Isolamento delle celle della valvola interstiziale del topo per studiare la calcificazione della valvola aortica in vitro
May 10th, 2021
Questo articolo descrive l'isolamento delle cellule della valvola aortica del topo con una procedura in due fase di collagenasi. Le cellule isolate della valvola del topo sono importanti per eseguire diversi saggi, come questo saggio di calcificazione in vitro, e per studiare le vie molecolari che portano alla mineralizzazione della valvola aortica.
L'uso di cellule isolate della valvola del topo è essenziale per studiare la via di segnalazione che porta alla calcificazione delle valvole nell'uso di cellule geneticamente modificate da topi transgenici. La digestione in due fase è un metodo rapido ed efficiente. La parte più impegnativa di questo protocollo è l'isolamento della valvola aortica da topi di otto settimane.
È meglio esercitarsi sui topi più anziani per visualizzare meglio la valvola aortica. Prima di iniziare l'esperimento, pulire e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e lo spazio di lavoro con 70%etanolo e autoclave gli strumenti chirurgici per 30 minuti. Quando la configurazione iniziale è pronta, inizia con la pulizia del torace e della regione dell'addome di un topo eutanasiato di otto settimane usando l'etanolo.
Usando le forbici, aprire l'addome e il petto del topo, quindi tagliare tra l'atrio sinistro e il ventricolo sinistro con piccole forbici chirurgiche. Rimuovere il sangue dal cuore perfondendo 10 millilitri di PBS freddo e tagliare il cuore, mantenendo tre millimetri dell'aorta ascendente. Sotto uno stereomicroscopio, sezionare la valvola aortica tagliando il cuore orizzontalmente al centro dei ventricoli e tagliando il ventricolo sinistro verso l'aorta, quindi sezionare attentamente la valvola aortica.
Mettere insieme le valvole in un piccolo piatto di coltura tissutale di 35 millimetri. Lavare le valvole isolate in un piatto di coltura cellulare da 75 millilitri con cinque millilitri di HEPES freddo da 10 millimolare appena preparato integrato con antibiotici e incubare in cinque millilitri di collagenasi di tipo uno per 30 minuti a 37 gradi Celsius con scuotimento continuo. Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo per cinque minuti, a 150 volte G e lavare il pellet una volta con due millilitri di HEPES da 10 millimolare con vortice ad alta velocità per 30 secondi.
Raccogliere la sospensione risultante dal tubo in un piatto di coltura di 35 millimetri e utilizzare una pinzetta sottile per trasferire con cura i frammenti di tessuto in un tubo fresco. Quindi incubare il pellet in un tubo da 15 millilitri con cinque millilitri di collagenasi di tipo uno a 37 gradi Celsius sotto agitazione continua per 35 minuti. Separare le cellule riutilizzando con una pipetta millilitro e centrifugare a 150 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Pulire le cellule due volte rimospendendo il pellet separato in due millilitri di DMEM completo e centrifugando a 150 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Per la placcatura, risospendare il pellet in un millilitro di mezzo completo e aggiungerlo a un pozzo di un piatto di coltura a sei cellule di pozzo in una quantità minima di mezzo. Mantenere le piastre indisturbate a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
Dopo tre giorni di incubazione, confermare la crescita vicino ai detriti tissutali osservando le cellule al microscopio. Una volta che 1.000 cellule sono visibili, rimuovere con cura i detriti del tessuto con pinzette autoclavate e cambiare il mezzo. Tripinare le cellule dopo aver raggiunto il 70% di confluenza e trasferirle in un piatto di coltura tissutale da 75 millilitri.
Prima di iniziare il test, pulire la cappa di biosicurezza con 70%etanolo e riscaldare il mezzo DMEM a 37 gradi Celsius. Successivamente, semina 100.000 cellule per condizione in sei piastre di pozzo in DMEM completo e coltura a 37 gradi Celsius. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo supernatante con il mezzo calcificatore e incubare le cellule per sette giorni a 37 gradi Celsius, sostituendo il mezzo il terzo giorno.
Dopo sette giorni, misurare la concentrazione di calcio in una piastra di 96 pozza di calcio usando il reagente Arsenazo III e registrando l'assorbanza a 650 nanometri. Nell'analisi rappresentativa, vari fenotipi di cellule valvolari sono stati identificati con colorazione immunofluorescente dopo tre o cinque giorni di coltura. La vimentina espressa da Mouse VIC e alfa SMA, i marcatori significativi delle celle valvolari.
Inoltre, la colorazione immunofluorescente CD31 non ha verificato alcuna contaminazione da cellule endoteliali nella coltura VIC. Coltivare VIC con mezzo calcificatore ricco di fosfati stimola una calcificazione nelle cellule, ulteriormente confermata con la colorazione rosso positiva per i nodi di calcio. Il protocollo si basa su un pool di tre o cinque valvole da diversi topi.
L'uso del compagno di lettiera e di tre diverse repliche biologiche è importante per convalidare i risultati. L'uso di cellule della valvola del topo è vitale per comprendere la via molecolare che porta alla stenosi aortica isolando le cellule dai topi transgenici. Questo protocollo è stato usato in precedenza per indagare l'implicazione della via del recettore nella regressione minerale della valvola aortica calcificata.
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Panoramica
Questo articolo descrive una procedura di digestione con collagenasi in due fasi per l'isolamento delle cellule della valvola aortica del topo, essenziale per studiare i percorsi molecolari coinvolti nella calcificazione della valvola aortica. Il metodo di isolamento consente successivi saggi per valutare la mineralizzazione della valvola.
Componenti principali dello studio
Area di ricerca
- Biologia cellulare
- Percorsi di segnalazione
- Calcificazione della valvola aortica
Contesto
- L'importanza delle cellule valvolari isolate nella comprensione dei meccanismi di calcificazione.
- Le sfide associate all'isolamento delle valvole aortiche da topi di otto settimane.
- L'importanza dei modelli di topi transgenici nel rivelare i percorsi molecolari.
Metodi utilizzati
- Digestione con collagenasi in due fasi per l'isolamento delle cellule.
- Modello di topo, in particolare valvole aortiche da topi transgenici.
- Saggi in vitro, compresa la misurazione della concentrazione di calcio con il reagente Arsenazo III.
Risultati principali
- Isolamento e coltura di successo delle cellule valvolari.
- Identificazione dei fenotipi delle cellule valvolari mediante colorazione immunofluorescente.
- Validazione dei risultati attraverso repliche biologiche multiple.
Conclusioni
- Questo studio presenta un metodo efficiente per l'isolamento delle cellule della valvola aortica, migliorando la comprensione dei meccanismi molecolari nella stenosi aortica.
- I risultati contribuiscono alla più ampia ricerca biologica sulla calcificazione delle valvole cardiache.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of mouse valve interstitial cells (VICs) enables mechanistic interrogation of aortic valve calcification, a key driver of aortic stenosis. This workflow supports early discovery and target validation by providing a disease-relevant in vitro system for pathway analysis and pharmacological testing. The method enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in cardiovascular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by isolating VICs for pathway interrogation in calcification.
- Supports functional target validation using genetically modified mouse models.
- Facilitates hypothesis-driven testing of molecular drivers and inhibitors of mineralization.
- Provides a platform for evaluating new pharmacological targets in a controlled system.
Screening & Assay Development
- Delivers validated primary cell cultures for reproducible in vitro calcification assays.
- Standardizes cell phenotype confirmation via immunofluorescence for assay reliability.
- Enables quantitative measurement of calcification using calcium reagent and alizarin red staining.
- Prepares scalable systems for compound screening and comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant mechanisms observed in aortic stenosis.
- Supports continuity from genetic models to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Provides a platform for biomarker discovery and mechanistic studies in valve pathology.
- Reduces translational risk by modeling human disease processes in primary mouse cells.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical target validation in cardiovascular research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification in valve calcification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of calcification across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights to in vivo disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse genetic backgrounds and pharmacological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and assay protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in early-stage cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and compounds for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and primary cell culture techniques.
- Needs access to sterile surgical instruments, biosafety hoods, and analytical reagents.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell isolation and phenotype validation.
- Adaptable to various transgenic mouse models for pathway-specific studies.
- Dependent on careful dissection and pooling of valves to ensure sufficient cell yield and reproducibility.
