Name: Strumenti per la valutazione in tempo reale di un modello di infezione da Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Impara a studiare aggregati batterici di Pseudomonas aeruginosa in tempo reale con microscopia confocale e SCFM2. Questo metodo consente analisi ad alta risoluzione per la ricerca antimicrobica.

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S.E.D è supportato da fondi di start-up forniti dal Dipartimento di Medicina Molecolare, The University of South Florida, nonché da una borsa di ricerca CFF (DARCH19G0), dal N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) e dall'USF Institute on Microbiomes. Ringraziamo il laboratorio whiteley per la collaborazione in corso che coinvolge set di dati relativi a questo manoscritto. Ringraziamo il Dr. Charles Szekeres per aver facilitato lo smistamento FACS. Le figure sono state create da A.D.G e S.E.D utilizzando Biorender.com.

1. Preparare il mezzo sintetico per la fibrosi cistica (SCFM2)
NOTA: La preparazione di SCFM2 comprende tre fasi principali descritte di seguito (Figura 2). Per i dettagli completi e i riferimenti, vedere9,10,12.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"> Figura 2: Preparazione e inoculazione del mezzo SCFM2. (A) La base tamponata è preparata utilizzando sali e amminoacidi elencati nelle tabelle 1 e 2. La base tamponata può essere conservata a 4 °C per un massimo di 30 giorni, ma deve essere protetta dall'esposizione alla luce. (B) La mucina e il DNA vengono aggiunti ad un'aliquota di base tamponata e disciolti in soluzione durante la notte a 4 °C. (C) I lipidi e le scorte aggiuntive vengono aggiunti alla soluzione durante la notte e incubati a 37 °C con agitazione a 250 giri/min per 20 minuti. SFCM2 viene quindi inoculato con celle lavate in fase logaritrica a un OD600 = 0,05. Abbreviazioni: SCFM2 = mezzo espettorato della fibrosi cistica sintetica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol><li>Sterilizzazione della mucina suina<ol>
<li>Preparare la mucina sterile ad una concentrazione finale di 5 mg/mL in SCFM2. Ad esempio, per un volume di 5 ml di SCFM2, pesare 25 mg di mucina di tipo II in una capsula di Petri sterile e metterlo in uno sterilizzatore ultravioletto (UV) per 4 ore, agitando delicatamente ogni ora.</li>
		<li>Dopo 4 ore, trasferire la mucina trattata con UV in tubi autoclavati da 1,7 ml in condizioni sterili e conservare a -20 °C.</li>
		<li>Per confermare la completa sterilizzazione, sciogliere un campione di mucina in un liquido sterile, come acqua o brodo Luria Bertani (LB), e osservare al microscopio. NOTA: La mucina sterilizzata può essere conservata a -20 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della base tamponata<ol>
<li>Preparare soluzioni stock di sale e amminoacidi aggiungendo le quantità appropriate in peso all'acqua deionizzata come elencato nella Tabella 1. Filtrare tutte le soluzioni di riserva utilizzando un filtro da 0,22 μm, avvolgere in un foglio per proteggere dalla degradazione della luce e conservare a 4 °C per un massimo di un mese.</li>
		<li>Preparare la base tamponata combinando 190 ml di acqua deionizzata con aminoacidi e soluzioni saline per volumi elencati nella Tabella 1. Regolare la soluzione a pH 6,8 e aumentare fino a un volume finale di 250 ml. Filtrare con un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C per un massimo di 30 giorni.</li>
		<li>La sera prima dell'esperimento, aliquotare la quantità desiderata di base tamponata in un pallone di coltura di vetro e aggiungere mucina (5 mg/mL come descritto al punto 1.1.1) e DNA di spermatozoi di salmone purificato (0,6 mg/mL). Agitare delicatamente, avvolgere in un foglio e lasciare a 4 °C durante la notte per consentire alla mucina e al DNA di dissolversi in soluzione. NOTA: le aliquote del DNA dello sperma di salmone devono essere scongelate sul ghiaccio, vorticose e aggiunte alla base tamponata e alla mucina. Le soluzioni stock di triptofano, asparagina e tirosina devono essere preparate in soluzioni di NaOH (vedere Tabella 1 per le concentrazioni) anziché in acqua deionizzata. Mantenere la base tamponata e tutte le soluzioni stock avvolte in un foglio per proteggere dall'esposizione alla luce. La maggior parte delle azioni sarà stabile per un massimo di un mese. Le scorte che diventano scolorite non devono essere utilizzate e devono essere sostituite prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiunta di scorte supplementari<ol>
<li>Il giorno dell'esperimento, aggiungere le scorte elencate nella tabella 2 alla base tamponata contenente mucina e DNA. NOTA: Preparare unasoluzione fresca di FeSO 4 il giorno dell'esperimento, ma tutte le altre scorte possono essere prodotte in anticipo e conservate per 30 giorni a 4 °C. 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) contiene cloroformio. Maneggiare con cautela e non utilizzare vicino a fiamme libere. Dopo l'aggiunta di DOPC, incubare SCFM2 a 37 °C con agitazione (250 rpm) per almeno 20 min (per 5 mL di coltura). Questo periodo di incubazione consente al cloroformio nel DOPC di evaporare. Il pallone non deve essere ermetico; coprire invece l'apertura del pallone liberamente con un foglio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Valutazione in tempo reale della tolleranza antimicrobica negli aggregati batterici
<ol><li>Preparare colture notturne<ol>
<li>La sera prima dell'esperimento, inoculare 5 mL di brodo LB con diverse colonie di Pa PAO1-pMRP9-113 da una piastra di agar LB contenente antibiotico (carbenicillina 300 μg / mL). Crescere durante la notte a 37 °C con agitazione a 250 giri/min. NOTA: Coltivare colture notturne con l'aggiunta di antibiotici necessari per la selezione dei plasmidi richiesti (qui, il plasmide di espressione della proteina fluorescente verde (GFP), pMRP9-1). Si noti che le cellule Pa devono essere lavate prima che SCFM2 venga inoculato. LB può essere sostituito da altri ricchi mezzi di laboratorio per colture notturne. Tutti gli isolati batterici devono essere maneggiati utilizzando le linee guida BSL-2 appropriate in tutto questo protocollo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculare SCFM2<ol>
<li>Il giorno dell'esperimento, diluire nuovamente le colture notturne di Pa 1:10 (coltura: mezzi liquidi) inoculando 500 μL in 5 ml di brodo LB fresco. Far crescere le cellule fino alla fase logarittiva (60-90 min) a 37 °C con agitazione a 250 rpm.</li>
		<li>Centrifughe log phase cultures a 10.000 × g per 5 min. Lavare le cellule rimuovendo il surnatante e riconsospendo in 3 ml di soluzione salina tamponata con fosfato sterilizzato con filtro (PBS, pH 7,0). Ripetere due volte e risusciere il pellet in un volume finale di 1 mL di PBS.</li>
		<li>Misurare l'assorbanza delle cellule lavate utilizzando uno spettrofotometro a 600 nm (OD600)e calcolare il volume di coltura richiesto per un OD600 iniziale di 0,05 in 5 mL di SCFM2. Inoculare Pa nell'SCFM2 e vortice delicatamente per distribuire le cellule in tutto. Pipettare 1 mL dell'SCFM2 inoculato in ogni camera di un fondo di vetro a 4 pozzetto, piatto ottico e incubare per 4 ore staticamente a 37 °C. NOTA: Il tempo di raddoppio delle colture di Pa dipende dal ceppo e dalla disponibilità di ossigeno. In SCFM2, nelle condizioni qui descritte, il tempo di raddoppio di Pa è ~ 1.4 h10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Visualizzazione di aggregati durante il trattamento antibiotico con microscopia a scansione laser confocale (CLSM)
NOTA: Questa sezione descrive l'uso del microscopio a scansione laser confocale e del software di acquisizione delle immagini per l'imaging di aggregati di Pa in SCFM2. L'obiettivo è osservare e caratterizzare la biomassa batterica residua (tollerante) dopo il trattamento con antibiotici. I passaggi delineati possono essere eseguiti con successo su altri microscopi confocali, anche se il manuale operativo dello strumento dovrebbe essere referenziato per una guida specifica.
<ol><li>Image Pa si icoltura utilizzando una camera riscaldata o una micropiastra riscaldata montata sullo stadio del microscopio per mantenere una temperatura ambiente di 37 °C. Avviare il modulo di incubazione almeno 2 ore prima dell'inizio dell'esperimento per consentire a tutti gli apparecchi di raggiungere la temperatura desiderata e ridurre ulteriormente l'espansione e il movimento durante la raccolta dei dati.</li>
	<li>Dopo 4 ore, trasferire le colture SCFM2 contenenti cellule Pa allo stadio di microscopio riscaldato. Designare 3 pozzi su 4 come repliche tecniche per il trattamentoantibiotico e considerare il 4 ° pozzo come un controllo senza trattamento, contenente solo cellule Pa in SCFM2, senza antibiotico. Identificare gli aggregati utilizzando la microscopia a campo luminoso all'interno della scheda Individua prima di qualsiasi eccitazione dei reporter fluorescenti. Definire un'area per l'imaging all'interno di ciascun pozzo e memorizzarne la posizione (coordinate x-y-z) utilizzando il modulo Posizioni nel software di imaging.</li>
	<li>Utilizzare un obiettivo di immersione in olio 63x per visualizzare colture di Pa contenenti il plasmide di espressione GFP pMRP9-1 in SCFM2 con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 509 nm. Scatta immagini utilizzando l'opzione z-stack all'interno del modulo di acquisizione a intervalli di 1 μm (totale di 60 fette). Utilizzare il modulo Line-mediaaging per ridurre la fluorescenza di fondo nel canale GFP all'interno del volume totale delle immagini z-stack da 60 μm (1.093,5 mm3). Prendi le immagini di controllo di SCFM2 non inoculato utilizzando impostazioni identiche per determinare la fluorescenza di sfondo per l'analisi delle immagini. NOTA: le immagini vengono acquisite producendo immagini z-stack a 8 bit a 8 bit da 512 pixel x 0,26 pixel a 8 μm (0,26 μm pixel) che si trovano a 60 μm dalla base del coverslip.</li>
	<li>Utilizzare l'opzione serie temporali all'interno del software di imaging per acquisire 60 fette in ogni posizione (pozzo) a intervalli di 15 minuti per un periodo di 18 ore. Utilizzare la strategia di messa a fuoco definita all'interno del software per memorizzare un piano focale per ogni posizione, che viene restituito in ogni punto temporale durante l'esperimento.</li>
	<li>Dopo un totale di 4,5 ore di incubazione, immagina ogni posizione utilizzando le impostazioni di cui sopra per determinare la biomassa aggregata all'interno di ciascuno dei quattro pozzedi prima dell'aggiunta di antibiotico.</li>
	<li>Dopo 6 ore di incubazione totale, aggiungere antibiotico a 2 volte al di sotto della concentrazione minima inibitoria (MIC) a ciascuna replicazione. Pipettare direttamente e delicatamente nel mezzo del pozzo, appena sotto l'interfase aria-liquido. Mantenere tutte le colture nella camera confocale riscaldata. NOTA: Qui è stato utilizzato colistina solfato ad una concentrazione di 140 μg/mL.</li>
	<li>Inizia il trattamento post-antibiotico di imaging facendo clic sull'opzione Avvia esperimento all'interno del programma di imaging. NOTA: La concentrazione di antibiotici utilizzati dipende dall'antibiotico, dall'isolato di Pa e dal fatto che l'utente desideri esaminare gli effetti di uccisione o tolleranza. Questo esperimento utilizza una singola dose. Ulteriori dosi possono essere aggiunte senza interrompere le colture, se necessario.</li>
</ol>4. Colorazione dello ioduro di propidio degli aggregati di Pa
NOTA: Lo ioduro di propidio (PI) è comunemente utilizzato come reagente colorante per identificare cellule batteriche non vitali (morte) in coltura. Qui, viene utilizzato per identificare gli aggregati sensibili al trattamento antibiotico applicato nella sezione 3. In tutto questo protocollo, l'espressione e il rilevamento di GFP nelle cellule Pa viene utilizzato come proxy principale per la vitalità cellulare. Questa fase finale consente di utilizzare ancora una volta l'imaging confocale per identificare il posizionamento spaziale di aggregati vivi / morti in relazione tra loro. Inoltre, gli aggregati sono identificati come vivi/morti per un ulteriore smistamento cellulare a valle nella sezione 5.
<ol><li>Dopo 18 ore, aggiungere PI a ciascun pozzo della parabola ottica a quattro camere contenente colture SCFM2. Seguire le istruzioni del produttore per il volume di PI e il tempo di incubazione(ad esempio,~ 2 μL per mL di coltura, ~ 20-30 min).</li>
</ol>5. Isolare le cellule vive dagli aggregati utilizzando un approccio FACS
NOTA: FACS presenta una potente piattaforma per ordinare e isolare gruppi di cellule in base a un fenotipo con tag fluorescenti. Qui, FACS viene utilizzato per isolare aggregati vivi (tolleranti agli antibiotici) da aggregati non vitali.
<ol><li>Dopo la colorazione con ioduro di propidio, rimuovere le colture dall'incubazione e trasferirle su uno strumento FACS in un contenitore isolato per mantenere 37 °C.</li>
	<li>Eseguire aliquote da 1 mL di SCFM2 contenenti aggregati di Pa alla portata più bassa. NOTA: ogni aliquota conterrà ~15.000 aggregati.</li>
	<li>Per rilevare la GFP, illuminare le celle con un laser a 488 nm e registrare l'altezza del segnale fluorescente a 530/30 nm. Visualizza la colorazione PI per eccitazione con un laser a 561 nm e registra l'altezza del segnale fluorescente a 610/20 nm. Eseguire l'ordinamento utilizzando un ugello da 70 u. NOTA: le aggregazioni ordinate possono essere raggruppate in più modi a seconda dell'applicazione dell'utente. In questo caso, FACS è stato utilizzato per ordinare aggregati di Pa vitali per il sequenziamento dell'RNA a valle. Le applicazioni alternative sono discusse di seguito.</li>
</ol>6. Analisi delle immagini
NOTA: la microscopia time-lapse genera grandi quantità di dati. Un esperimento di 18 ore per l'osservazione di aggregati di Pa in SCFM2 identifica circa 50.000 aggregati nel tempo, che hanno il potenziale per essere caratterizzati per il volume e il posizionamento spaziale. Utilizzare un software di analisi delle immagini per quantificare le dinamiche di aggregazione in SCFM2:
<ol><li>Per gli studi aggregati in SCFM2, quantificare la fluorescenza GFP di fondo creando un istogramma di conteggi nel canale GFP che viene prodotto per SCFM2 e SCFM2 non inoculati inoculati con ceppo Pa PAO1 che trasporta pMRP9-1. Per garantire che i voxel GFP rilevati siano correlati alla biomassa Pa, definire un voxel GFP+ come ≥ 1,5 volte il valore di conteggio dello sfondo GFP. NOTA: La fluorescenza di fondo è definita come il più alto valore voxel di tre posizioni scelte casualmente, mediate. I conteggi degli sfondi sono, come misura standard, sottratti da tutti i pixel nelle immagini sperimentali dal software di analisi delle immagini.</li>
	<li>Dopo la sottrazione di sfondo nel modulo Surpass, produrre isosuperfici per tutti i voxel rimanenti.</li>
	<li>Per rilevare singole aggregazioni, attivare l'opzione Dividi oggetti e definire le aggregazioni come oggetti con volumi di ≥5 μm3. Utilizzare il modulo Vantage nel software di analisi delle immagini per calcolare il volume, x-y-z e la somma dei voxel GFP per ogni singolo oggetto. Esporta questi dati su una piattaforma statistica esterna. NOTA: alcuni software di analisi delle immagini consentono l'esportazione di più fentoipi quantitativi contemporaneamente, consentendo di calcolare le correlazioni.</li>
	<li>Filtrare i dati esportati dal modulo Vantage in base alle dimensioni per garantire che non rimangano oggetti di &lt;0,5μm 3 (biomassa dispersa). Per ogni singolo oggetto all'interno dell'immagine, calcolare la distanza da se stessa in relazione ad altri oggetti (aggregati) utilizzando il modulo Vantage del software di analisi delle immagini o manualmente con la seguente equazione. d = sqrt((x2− x1)2 + (y2− y1)2 + (z2− z1)2) (1)</li>
	<li>Utilizzare i calcoli SUM e AVERAGE per trovare la biomassa totale e il volume aggregato medio. In alternativa, esportare i dati in altre piattaforme statistiche o script, ad esempiola distribuzione di aggregati attraverso la biomassa come discusso nei risultati rappresentativi (script non pubblicato in collaborazione con il laboratorio Whiteley, Georgia Institute of Technology).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Questo lavoro ha introdotto metodologie che possono essere combinate per studiare le popolazioni di aggregati batterici in presenza e assenza di trattamento antibiotico. ClSM ad alta risoluzione consente la visualizzazione dei cambiamenti nella biomassa aggregata e l'orientamento strutturale degli aggregati in tempo reale quando esposti agli antibiotici. Inoltre, le caratteristiche fisiche e strutturali della biomassa che rimangono dopo il trattamento con antibiotici possono essere quantificate, con l'obiettivo di correl...

Pseudomonas aeruginosa (Pa) è un patogeno opportunistico che stabilisce infezioni croniche in individui immuno-compromessi. Per quelli con la malattia genetica fibrosi cistica (FC), queste infezioni possono durare nel corso della vita. La FC provoca l'accumulo di un espettorato viscoso e ricco di sostanze nutritive nelle vie aeree, che viene colonizzato da una varietà di agenti patogeni microbici nel tempo. Pa è uno dei patogeni CF più diffusi, colonizzando le vie aeree nella prima infanzia e stabilendo infezioni difficili da trattare1. La Pa rimane un problema clinico significativo ed è considerata una delle principali cause di mortalità in quelli con FC, nonostante i regimi terapeutici migliorati negli ultimi anni2,3. Questo fenotipo di persistenza e la crescente tolleranza agli antibiotici hanno fatto guadagnare a Pa un posto in un gruppo di patogeni identificati sia dai Centers for Disease Control (CDC) che dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) come priorità di ricerca per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche: i patogeni ESKAPE4.
Come altri patogeni ESKAPE, la resistenza agli antibiotici acquisita è comune in Pa, ma ci sono anche molte proprietà intrinseche che contribuiscono alla tolleranza antimicrobica Pa. Tra questi c'è la capacità di Pa di formare aggregati-cluster altamente densi di ~ 10-1.000 cellule, che possono essere osservati in infezioni multiple, tra cui l'espettorato del paziente CF5,6. Simile alla Pa studiata in altri sistemi di biofilm, gli aggregati di Pa mostrano fenotipi clinicamente rilevanti come l'aumento della resistenza agli antibiotici e l'attivazione della comunicazione cellula-cellula (quorum sensing (QS)). Ad esempio, gli aggregati di Pa hanno dimostrato di utilizzare comportamenti regolati da QS per combattere altri microbi e tollerare trattamenti antimicrobici come la produzione di piocianina7. La capacità di studiare tali comportamenti offre una visione emozionante degli ecosistemi batterici in un ambiente simile a quello in cui esistono nel corpo umano.
Una delle maggiori sfide per studiare come gli aggregati di Pa rispondono al mutevole ambiente dell'espettorato è la mancanza di sistemi nutrizionalmente rilevanti e robusti che promuovano la formazione di aggregati. Gran parte di ciò che si sa sulla Pa è stato scoperto utilizzando sistemi in vitro in cui le cellule crescono planctonicamente o in una caratteristica architettura "a fungo" attaccata alla superficie che non è stata osservata in vivo8. Mentre i modelli classici di crescita del biofilm, come le cellule di flusso o l'agar solido, hanno prodotto una conoscenza ampia e preziosa sui comportamenti batterici e sui meccanismi di tolleranza agli antibiotici, questi risultati non sempre si traducono in vivo. Molti modelli in vitro hanno una capacità limitata di imitare l'ambiente di crescita del sito di infezione umana, rendendo necessari costosi studi in vivo. A loro volta, molti modelli in vivo mancano della flessibilità e della risoluzione offerte dalle tecniche in vitro. 
L'espettorato sintetico della fibrosi cistica (SCFM2) è progettato per fornire un ambiente per la crescita di Pa simile a quello sperimentato durante l'infezione cronica nel polmone CF. SCFM2 include fonti nutrizionali identificate nella CF sputa espettorata oltre a mucina, lipidi e DNA. La crescita di Pa in SCFM2 richiede un set genetico quasi identico a quello richiesto per la crescita nell'espettorato reale e supporta la formazione naturale di aggregati di Pa 9,10. Dopo l'inoculazione, le cellule planctoniche formano aggregati che aumentano di dimensioni attraverso l'espansione. Le singole cellule (denominate migranti) vengono rilasciate dagli aggregati, migrano verso aree non colonizzate e formano nuovi aggregati10. Questa storia di vita può essere osservata utilizzando CLSM e l'analisi delle immagini alla risoluzione di una singola cellula. Gli aggregati di Pa formati in SCFM2 sono di dimensioni simili a quelli osservati nel polmone CF10. Questo modello consente l'osservazione di aggregati multipli di varie dimensioni in tempo reale e in tre dimensioni su scala micron. La microscopia time-lapse consente il tracciamento di migliaia (~ 50.000) di aggregati in un unico esperimento. L'uso di software di analisi delle immagini consente la quantificazione di fenotipi aggregati da micrografie, tra cui volume aggregato, superficie e posizione in tre dimensioni fino all'aeroporto di 0,1 μm, sia a livello di aggregato individuale che di popolazione. Avere la capacità di raggruppare gli aggregati per fenotipo e posizione consente la differenziazione degli aggregati in diversi stadi di sviluppo con precisione, nonché la loro risposta a un microambiente mutevole6,11.
L'applicazione di SCFM2 per studiare aggregati di Pa in saggi a basso volume e ad alto rendimento lo rendono un modello flessibile ed economico. Come mezzo definito, SCFM2 offre uniformità e riproducibilità su più piattaforme, fornendo un metodo nutrizionalmente e fisicamente rilevante per studiare gli aggregati di Pa in vitro9. Le applicazioni includono il suo uso in combinazione con CLSM per osservare l'organizzazione spaziale e la tolleranza agli antibiotici ad alta risoluzione (come descritto in questo documento sui metodi). La capacità di eseguire esperimenti che forniscono dati in tempo reale su scala micron consente lo studio delle interazioni intra-specie e inter-specie come possono verificarsi in vivo. Ad esempio, SCFM2 è stato precedentemente utilizzato per studiare le dinamiche spaziali della comunicazione cellula-cellula in popolazioni aggregate attraverso una rete di sistemi utilizzati da Pa per regolare più geni che contribuiscono alla virulenza e alla patogenesi6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione grafica delle principali fasi sperimentali. (A) SCFM2 viene inoculato con cellule Pa e lasciato formare aggregati in un piatto di coltura con fondo di vetro. (B) Gli aggregati vengono trasferiti al microscopio confocale e viene aggiunto l'antibiotico. Sono raffigurate tre repliche tecniche (camere 1-3) e un pozzo di controllo (4) di SCFM2 inoculato senza trattamento antibiotico. Gli aggregati vengono ripresi utilizzando CLSM nel corso di 18 ore. (C) Dopo l'imaging iniziale di 18 ore, gli aggregati vengono trattati con ioduro di propidio per visualizzare le cellule morte e ripresi utilizzando CLSM (D) Gli aggregati con fenotipo desiderato vengono separati da SCFM2 utilizzando FACS. Abbreviazioni: SCFM2 = mezzo espettorato sintetico della fibrosi cistica; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopia a scansione laser confocale; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Qui, viene dimostrata l'utilità di SCFM2 per studiare l'impatto del trattamento antibiotico sugli aggregati di Pa in tempo reale, seguita dall'uso di un approccio di ordinamento cellulare per isolare popolazioni di aggregati con fenotipi distinti per l'analisi a valle (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Aminoacidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alanina</td><td>Acros Organics</td><td>56-41-7</td><td></td></tr><tr><td>Arginina HCl</td><td>MP</td><td>1119-34-2</td><td></td></tr><tr><td>Asparagina</td><td>Acros Organics</td><td>56-84-8</td><td>Preparato in 0,5 M NaOH</td></tr><tr><td>Cistina HCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06328</td><td></td></tr><tr><td>Acido glutammico HCl</td><td>Acros Organics</td><td>138-15-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Acros Organics</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Istidina HCl H2O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17627</td><td></td></tr><tr><td>Isoleucina</td><td>Acros Organics</td><td>73-32-5</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12311</td><td></td></tr><tr><td>Lisina HCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62099</td><td></td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Acros Organics</td><td>63-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Ornitina HCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12111</td><td></td></tr><tr><td>Fenilalanina</td><td>Acros Organics</td><td>63-91-2</td><td></td></tr><tr><td>Prolina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10199</td><td></td></tr><tr><td>Serina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11179</td><td></td></tr><tr><td>Treonina</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Triptofano</td><td>Acros Organics</td><td>73-22-3</td><td>Preparato in 0,2 m NaOH</td></tr><tr><td>Tirosina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11141</td><td>Preparato in 1,0 M NaOH</td></tr><tr><td>Valina</td><td>Acros Organics</td><td>72-18-4</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Alfa Aesar</td><td>J6194903</td><td></td></tr><tr><td>Giorno di scorte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 * 2H2O</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio (D-glucosio)</td><td>Fisher Chemical</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td><td>4235-95-4</td><td>agitare 15-20 min a 37 &deg; C per evaporare il cloroformio</td></tr><tr><td>FeSO4 * 7H2O</td><td>Acros Organics</td><td>7782-63-0</td><td>questo stock equivale a 1 mg/mL, DEVE fare acido</td></tr><tr><td>L-lattico</td> fresco <td>Alfa Aesar</td><td>L13242</td><td>pH stock a 7 con NaOH</td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H2O</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilglucosamina</td><td>&nbsp; TCI</td><td>A0092</td><td></td></tr><tr><td>Solidi</td><td></td><td></td><td></td>preparati</tr><tr><td>Mucina suina</td><td>Sigma</td><td>M1778-100G</td><td>UV-sterilize</td></tr><tr><td>Sperma di salmone DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Colorazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Alfa Aesar</td><td>J66764MC</td><td></td></tr><tr><td>Sali K</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2SO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13975</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64189</td><td>aggiungere solido direttamente alla base tamponata</td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Acros Organics</td><td>7757-79-1</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12914</td><td>aggiungere solido direttamente alla base tamponata</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td>aggiungere solido direttamente alla base tamponata</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>RPI</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>RPI</td><td>S23120-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Acros Organics</td><td>12125-02-9</td><td>aggiunge solido direttamente alla base tamponata</td></tr><tr><td>Materiali di</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>consumoProvette coniche (15 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche (50 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>28-106</td><td></td></tr><tr><td>Provette per colture con tappo per flusso d'aria</td><td>Olympus plastics</td><td>21-129</td><td></td></tr><tr><td>Piatto a quattro camere da 35 mm con fondo in vetro</td><td>CellVis</td><td>NC0600518</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) brodo</td><td>Genessee Scientific</td><td>11-118</td><td></td></tr><tr><td>Soluzioni saline tamponate con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2944100</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette (p200)</td><td>Olympus plastics</td><td>23-150RL</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette (p1000)</td><td>Olympus plastics</td><td>23-165RL</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (5 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (25 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (50 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultrapura (senza RNasi/DNasi); acqua nanopura</td><td>Genessee Scientific</td><td>18-194</td><td>Acqua nanopura utilizzata per la preparazione di soluzioni in Tabella 1</td></tr><tr><td>Siringhe (10&nbsp; mL)</td><td>BD</td><td>794412</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe (50 mL)</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>0,22 mm Filtro per siringhe in PES</td><td>Olympus</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>PS cuvetta semi-mico</td><td>Olympus plastics</td><td>91-408</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td></td><td></td><td>Per preparare le figure</td></tr><tr><td>FacsDiva6.1.3</td><td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>versione 9.6</td></tr><tr><td>Zen Black</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FacsAriallu</td><td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 microscopio a scansione laser confocale</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

strumenti per la valutazione in tempo reale di un modello di infezione da pseudomonas aeruginosa

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) è uno dei più comuni patogeni opportunistici associati alla fibrosi cistica (FC). Una volta stabilita la colonizzazione della Pa, gran parte dei batteri infettivi forma biofilm all'interno dell'espettorato delle vie aeree. I biofilm di Pa isolati dall'espettorato CF hanno dimostrato di crescere in piccoli aggregati densi di ~ 10-1.000 cellule che sono organizzate spazialmente e mostrano fenotipi clinicamente rilevanti come la tolleranza antimicrobica. Una delle maggiori sfide per studiare come gli aggregati di Pa rispondono al mutevole ambiente dell'espettorato è la mancanza di sistemi nutrizionalmente rilevanti e robusti che promuovano la formazione di aggregati. Utilizzando un mezzo sintetico per l'espettorato CF (SCFM2), la storia di vita degli aggregati di Pa può essere osservata utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) e l'analisi delle immagini alla risoluzione di una singola cellula. Questo sistema in vitro permette l'osservazione di migliaia di aggregati di varie dimensioni in tempo reale, tridimensionali, e su scala micron. A livello individuale e di popolazione, avere la capacità di raggruppare gli aggregati per fenotipo e posizione facilita l'osservazione degli aggregati in diversi stadi di sviluppo e la loro risposta ai cambiamenti nel microambiente, come il trattamento antibiotico, da differenziare con precisione.

Questo lavoro descrive i metodi per osservare gli aggregati di Pa ad alta risoluzione e in un ambiente simile a quello dell'infezione cronica del polmone CF9,10,12. SCFM2 fornisce un sistema in vitro che promuove l'aggregazione naturale delle cellule Pa in dimensioni simili a quelle osservate durante l'infezione effettiva10. L'adattabilità di SCFM2 come mezzo definito può essere...

Il mezzo espettorato della fibrosi cistica sintetica (SCFM2) può essere utilizzato in combinazione sia con la microscopia a scansione laser confocale che con lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per osservare aggregati batterici ad alta risoluzione. Questo documento descrive in dettaglio i metodi per valutare le popolazioni aggregate durante il trattamento antimicrobico come piattaforma per studi futuri.

Strumenti per la valutazione in tempo reale di un modello di infezione da Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Il nostro protocollo ci fornisce un modo per studiare i batteri resistenti agli antibiotici in un ambiente nutrizionale e fisico simile a come probabilmente esistono in vivo. Uno dei maggiori vantaggi di questa tecnica è la capacità di catturare immagini ad alta risoluzione e dati fenotipici di batteri in dimensioni di popolazione rilevanti per l'infezione. Si tratta di aggregati di circa 10-1.000 celle.A dimostrare la procedura sarà Alexa Gannon, un'assistente di ricerca laureata del mio laboratorio. Per iniziare, sterilizzare il mezzo contenente mucina sotto luce ultravioletta per quattro ore. Trasferire la mucina trattata con UV in tubi sterili da 1,7 millilitro in condizioni sterili e conservare i tubi a meno 20 gradi Celsius.Dopo aver preparato la base tamponata, aggiungere la soluzione stock di mucina nella base tamponata contenente DNA come descritto nel manoscritto di testo. La sera prima dell'esperimento, inoculare cinque millilitri di brodo LB con diverse colonie di Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 da un antibiotico contenente piastra di agar LB e colturare i batteri durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 250 giri al minuto. La mattina successiva, almeno due ore prima di iniziare l'esperimento, accendere il microscopio a scansione laser confocale e aprire il modulo di incubazione nel software di imaging associato.Diluire 500 microlitri della coltura in cinque millilitri di brodo LB fresco e incubare la sospensione batterica a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto per 60-90 minuti. Quando i batteri sono entrati nella fase logaritrica, pellettizzate le cellule batteriche per centrifugazione e lavate le cellule tre volte con PBS sterilizzato con filtro. Dopo l'ultimo lavaggio, risusegnare il pellet in un millilitro di PBS.Misurare l'assorbanza della sospensione cellulare batterica a 600 nanometri per determinare il volume di coltura richiesto per una densità ottica di 0,05 in cinque millilitri di fibrosi cistica sintetica espettorato medio due. Inoculare delicatamente il volume calcolato di sospensione cellulare batterica nel mezzo e vortice prima di aggiungere un millilitro di cellule a ciascuna camera di una coltura ottica a quattro camere, quindi incubare i batteri per quattro ore in condizioni statiche a 37 gradi Celsius. Per l'immagine degli aggregati di Pseudomonas aeruginosa al microscopio a scansione laser confocale, alla fine dell'incubazione, designare tre pozzetti della piastra di coltura come replica il trattamento antibiotico e uno non come controllo del non trattamento e posizionare la piastra sullo stadio riscaldato nel microscopio.Selezionare un obiettivo di immersione in olio 63X e aprire la scheda di localizzazione per identificare gli aggregati batterici nel campo luminoso. Definire un'area per l'imaging all'interno di ciascun pozzo e utilizzare il modulo posizioni per memorizzare la posizione dell'area. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 488 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione su 509 nanometri.Nel modulo di acquisizione, selezionare l'opzione Z-stack per acquisire le immagini e utilizzare il modulo di media linea per ridurre la fluorescenza di sfondo nel canale GFP all'interno del volume totale delle immagini Z-stack. Imposta l'opzione della serie temporale per catturare 60 fette in ogni pozzo a intervalli di 15 minuti per 18 ore e usa la strategia di messa a fuoco definita per memorizzare un piano focale per ogni posizione che verrà ri-ripreso in ogni punto temporale durante l'esperimento. 4-1/2 ore dopo aver impostato l'esperimento di imaging, immagine di ogni posizione per determinare la biomassa aggregata all'interno di ciascuno dei quattro pozzi prima dell'aggiunta dell'antibiotico.Dopo sei ore, aggiungere delicatamente l'antibiotico due volte al di sotto della concentrazione inibitoria minima al centro di ciascun pozzo, basta soffiare l'interfaccia del liquido d'aria e fare clic su Avvia esperimento per iniziare l'imaging post-trattamento antibiotico. Per isolare le cellule vive, alla fine del periodo di imaging di 18 ore, etichettare i batteri in ciascun pozzetti con il volume appropriato di ioduro di propidio secondo le raccomandazioni del produttore. Alla fine dell'incubazione, utilizzare un contenitore isolato per trasferire la piastra al citometro a flusso e impostare il citometro per rilevare GFP e ioduro di propidio utilizzando un ugello da 70 micron, quindi eseguire aliquote di un millilitro di ciascun surnatante di coltura alla portata più bassa per ordinare gli aggregati di Pseudomonas aeruginosa negativi allo ioduro di propidio GFP-positivi e non vitali.Per quantificare la dinamica aggregata, caricare le immagini in un apposito programma software di analisi delle immagini e creare istogrammi dei conteggi prodotti per il controllo non trattato e le colture trattate con antibiotici nel canale GFP per consentire la quantificazione della fluorescenza di fondo. Per garantire che i voxel GFP rilevati siano correlati alla biomassa batterica, definire un voxel GFP-positivo come maggiore o uguale a 1,5 volte il valore di conteggio di fondo GFP. Produrre le superfici ISO per tutti i voxel rimanenti e per rilevare i singoli aggregati, abilitare l'opzione split objects e definire gli aggregati come oggetti.Utilizzare il modulo di osservazione per calcolare il volume XYZ e la somma dei voxel GFP per ogni singolo oggetto. Esporta questi dati su una piattaforma statistica esterna. Filtrare i dati esportati per dimensione per definire oggetti con volumi maggiori o uguali a cinque micrometri cubi.Rimuovere eventuali oggetti inferiori a 0,5 micrometri cubi e utilizzare il modulo di osservazione per calcolare la distanza di ciascun oggetto in relazione ad altri oggetti all'interno di ciascuna immagine. In alternativa, la distanza può essere calcolata utilizzando la formula, quindi utilizzare la somma e i calcoli medi per determinare la biomassa totale nel volume aggregato medio. Sebbene più aggregati batterici vitali rimangano dopo quattro ore di applicazione dell'antibiotico, la biomassa totale delle popolazioni aggregate all'interno delle colture trattate con antibiotici è significativamente ridotta rispetto a quella delle colture non trattate.La microscopia a serie temporali può essere utilizzata per determinare i modelli spaziali tra aggregati sensibili positivi allo ioduro di propidio e aggregati GFP-positivi tolleranti dopo il trattamento antibiotico. Calcolando come gli aggregati di diverse dimensioni contribuiscono alla popolazione complessiva, è possibile identificare i modelli di come gli aggregati rispondono al trattamento antibiotico in relazione alle loro dimensioni, forma e posizione. Dopo il trattamento antibiotico, gli aggregati vitali e non vitali possono essere separati con successo in base alla loro espressione del segnale fluorescente.Speriamo che questo protocollo ispiri altri ricercatori a studiare il loro organismo di scelta con una risoluzione simile. Il nostro obiettivo è trovare fili biologici comuni in queste comunità complesse indipendentemente dal sito di infezione.

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Questo articolo descrive diversi metodi di...

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Fonte: Chen, Y., et al. Valutazione della virulenza e della patogenesi dell'infezione da Aeromonas in un modello di Caenorhabditis elegans . J. Vis. Esp. (2018)Questo video mostra un test di sopravvivenza che utilizza C. elegans per modellare la patogenesi di Aeromonas , dove l'ingestione orale del batterio porta a infezioni intestinali e mortalità, consentendo una valutazione quantitativa della virulenza batterica in un sistema ospite vivo.

Modellazione della patogenesi di Aeromonas in C. elegans utilizzando un test di sopravvivenza

Questo video mostra una tecnica in vitro per studiare l'impatto del trattamento antimicrobico sugli aggregati di Pseudomonas aeruginosa (Pa). Le cellule Pa marcate in fluorescenza vengono coltivate come aggregati, imitando il modello di crescita durante l'infezione. Dopo aver sfidato gli aggregati con una concentrazione subletale dell'antibiotico colistina, la valutazione in tempo reale dell'interazione batterio-antibiotico viene eseguita tramite microscopia a fluorescenza.

Una tecnica in vitro per studiare trattamenti antimicrobici su aggregati batterici

Viene descritto un metodo per stabilire infezioni polmonari in roditori immunocompetenti. Con competenza, questo metodo può essere eseguito rapidamente e facilmente per indurre un'infezione stabile con molti isolati di S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae e A. baumannii.

Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Qui, presentiamo un protocollo per misurare la virulenza dei batteri planctonici o collegata alla superficie mediante d. discoideum (ameba) come un ospite. Virulenza viene misurato su un periodo di 1 h e host uccidendo è quantificata mediante analisi di immagine e microscopia di fluorescenza. Dimostriamo questo protocollo utilizzando il batterio p. aeruginosa.

Un'analisi di virulenza batterica basata su immagine rapida usando ameba

Descriviamo un protocollo di inoculazione ritardata per generare infezioni croniche delle ferite nei topi immunocompetenti.

Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica di Pseudomonas aeruginosa Wound

Descriviamo un protocollo per un modello di co-coltura tridimensionale di vie aeree infette, utilizzando CFBE41o- cellule, macrofagi THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, stabilito presso l'interfaccia aria-liquido. Questo modello fornisce una nuova piattaforma per testare simultaneamente l'efficacia antibiotica, la funzione della barriera epiteliale e i marcatori infiammatori.

P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

Questo flusso di lavoro può essere utilizzato per eseguire test di suscettibilità agli antibiotici utilizzando un modello ex vivo stabilito di biofilm batterico nei polmoni di individui con fibrosi cistica. L'uso di questo modello potrebbe migliorare la validità clinica dei test MBEC (concentrazione minima di eradicazione del biofilm).

Test di efficacia antibiotica in un modello ex vivo di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus Biofilms nel polmone della fibrosi cistica

Questo studio presenta un quadro standardizzato per l'ottimizzazione dei modelli di infezione da G. mellonella da utilizzare nella valutazione antimicrobica preclinica. L'applicazione di un modello di G. mellonella come parte di una pipeline di sviluppo antimicrobico preclinico potrebbe ridurre il numero di composti inefficaci che progrediscono verso gli studi clinici.

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Protocollo che descrive l'applicazione di un sistema di cella di flusso per la coltivazione e l'analisi biofilm microbici per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM).

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