) riguarda i progetti in fase esplorativa e non è necessario che siano in atto strumenti di convalida dei riscontri positivi (strumenti biofisici o biochimici) e strategie di follow-up. Se accettato, al progetto viene concesso un numero ridotto di turni di beamtime, sufficienti per la prova di concetto.
Il livello 2 (progetto singolo) è per progetti ben convalidati e richiede l'adozione di strumenti a valle e strategie di follow-up. Se accettato, al progetto viene assegnato un tempo di trasmissione sufficiente per una campagna di screening completo dei frammenti. I singoli progetti (Tier 1 o Tier 2) devono essere completati entro i 6 mesi del periodo di assegnazione (da aprile a settembre o da ottobre a marzo).
Il Block Allocation Group (BAG) è per un consorzio di gruppi e progetti, in cui è in atto un solido processo di selezione degli obiettivi e di definizione delle priorità all'interno del BAG, insieme a una chiara pipeline di follow-up. I BAG devono avere almeno un esperto (superuser) completamente formato XChem, che coordini le loro attività con lo staff Diamond e formi i membri del BAG. Il numero assegnato di turni di beamtime è definito dal numero di progetti scientificamente solidi nel BAG e viene rivalutato per periodo di assegnazione sulla base del rapporto del BAG. L'accesso è disponibile per 2 anni.
L'esperimento XChem è diviso in tre fasi, con un punto di decisione per ciascuna di esse: test di tolleranza al solvente, pre-screening e schermata principale (Figura 2). Il test di tolleranza al solvente aiuta a definire i parametri di ammollo, la quantità di solvente (DMSO, glicole etilenico o altri crioprotettori se necessario) che il sistema cristallino può tollerare e per quanto tempo. Le concentrazioni di solvente variano in genere dal 5% al 30% in almeno due punti temporali. I dati di diffrazione vengono raccolti e confrontati con la diffrazione di base del sistema cristallino; Questo determinerà i parametri di ammollo per la fase successiva. Per il pre-screening, 100-150 composti vengono immersi utilizzando le condizioni determinate nel test del solvente e il suo scopo è confermare che i cristalli possono tollerare i composti in tali condizioni. Se necessario, il crioprotettore viene successivamente aggiunto alle gocce già contenenti i frammenti. I criteri di successo sono che l'80% o più dei cristalli sopravviva abbastanza bene da produrre dati di diffrazione di buona e costante qualità; Se questo fallisce, le condizioni di ammollo vengono solitamente riviste modificando il tempo di ammollo o la concentrazione del solvente. Dopo un pre-screening di successo, il resto dei composti scelti per l'esperimento può essere impostato utilizzando i parametri finali.
La libreria DSI-poised (vedi Tabella dei Materiali) è stata appositamente progettata per consentire una rapida progressione di follow-up utilizzando la chimica in bilico29 ed è stata la libreria di punta della struttura. È disponibile per gli utenti a una concentrazione di 500 mM in DMSO. Gli utenti accademici possono anche accedere ad altre biblioteche fornite dai collaboratori (oltre 2.000 composti in totale) a concentrazioni di 100-500 mM in DMSO (un elenco completo può essere trovato sul sito web28). Gran parte della collezione complessiva è disponibile anche in glicole etilenico, per sistemi cristallini che non tollerano il DMSO. Gli utenti possono anche portare le proprie librerie, purché in piastre compatibili con il sistema di gestione dei liquidi acustici (vedi Tabella dei materiali).
Per tutte e tre le fasi dell'esperimento (caratterizzazione del solvente, pre-screening o schermo intero), le seguenti procedure di preparazione del campione sono identiche (Figura 3): selezione del luogo di erogazione del composto attraverso l'imaging e il targeting delle gocce di cristallizzazione con TeXRank22; dosaggio in gocce utilizzando il sistema di erogazione acustica del liquido sia per il solvente che per i composti23; raccolta efficiente dei cristalli con il Crystal shifter24; e caricamento delle informazioni sui campioni nel database delle linee di luce (ISPyB). L'interfaccia corrente per la progettazione e l'esecuzione degli esperimenti è un'applicazione basata su Excel (SoakDB), che genera i file di input necessari per le diverse apparecchiature della piattaforma e tiene traccia e registra tutti i risultati in un database SQLite. Gli scanner di codici a barre vengono utilizzati in varie fasi del processo per aiutare a tracciare i campioni e questi dati vengono aggiunti al database.
I dati di diffrazione vengono raccolti in modalità non presidiata utilizzando un tempo di fascio dedicato sulla linea di luce I04-1. Sono disponibili due modalità di centraggio, vale a dire ottica e basata sui raggi X17. Per i cristalli a forma di ago e bastoncino, si consiglia la centratura dei raggi X, mentre i cristalli più grossi generalmente supportano la modalità ottica, che è più veloce e, quindi, consente di raccogliere più campioni nel tempo di fascio assegnato. A seconda della risoluzione dei cristalli (stabilita prima di entrare nella piattaforma) la raccolta dei dati può essere di 60 s o 15 s di esposizione totale. La raccolta dei dati durante la fase di test del solvente di solito informa quale combinazione funzionerà meglio con le prestazioni della linea di luce I04-1.
Il grande volume di analisi dei dati viene gestito tramite XChemExplorer (XCE)25, che può essere utilizzato anche per avviare la fase di identificazione dei risultati utilizzando PanDDA26. XCE è uno strumento per la gestione dei dati e il flusso di lavoro che supporta l'analisi su larga scala delle strutture proteina-ligando (Figura 4); legge tutti i risultati dell'elaborazione automatica dai dati raccolti presso Diamond Light Source (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 e STARANISO31) e seleziona automaticamente uno dei risultati in base alla qualità dei dati e alla somiglianza con un modello di riferimento. È importante che il modello sia rappresentativo del sistema cristallino utilizzato per lo screening XChem e che includa tutte le acque o altre molecole di solvente, nonché tutti i cofattori, i ligandi e le conformazioni alternative visibili nei cristalli imbevuti solo di solvente. La qualità di questo modello di riferimento avrà un impatto diretto sulla quantità di lavoro necessaria durante la fase di costruzione e perfezionamento del modello. PanDDA viene utilizzato per analizzare tutti i dati e identificare i siti di associazione. Allinea le strutture a una struttura di riferimento, calcola le mappe statistiche, identifica gli eventi e calcola le mappe degli eventi26,32. Nel paradigma PanDDA, non è né necessario né auspicabile costruire il modello cristallografico completo; Ciò che deve essere modellato è solo la vista della proteina in cui un frammento è legato (il modello dello stato legato), quindi l'attenzione deve essere solo sulla costruzione del ligando e dei residui circostanti/molecole di solvente secondo la mappa degli eventi32.

<table><tbody><tr><td>Libreria di frammenti DSI-poised</td><td>Enamine</td><td>DSI-896</td><td></td></tr><tr><td>Echo serie 550 e 650</td><td>Sistema di erogazione acustica</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastre</td><td>Echo Beckman-Coulter</td><td>001-12380; 001-8768; 001-6025</td><td>Micropiastre da 1536 pozzetti e 384 pozzetti</td></tr><tr><td>Shifter</td><td>Oxford Lab Technology</td><td></td><td>dispositivo di raccolta</td></tr><tr><td>Micropiastra centrifuga con rotore oscillante</td><td>Centrifuga per micropiastre</td><td>Sigma</td><td>modello 11121</td></tr><tr><td>Piastre di cristallizzazione a 3 gocce</td><td>Swissci</td><td>3W96T-UVP</td><td>Piastre di cristallizzazione</td></tr><tr><td>Imager per piastre Formulatrix e software Rockmaker</td> Dispositivo <td>di imaging per piastre di cristallizzazione</td> <td>Formulatrix</td><td></td></tr></tbody></table>

ottenere uno screening efficiente dei frammenti presso l'impianto xchem di diamond light source

Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source

Nella scoperta di farmaci basati su frammenti, centinaia o spesso migliaia di composti più piccoli di ~300 Da vengono testati contro la proteina di interesse per identificare entità chimiche che possono essere sviluppate in potenti candidati farmaci. Poiché i composti sono piccoli, le interazioni sono deboli e il metodo di screening deve quindi essere altamente sensibile; Inoltre, le informazioni strutturali tendono ad essere cruciali per l'elaborazione di questi colpi in composti simili al piombo. Pertanto, la cristallografia proteica è sempre stata una tecnica gold standard, ma storicamente troppo impegnativa per trovare un uso diffuso come screening primario.
Gli esperimenti iniziali di XChem sono stati dimostrati nel 2014 e poi testati con collaboratori accademici e industriali per convalidare il processo. Da allora, un grande sforzo di ricerca e un significativo tempo di trasmissione hanno semplificato la preparazione dei campioni, sviluppato una libreria di frammenti con possibilità di follow-up rapido, automatizzato e migliorato la capacità della linea di luce I04-1 per la raccolta di dati non presidiati e implementato nuovi strumenti per la gestione dei dati, l'analisi e l'identificazione dei risultati.
XChem è ora una struttura per lo screening di frammenti cristallografici su larga scala, che supporta l'intero processo di deposizione dei cristalli ed è accessibile agli utenti accademici e industriali di tutto il mondo. Dal 2016 il programma accademico peer-reviewed è stato sviluppato attivamente per accogliere progetti di portata scientifica il più ampia possibile, compresi progetti ben convalidati ed esplorativi. L'accesso accademico è assegnato attraverso inviti semestrali per proposte sottoposte a revisione paritaria e il lavoro proprietario è organizzato dal gruppo di collegamento industriale di Diamond. Questo flusso di lavoro è già stato applicato di routine a oltre un centinaio di bersagli provenienti da diverse aree terapeutiche e identifica efficacemente i leganti deboli (tasso di successo dell'1%-30%), che fungono sia da punti di partenza di alta qualità per la progettazione di composti che forniscono ampie informazioni strutturali sui siti di legame. La resilienza del processo è stata dimostrata dal continuo screening dei bersagli di SARS-CoV-2 durante la pandemia di COVID-19, compreso un turn-around di 3 settimane per la proteasi principale.

La pipeline XChem per lo screening dei frammenti mediante cristallografia a raggi X è stata ampiamente semplificata, consentendone l'adozione da parte della comunità scientifica (Figura 5). Questo processo è stato validato su oltre 150 campagne di screening con un tasso di successo variabile tra l'1% e il 30G,48,49,50,51,52 e da molti utenti abituali. I sistemi cristallini che non sono adatti (bassa risoluzione, incoerenti nella cristallizzazione o nella qualità della diffrazione) o che non tollerano né il DMSO né il glicole etilenico vengono eliminati all'inizio del processo, risparmiando tempo, fatica e risorse. Le campagne di successo forniscono una mappa tridimensionale dei potenziali siti di interazione sulla proteina bersaglio; un risultato tipico è lo screening XChem della proteasi principale di SARS-CoV-2 (Figura 6). Tipicamente, i frammenti si trovano in: (a) siti di interesse noti, come siti enzimatici attivi e sottotasche48; (b) siti allosterici putativi, ad esempio, nelle interazioni proteina-proteina53; (c) interfacce di impacchettamento a cristalli, generalmente considerate come falsi positivi (Figura 6). Questi dati strutturali forniscono generalmente una base per la fusione, il collegamento o la crescita di frammenti in piccole molecole simili al piombo 1,3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig01.jpg"> Figura 1: Pipeline XChem. La piattaforma è rappresentata schematicamente dalla proposta di progetto attraverso la preparazione del campione, la raccolta dei dati e l'identificazione dei risultati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig02.jpg"> Figura 2: Strategia di screening. Il flusso di lavoro indica lo scopo di ogni attività cardine, i requisiti dell'esperimento e i punti decisionali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig03.jpg"> Figura 3: Flusso di lavoro per la preparazione dei campioni. I passaggi critici per la preparazione del campione sono rappresentati con le informazioni di ogni passaggio registrate in un database SQLite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig04.jpg"> Figura 4: Analisi dei dati con XCE. Le fasi critiche dell'analisi dei dati sono rappresentate da un diagramma del flusso di lavoro con i relativi pacchetti software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig05.jpg"> Figura 5: Evoluzione del programma utente XChem : il grafico mostra l'adozione e il consolidamento del programma utente dal 2015 al 2019 con la creazione di BAG nel 2019 e la resilienza della piattaforma durante la pandemia di COVID-19 nel 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig06.jpg"> Figura 6: Risultati rappresentativi dello screening dei frammenti XChem. Il dimero principale della proteasi (Mpro) di SARS-CoV2 è rappresentato in superficie con i punti di contatto attivi mostrati in giallo, i presunti punti allosterici mostrati in magenta e gli artefatti di impacchettamento di superficie/cristallo mostrati in verde. La figura è stata realizzata utilizzando le voci di Chimera e Mpro PDB dalla deposizione di gruppo G_1002156. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo articolo descrive l'intero processo XChem per lo screening dei frammenti a base di cristalli, a partire dalla richiesta di accesso e da tutte le fasi successive alla diffusione dei dati.

Ottenere uno screening efficiente dei frammenti presso l'impianto XChem di Diamond Light Source

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify ...

L'impianto XChem di Diamond Light Source fornisce uno screening di routine di frammenti grafici di cristalli su larga scala, supportando l'intero processo di deposizione del cristallo. La cristallografia a raggi X è una parte essenziale del kit di strumenti FBDD. È abbastanza sensibile da identificare i leganti deboli e fornisce direttamente informazioni strutturali sulle interazioni a livello molecolare.La scoperta di farmaci basata su frammenti è una strategia ampiamente utilizzata per la scoperta di lead. Ha consegnato sei farmaci per uso clinico e più di 50 molecole sono state avanzate agli studi clinici. L'impatto dei progressi e dell'efficienza forniti dalla piattaforma XChem rispetto ai metodi tradizionali di ammollo, raccolta dati e metodi di analisi è stato dimostrato al meglio visivamente.Inizia scegliendo i cristalli e la posizione del composto. Apri TextRank da un PC e seleziona il vassoio di cristallo, dall'elenco in basso a destra o digitando il codice a barre nella casella in alto a sinistra. Selezionare il formato dell'immagine corretto e la vista a pozzetto singolo.Per aggiungere solvente o composti a una goccia senza colpire il cristallo, fare clic con il pulsante destro del mouse all'interno della goccia, ma lontano dal cristallo quando viene trovato un cristallo adatto per un esperimento mentre ci si sposta tra le immagini di rilascio. Aprire il software Echo e selezionare nuovo per erogare le soluzioni utilizzando l'erogatore acustico. Scegliere la piastra del pozzetto sorgente corretta e la classe del liquido.Assicurarsi che sia selezionato il tipo di piastra corretto come piastra di destinazione. Quindi seleziona la casella personalizzata e continua. Selezionare Importa e scegliere il file batch pertinente.Quindi completare i passaggi di importazione come richiesto dal software. Utilizzare le mappe delle piastre per verificare la soluzione da erogare e le posizioni di destinazione. Quindi eseguire il protocollo seguendo le istruzioni man mano che vengono visualizzate.Le soluzioni della piastra di origine verranno erogate nelle gocce di cristallo scelte. Conservare la piastra nell'incubatrice per il tempo necessario. Per raccogliere i cristalli utilizzando il dispositivo semiautomatico di raccolta dei cristalli, premere il pulsante di avvio del flusso di lavoro per passare alla prima posizione del pozzetto selezionata.Se il cristallo è sopravvissuto, montalo nell'anello e immergilo nell'azoto liquido, posizionandolo nella posizione uno del primo disco della lista. Selezionare la descrizione appropriata per il cristallo dall'interfaccia. Se la goccia è un ammollo composto, registrare la descrizione dello stato composto.Se il cristallo è stato montato correttamente, selezionare montato, altrimenti selezionare fail. Una volta che i cristalli sono stati raccolti, porta i dischi allo scanner di codici a barre e mettili nel supporto uno alla volta per scansionare i codici a barre del disco e del pin. Una volta completata la scansione, posizionare i coperchi sui dischi e conservarli in un contenitore di azoto liquido.Per ricordare i campioni centrati in modo errato, osservare la vista del cambio campione in ISPyB e selezionare la classificazione in base alla risoluzione AP per classificare i campioni in base alla risoluzione elaborata automaticamente in una graduazione di colore dal verde al rosso. Fare clic sui campioni per verificare la presenza di eventuali campioni rossi o gialli. Quindi controlla le istantanee del cristallo per vedere se il cristallo è stato centrato.Per recuperare e analizzare i risultati dell'elaborazione automatica di Diamond tramite XChem Explorer o XCE, in un terminale vai alla sottocartella di elaborazione e usa l'alias XCE per aprire XChem Explorer. Selezionare il pulsante Aggiorna tabelle dall'origine dati nella scheda Panoramica per aggiornare il riepilogo dei dati sperimentali. Nella scheda delle impostazioni, seleziona la directory di raccolta dati, apri la scheda dei set di dati.Scegliere la destinazione dal menu a discesa Seleziona destinazione, selezionare Ottieni nuovi risultati dall'elaborazione automatica dal menu a discesa dei set di dati e fare clic su Esegui. Per calcolare le mappe iniziali utilizzando Dimple, apri la scheda mappe, scegli il modello di riferimento dal menu a discesa e seleziona i set di dati desiderati seguiti da Esegui Dimple sui file MTZ selezionati. Per generare vincoli di ligando, selezionare i set di dati desiderati seguiti da creare un file SCF o PDB o PNG dei composti selezionati dall'elenco a discesa delle mappe e dei vincoli.Per identificare i risultati utilizzando Panda, seleziona la scheda Pandas, assicurati che la directory di output sia definita correttamente ed esegui panda. Analizza dal menu a discesa Identificazione hit. Per analizzare i risultati identificati da Panda, esegui panda.Ispeziona dal menu a discesa Identificazione hit. Per aprire Coot con il pannello di controllo Panda. Carica le mappe medie e 2mFo-DFc da Dimple per il confronto con la mappa degli eventi e il modello.Una volta che un ligando è stato adattato, fare clic su Unisci ligando con il modello e salvare il modello prima di passare a un altro evento per evitare di perdere le modifiche apportate al modello di stato associato. Annotare l'evento di associazione utilizzando il campo di commento dell'evento e annotare i siti di associazione utilizzando le informazioni sul sito di record. Una volta che tutti i ligandi vitali sono stati modellati, uniti e salvati in base alla mappa degli eventi, chiudere panda.inspect.Esporta i modelli di ispezione Panda nella directory del progetto e avvia un primo ciclo di perfezionamento per i set di dati selezionati, e il perfezionamento sarà ora visibile nella scheda di perfezionamento. La pipeline XChem per lo screening dei frammenti mediante cristallografia a raggi X è stata ampiamente semplificata, consentendone l'adozione da parte della comunità scientifica. Questo grafico dimostra l'adozione e il consolidamento del programma utente dal 2015 al 2019 con la creazione di gruppi di allocazione dei blocchi nel 2019 e la resilienza della piattaforma durante la pandemia di COVID-19 nel 2020.Le campagne di successo producono una mappa tridimensionale dei potenziali siti di interazione sulla proteina bersaglio. Un risultato tipico è lo screening XChem della proteasi principale di SARS-CoV-2. I siti di interesse noti, come i siti attivi enzimatici e le sottotasche, sono mostrati in giallo.I siti allosterici putativi, come quelli coinvolti nelle interazioni proteina-proteina, sono mostrati in magenta e le interfacce di impacchettamento dei cristalli, generalmente considerate falsi positivi, sono mostrate in verde. Storicamente, l'uso della cristallografia come screening di frammenti primari è stato difficile. Questo studio ha documentato i protocolli della pipeline XChem dalla preparazione del campione alle strutture finali.Lo screening dei frammenti cristallografici è complementare ad altre tecniche biofisiche ed è solitamente essenziale per far progredire i frammenti in composti guida. Può essere applicato a qualsiasi classe target per la scoperta di farmaci.

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In questo rapporto, descriviamo le procedure dettagliate per effettuare esperimenti di diffrazione a raggi X singolo cristallo con una cella ad incudine di diamante al GSECARS 13-BM-C linea di luce alla Advanced Photon Source. programmi Atrex e RSV sono utilizzati per analizzare i dati.

Alta pressione singolo cristallo di diffrazione a PX ^ 2

È presentato un protocollo ottimizzato per l'esecuzione di un'ampia caratterizzazione biochimica e strutturale di una proteina carboidrato substrato da Streptococcus pneumoniae .

Caratterizzazione biochimica e strutturale del carboidrato trasporto substrato-proteina-SP0092

Descriviamo un setup beamline significato per effettuare la mappatura di microdiffrazione di fluorescenza e raggi x rapida radiografia bidimensionale di campioni singoli di cristallo o polvere utilizzando Laue (policromatica radiazione) o diffrazione da polveri (radiazione monocromatica). Le mappe risultanti danno informazioni sul ceppo, orientamento, distribuzione di fase e deformazione plastica.

Microdiffrazione dei raggi x di sincrotrone e formazione immagine di fluorescenza del minerale e campioni di roccia

Qui, descriviamo come utilizzare lo screening automatizzato e opzioni di raccolta di dati disponibili presso alcune beamlines di sincrotrone. Scienziati inviare campioni di cryocooled per il sincrotrone e le proprietà di diffrazione sono selezionate, gli insiemi di dati sono raccolti e trattati e, ove possibile, una soluzione di struttura avviene — tutto senza intervento umano.

Raccolta di dati dai cristalli delle macromolecole biologiche e completamente autonoma caratterizzazione

Presentiamo una guida completa alla preparazione del campione target fisso, alla raccolta e all'elaborazione dei dati per la cristallografia seriale di sincrotrone presso Diamond beamline I24.

Raccolta dati seriali a destinazione fissa presso Diamond Light Source

Lo screening dei frammenti cristallografici presso helmholtz-Zentrum Berlin viene eseguito utilizzando un flusso di lavoro con librerie composte dedicate, strumenti di gestione dei cristalli, strutture di raccolta rapida dei dati e analisi dei dati ampiamente automatizzata. Il protocollo presentato intende massimizzare l'output di tali esperimenti per fornire punti di partenza promettenti per la progettazione di ligandi basati su strutture a valle.

Flusso di lavoro e strumenti per lo screening dei frammenti cristallografici presso l'Helmholtz-Zentrum di Berlino

Il rapporto segnale-rumore dei dati è una delle considerazioni più importanti nell'esecuzione di misurazioni di diffrazione a raggi X da microcristalli. La beamline VMXm fornisce un ambiente a basso rumore e microbeam per tali esperimenti. Qui, descriviamo i metodi di preparazione del campione per il montaggio e il raffreddamento di microcristalli per VMXm e altre linee di cristallografia macromolecolare microfocus.

Una pipeline di preparazione del campione per microcristalli presso la linea di fascio VMXm

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione di campioni criogenici e il trasferimento di cristalli nella stazione finale del vuoto sulla beamline I23 a Diamond Light Source, per esperimenti di cristallografia macromolecolare a raggi X a lunga lunghezza d'onda.

Protocollo di preparazione e trasferimento dei campioni per cristallografia a lunghezza d'onda lunga sotto vuoto su Beamline I23 presso Diamond Light Source

Il monitoraggio delle variazioni della temperatura di fusione di una proteinabersaglio (ad es.saggio di spostamento termico, TSA) è un metodo efficiente per lo screening di librerie di frammenti di poche centinaia di composti. Presentiamo un protocollo TSA che implementa la fluorimetria a scansione nano-differenziale assistita da robotica (nano-DSF) per il monitoraggio della fluorescenza intrinseca del triptofano e la retrodepersione della luce per lo screening dei frammenti.

Fluorimetria a scansione nano-differenziale per lo screening nella scoperta di piombo basata su frammenti

Qui, descriviamo come utilizzare le pipeline automatizzate di cristallografia macromolecolare per l'analisi rapida del complesso ligando-proteina e la selezione rapida del complesso ligando-proteina e lo screening di frammenti su larga scala basato sulla tecnologia CrystalDirect presso il laboratorio HTX di EMBL Grenoble.

Le pipeline di cristallografia automatizzate presso lo stabilimento EMBL HTX di Grenoble

Presentiamo un protocollo per la cristallizzazione delle proteine utilizzando l'impianto di cristallizzazione nel complesso di ricerca di Harwell e la successiva raccolta di dati cristallografici a raggi X in situ dai cristalli all'interno delle piastre presso la linea di luce della cristallografia macromolecolare versatile in situ (VMXi) di Diamond. Descriviamo i requisiti dei campioni, i protocolli di cristallizzazione e le linee guida per la raccolta dei dati.

Cristallizzazione e raccolta dati a temperatura ambiente in situ utilizzando l'impianto di cristallizzazione di Harwell e Beamline VMXi, sorgente luminosa diamantata

Scopri il processo XChem per lo screening di frammenti cristallografici presso Diamond Light Source. Questo metodo ottimizza la scoperta di farmaci basata su frammenti attraverso cristallografia a raggi X ad alta efficienza.

Ottenere uno screening efficiente dei frammenti presso l'impianto XChem di Diamond Light Source

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