Name: Zebrafish Modello di Metastasi del Neuroblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Scopri come sviluppare un modello di Danio rerio per studiare la metastasi del neuroblastoma mediante sovraespressione di MYCN e LMO1. Questo sistema permette l'imaging in vivo in tempo reale della disseminazione tumorale.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione R01 CA240323 (S.Z.) del National Cancer Institute; una sovvenzione W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) dal Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (DoD); un V Scholar award dalla V Foundation for Cancer Research (S.Z.) e un Platform Grant dal Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); e i supporti del Mayo Clinic Cancer Center e del Center for Individualized Medicine (S.Z.).

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il pesce zebra è stato comunemente utilizzato nella ricerca negli ultimi decenni, in particolare nella ricerca sul cancro, per ovvi motivi, come la sua facilità di manutenzione, la riproduzione robusta e chiari vantaggi per l'imaging in vivo1,28. Il modello del pesce zebra può essere facilmente manipolato embrionalmente a causa della loro fecondazione e sviluppo esterni, che si integra bene con gli organismi modello dei mammiferi, come ratti e topi, per ...

Zebrafish è stato ampiamente utilizzato e applicato a diverse aree di ricerca, in particolare nel cancro. Questo modello offre molti vantaggi, come la sua riproduzione robusta, la manutenzione economica e la visualizzazione versatile della crescita tumorale e delle metastasi, che rendono il pesce zebra un potente strumento per studiare e studiare le basi cellulari e molecolari della tumorigenesi e delle metastasi. Nuove tecniche per la mappatura del genoma su larga scala, la transgenesi, la sovraespressione o il knockout dei geni, il trapianto di cellule e gli schermi chimici hanno aumentato immensamente la potenza del modello di pesce zebra1. Negli ultimi anni, molte linee di zebrafish sono state sviluppate per studiare la tumorigenesi e le metastasi di una varietà di tumori umani, tra cui, ma non solo, leucemia, melanoma, rabdomiosarcoma e carcinoma epatocellulare2,3,4,5. Inoltre, il primo modello di neuroblastoma (NB) di zebrafish è stato generato sovraesprimendo MYCN, un oncogene, nel sistema nervoso simpatico periferico (PSNS) sotto controllo del promotore della dopamina-beta-idrossilasi (dβh). Con questo modello, è stato ulteriormente dimostrato che l'ALK attivato può sinergizzare con MYCN per accelerare l'insorgenza del tumore e aumentare la penetranza tumorale in vivo6.
NB deriva dal lignaggio simpatico-surrenale delle cellule della cresta neurale ed è un tumore altamente metastatico nei bambini7. È responsabile del 10% dei decessi correlati al cancro pediatrico8. Ampiamente metastatizzato alla diagnosi, l'NB può essere presentato clinicamente come tumori che hanno origine principalmente lungo la catena dei gangli simpatici e del midollo surrenale di PSNS9,10. L'amplificazione di MYCN è comunemente associata a scarsi esiti nei pazienti nb11,12. Inoltre, LMO1 è stato identificato come un gene critico di suscettibilità NB nei casi ad alto rischio13,14. Gli studi hanno scoperto che la coespressione transgenica di MYCN e LMO1 nel PSNS del modello zebrafish non solo promuove l'insorgenza precoce di NB, ma induce anche metastasi diffuse ai tessuti e agli organi che sono simili ai siti comunemente osservati nei pazienti con NB13 ad alto rischio. Molto recentemente, un altro fenotipo metastatico di NB è stato osservato anche in un nuovo modello di zebrafish di NB, in cui sia MYCN che Lin28B, che codificano per una proteina legante l'RNA, sono sovraespressi sotto controllo del promotore dβh16.
L'approccio transgenico stabile nel pesce zebra è spesso usato per studiare se la sovraespressione di un gene di interesse potrebbe contribuire al normale sviluppo e alla patogenesi della malattia14,15. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per dimostrare l'importanza di più geni e percorsi per la tumorigenesi NB6,16,17,18,19,20. Questo articolo introdurrà come è stata creata la linea transgenica del pesce che sovraesprime sia MYCN che LMO1 nel PSNS e come è stato dimostrato che la cooperazione di questi due oncogeni accelera l'insorgenza della tumorigenesi NB e delle metastasi13. In primo luogo, la linea transgenica che sovraesprime EGFP-MYCN sotto controllo del promotore dβh (linea MYCN designata) è stata sviluppata iniettando il costrutto dβh-EGFP-MYCN in uno stadio unicellulare di embrioni AB wild-type (WT), come precedentemente descritto6,17. Una linea transgenica separata che sovraesprime LMO1 nel PSNS (linea LMO1 designata) è stata sviluppata coniettando due costrutti di DNA, dβh-LMO1 e dβh-mCherry, in embrioni WT allo stadio di una cellula13. È stato precedentemente dimostrato che i costrutti a doppio DNA coiniettati possono essere cointerificati nel genoma del pesce; pertanto, LMO1 e mCherry sono coespressi nelle cellule PSNS degli animali transgenici. Una volta che gli embrioni F0 iniettati hanno raggiunto la maturità sessuale, sono stati poi superati con pesci WT per l'identificazione di pesci positivi con integrazione transgenica( s). In breve, la prole F1 è stata sottoposta per la prima volta a screening al microscopio fluorescente per l'espressione di mCherry nelle cellule PSNS. L'integrazione germinale di LMO1 nei pesci mCherry-positivi è stata ulteriormente confermata dalla PCR genomica e dal sequenziamento. Dopo aver identificato con successo ciascuna linea transgenica, la progenie di pesci transgenici eterozigoti MYCN e LMO1 è stata incrociata per generare una linea di pesce composta che esprime sia MYCN che LMO1 (designata MYCN; Linea LMO1). MYCN portante tumorale; I pesci LMO1 sono stati monitorati al microscopio fluorescente due volte alla settimana per l'evidenza di tumori metastatici nelle regioni distanti dal sito primario, regione della ghiandola interrenale (IRG, zebrafish equivalente della ghiandola surrenale umana)13. Confermare le metastasi dei tumori in MYCN; Sono state applicate analisi LMO1 per pesci, istologiche e immunoistochimiche.

<table><tbody><tr><td>Kit vettoriale 3,3'-diaminobenzidina (DAB)</td><td>Vettore</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Fisher Scientific / Acros Organic</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio GP2</td><td>Midwest Scientific</td><td>009012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH)</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101</td><td></td></tr><tr><td>Kit di blocco avidina/biotina</td><td>Vettore</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>BOND Intense R Detection</td><td>Leica Biosystems</td><td>DS9263</td><td></td></tr><tr><td>BOND Diluente per anticorpi primari</td><td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>Strumento BOND-MAX IHC Leica</td><td>Biosystems Newcastle, Ltd.</td><td>N/A</td><td>sistema di colorazione IHC completamente automatizzato</td></tr><tr><td>CH211-270H11 Clone BAC</td><td>BACPAC resources center (BRFC)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio composto dotato di fotocamera DP71</td><td>Olympus</td><td>AX70</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL (terreno di montaggio a base di xilene)</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica</td><td>3801601</td><td>pronto all'uso (non è necessaria alcuna preparazione)</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Carolina</td><td>86-1263</td><td></td></tr><tr><td>Espandi il sistema PCR a modello lungo</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonasi II miscela di enzimi</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonasi II miscela di enzimi</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-Rb di capra (biotinilato)</td><td>Dako</td><td>E0432</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ematossilina, Harris Modified</td><td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td><td>HHS-32-1L</td><td></td></tr><tr><td>HRP Avidin D</td><td>Vector</td><td>A-2004</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico Soluzioni</td><td>acquatiche</td><td>4360-1L</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno, 3%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>H324-500</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI enzima</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694L</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Teknova, Inc.</td><td>K2150</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di litio</td><td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td><td>554-13-2</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo per sezionamento</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chimicamente competente&nbsp;E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>p3E-polyA</td><td>&nbsp;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td><td>N/A</td><td>un dono generoso (Si prega di fare riferimento alla pagina web http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page per ottenere materiale, che viene distribuito liberamente come descritto.)</td></tr><tr><td>Cera di parafina</td><td>Surgipath Paraplast</td><td>39603002</td><td>Parrafin a</td></tr><tr><td>parafina Paraformaldeide</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>vettore pDEST (vettore di destinazione modificato contenente siti di riconoscimento I-SceI)</td><td>Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germania</td><td>N/A</td><td>un generoso regalo</td></tr><tr><td>pDONR 221 gateway donatore vettore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12536-017</td><td></td></tr><tr><td>Vettore donatore pDONRP4-P1R</td><td>&nbsp;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td><td>N/A</td><td>un generoso dono</td></tr><tr><td>Rosso fenolo, 0,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; P0290</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10X</td><td>BioRad</td><td>1610780</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione rossa Picrosirrius</td><td>Polysciences</td><td>24901-250</td><td></td></tr><tr><td>pME-mCherry</td><td>Addgene</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K, ricombinante, PCR Grade</td><td>Roche</td><td>21712520</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>RDO Decalcificante rapido</td><td>Apex Enginerring</td><td>RDO04</td><td></td></tr><tr><td>Azoturo di sodio (NaN3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza stereo</td><td>Leica</td><td>MZ10F</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza stereoscopico dotato di mirino digitale Fotocamera DS-U1 per l'imaging</td><td>Nikon</td><td>SMZ-1500</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polimerasi</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP&reg; &nbsp; 6 Processore di infiltrazione sottovuoto AI</td><td>Sakura</td><td>N/A</td><td>Modello #: VIP-6-A1</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical Incorporated</td><td>20513</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish modello di metastasi del neuroblastoma

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Il pesce zebra è emerso come un importante modello animale per studiare le malattie umane, in particolare il cancro. Insieme alle robuste tecnologie transgeniche e di editing del genoma applicate nella modellazione del pesce zebra, la facilità di manutenzione, la produttività ad alto rendimento e la potente imaging dal vivo rendono il pesce zebra un prezioso sistema modello per studiare metastasi e basi cellulari e molecolari alla base di questo processo in vivo. Il primo modello di metastasi del neuroblastoma del pesce zebra (NB) è stato sviluppato sovraesprimendo due oncogeni, MYCN e LMO1, sotto controllo del promotore della dopamina-beta-idrossilasi (dβh). MyCN e LMO1 co-sovraespressi hanno portato alla riduzione della latenza e all'aumento della penetranza della neuroblastomagenesi, nonché all'accelerazione delle metastasi a distanza delle cellule tumorali. Questo nuovo modello ribadisce in modo affidabile molte caratteristiche chiave della NB metastatica umana, incluso il coinvolgimento di alterazioni genetiche clinicamente rilevanti e associate a metastasi; sviluppo naturale e spontaneo di metastasi in vivo; e siti conservati di metastasi. Pertanto, il modello zebrafish possiede vantaggi unici per sezionare il complesso processo di metastasi tumorali in vivo.

Per determinare se LMO1 sinergizza con MYCN per influenzare la patogenesi NB, i costrutti transgenici che guidano l'espressione di LMO1 (dβh:LMO1 e dβh:mCherry) o MYCN (dβh:EGFP-MYCN) nelle cellule PSNS sotto controllo del promotore dβh sono stati iniettati negli embrioni di zebrafish13. Come illustrato nella Figura 1A, dopo lo sviluppo di linee transgeniche stabili e la convalida dei loro genotip...

Questo documento introduce il metodo per sviluppare, caratterizzare e tracciare in tempo reale le metastasi tumorali nel modello di neuroblastoma zebrafish, in particolare nella linea transgenica zebrafish con sovraespressione di MYCN e LMO1, che sviluppa metastasi spontaneamente.

Zebrafish Modello di Metastasi del Neuroblastoma

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Questi metodi sono stati utilizzati per sviluppare il primo modello di zebrafish di metastasi del neuroblastoma. E per dimostrare che questo modello può ricapitolare fedelmente molte caratteristiche delle metastasi osservate in pazienti ad alto rischio di neuroblastoma. Il vantaggio principale di questo modello metastatico di zebrafish è l'imaging in vivo in tempo reale della diffusione del tumore per capire meglio quando e possibilmente come si verificano le metastasi.Questa tecnica non è specifica per il neuroblastoma. Può essere applicato a modelli di zebrafish di diversi tipi di tumori purché le cellule tumorali possano essere identificate e tracciate portando a una serie di possibilità. Per iniziare, sviluppare una linea di pesce transgenica eterozigote che sovraesprima sia MYCN che LMO1 incrociando linee transgeniche MYCN e LMO1.Ad un giorno dopo la fecondazione, utilizzare un microscopio a fluorescenza stereoscopica per ordinare la progenie di outcross per l'espressione EGFP, che si presenta come punti positivi EGFP. Dopo la cernita, isolare gli embrioni sottoposti a screening in piastre di Petri separate ed etichettare le piastre come MYCN positive o MYCN negative. Visualizza e ordina gli embrioni di entrambi i gruppi per l'espressione di LMO1 da tre a quattro giorni dopo la fecondazione.Cerca macchie di fluorescenza rossa sia nel ganglio cervicale superiore che nelle cellule neuronali dopaminergiche non PSNS, specialmente nel midollo allungato del cervello posteriore. Eseguire lo screening prima che gli embrioni raggiungano i cinque giorni dopo la fecondazione. Quindi isolare i pesci ordinati in quattro gruppi di genotipi diversi ed etichettare come solo MYCN, solo LMO1, MYCN e LMO1 entrambi e wild type.Allevarli in condizioni identiche secondo i protocolli standard. Visualizza i tumori con un microscopio a fluorescenza stereoscopica capovolgendo delicatamente il pesce con una spatola metallica su entrambi i lati laterali per visualizzare il tumore. Dopo l'identificazione dei possibili pesci portatori di tumore, isolarli in un serbatoio separato con etichette appropriate che includono la data di nascita, la data in cui il tumore è stato sottoposto a screening e il genotipo.A sei settimane dopo la fecondazione, ripetere i passaggi precedenti per lo screening dei pesci portatori di tumore e dei pesci non portatori di tumore per confermare la presenza di tumori per pesci precedentemente sottoposti a screening o identificare nuovi possibili pesci portatori di tumore. Cerca le dimensioni sostenute o aumentate della massa positiva alla fluorescenza e dei pesci portatori di tumore confermati. Dopo aver identificato i pesci portatori di tumore, monitorarli due volte alla settimana per l'evidenza della migrazione delle cellule tumorali, che si presenta come minuscole masse tumorali EGFP o mCherry positive lontano dal sito primario di genesi del tumore.Isolare questi pesci in vasche separate secondo necessità ed etichettare in modo appropriato per indicare possibili metastasi. Dopo aver interpretato il MYCN eterozigote nei pesci LMO1 e durante l'ordinamento della loro progenie, l'espressione di EGFP MYCN era prominente nelle cellule neuronali dopaminergiche non PSNS in un giorno dopo la fecondazione. Al contrario, l'espressione di LMO1 era prominente sia nelle cellule PSNS che nelle cellule neuronali dopaminergiche non PSNS.Masse tumorali fluorescenti positive sono state rilevate nei tessuti degli organi, distanti dal sito tumorale primario nel pesce transgenico composto con sovraespressione sia di MYCN che di LMO1, ma non nel pesce transgenico con la sola espressione di MYCN. La colorazione H & E delle sezioni chirurgiche mostra che il tumore primario è sorto dalla regione della ghiandola interrenale, l'equivalente zebrafish della ghiandola surrenale umana che è il sito più comune di malattia primaria nel paziente con neuroblastoma. Masse tumorali distanti dalla ghiandola interrenale sono state rilevate in più regioni, tra cui la porzione distale del rene, l'orbita, la branchia, la milza e la parete interna della camera atriale del cuore.Il lignaggio dei neuroblasti PSNS delle cellule tumorali nel tumore primario e in tutti i siti metastatici è stato confermato. Quantità significativamente amplificate e aumento dello spessore delle fibre di collagene colorate con PSR sono state trovate nei tumori MYCN LMO1 rispetto ai tumori che esprimono mycn da solo. Dopo aver utilizzato questa procedura, è possibile applicare lo screening farmacologico e testare nuove terapie antitumorali, che possono potenzialmente portare allo sviluppo di agenti alternativi per prevenire e curare i tumori metastatici.

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Questo video descrive un metodo di microiniezione per la consegna di cellule di cancro al seno nello spazio perivitellino di embrioni di pesce zebra transgenico. Dopo l'incubazione, visualizziamo l'embrione al microscopio a fluorescenza per osservare l'invasione, la disseminazione e la metastasi delle cellule tumorali.

zPDX-Analisi dell'invasività: studio del comportamento invasivo delle cellule tumorali metastatiche negli xenotrapianti di embrioni di zebrafish

Un modo rapido per lo screening del melanoma modificatori che utilizzano un modello di zebrafish tumore autoctona è presentato. Si avvale del vettore miniCoopR che permette l'espressione di geni candidati melanoma nei melanociti. Un metodo per ottenere melanoma senza curve di sopravvivenza, un saggio di invasione, un protocollo per la colorazione degli anticorpi dei melanociti di scala e di un saggio di trapianto melanoma sono descritti.

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L'obiettivo di questo studio è dimostrare come la strategia della transgenesi a mosaico possa essere utilizzata nel pesce zebra per valutare in modo rapido ed efficiente i contributi relativi di più oncogeni nell'inizio e nella progressione del tumore in vivo.

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Testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in Zebrafish (<em&gt; Danio Rerio</em&gt;)

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Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Qui, forniamo un protocollo passo-passo, con suggerimenti per generare xenografti e linee guida per l'analisi del comportamento tumorale, l'immunofluorescenza a montaggio intero e la quantificazione dell'imaging confocale.

Generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale

Riportiamo una tecnica che consente l'imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma (GBM) che invadono un tessuto cerebrale dei vertebrati. L'accoppiamento dell'iniezione ortotopica di cellule GBM marcate con fluorescenza in un cervello di zebrafish trasparente con imaging intravitale ad alta risoluzione consente la misurazione della dinamica del citoscheletro durante l'invasione del cancro in situ .

Imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma che invadono il cervello del pesce zebra

Descriviamo un protocollo per lo xenotrapianto nel tuorlo di embrioni trasparenti di zebrafish ottimizzato con un metodo di stadiazione semplice e rapido. Le analisi post-iniezione includono la sopravvivenza e la valutazione del carico di malattia delle cellule xenotrapiantate mediante citometria a flusso.

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

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