Analisi a livello di genoma della distribuzione delle modificazioni isoniche utilizzando il metodo di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina in Magnaporthe oryzae
2 giugno 2021
Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la distribuzione a livello di genoma delle modifiche istoniche, che può identificare nuovi geni bersaglio nella patogenesi di M. oryzae e altri funghi filamentosi.
Questo metodo può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari alla base della regolazione dei geni bersaglio candidati attraverso modificazioni epigenetiche durante la patogenesi fungina nella patologia vegetale. La tecnologia di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina può rilevare in modo efficiente i segmenti di DNA che interagiscono con gli istoni e i fattori di trascrizione nell'intero genoma. Rispetto ad altri metodi, può migliorare l'efficienza e la risoluzione.
Inizia aggiungendo 100 microlitri di mezzo liquido completo ai piatti Agger di pomodoro di farina d'avena usando una pipetta da 100 microlitri. Usando un ciclo di inoculazione, raschiare i miceli del ceppo wild type e del ceppo knockout. Raccogliere i detriti miceli e trasferirli in 250 millilitri di mezzo liquido completo.
Lavare le ife fungine con 500 millilitri di soluzione di cloruro di sodio molare 0,7. Quindi raccogliere il micelio fungino e pesarlo. Aggiungere circa un millilitro di soluzione di permeazione enzimatica di lisi per un grammo di micelio fungino.
Posizionare le ife per la lezione a 28 gradi Celsius per tre o quattro ore con agitazione a 150 RPM. Lavare le ife a pidocchi con 50 millilitri di soluzione di cloruro di sodio molare 0,7. Centrifugare il campione ed eliminare accuratamente il surnatante.
Sospendere di riconsegnare il protoplasto in 20 millilitri di soluzione di cloruro di sodio molare. Aggiungere 55 microlitri di formaldeide al 37% goccia a goccia a due millilitri di tampone di cloruro di sodio contenente protoplasti per reticolare fino a quando la concentrazione finale è dell'1%Per estinguere la formaldeide non reatta, aggiungere 20 microlitri di 10 volte glicina a ciascun tubo. Scartare accuratamente il surnatante dopo la centrifugazione.
Sospendere di due anni il pellet in un millilitro di soluzione di cloruro di sodio molare. Scartare accuratamente il surnatante dopo la centrifugazione e sospendere di riconsegenza il pellet in 750 microlitri di tampone RIPA. Aggiungere 37,5 microlitri di 20 volte inibitore della proteasi.
Tagliare la cromatina mediante sonicazione per otto minuti utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni. Dopo che il campione è stato rotto ad ultrasuoni, estrai una parte del campione come input contenente tutto il DNA e le proteine rilasciate dopo che il campione è stato sonicato. Per analizzare la lunghezza dei frammenti di DNA, eseguire un'elettroforesi su gel di agarose all'1% dopo la sonicazione.
Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante centrifugato in un tubo centrifugato da 1,5 millilitro e conservarlo a 80 gradi Celsius negativi per un uso successivo. Prima di eseguire l'esperimento IP, diluire ogni campione di cromatina in un rapporto da uno a 10 con una volta tampone RIPA. Pipettare 50 microlitri di perle proteiche super paramagnetiche in un tubo centrifugo da due millilitri.
Posizionare i tubi su un supporto magnetico e lasciare precipitare le perle magnetiche. Quindi rimuovere il surnatante. Aggiungere un millilitro di tampone RIPA pre-raffreddato una volta al tubo e lavare tre volte le perle proteiche super paramagnetiche.
Posizionare i tubi su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante. Aggiungere 100 microlitri di un buffer RIPA una tantum a ciascun tubo. Aggiungere al tubo 30 microlitri del campione di cromatina, 100 microlitri di perle proteiche super paramagnetiche e quattro microlitri di anticorpo H3K4me3, mescolandoli bene.
Posizionare i campioni su uno shaker rotativo per incubarli durante la notte a quattro gradi Celsius a 30 volte G.Lavare l'anticorpo super paramagnetico della proteina perla e il complesso cromatinico risospegnando le perle in un millilitro di una volta tampone RIPA. Lavare il campione con un millilitro di tampone di lavaggio immuno complesso a basso contenuto di sale, quindi con un millilitro di tampone di lavaggio immuno complesso ad alto contenuto di sale. Risciacquare le perle con un millilitro di tampone al cloruro di litio e rimuovere il surnatante.
Quindi aggiungere un millilitro di tampone TE al tubo. Posizionare nuovamente il tubo con un millilitro di tampone TE e rimuovere il surnatante con una pipetta. Aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione a ciascun tubo della centrifuga.
Eseguire l'eluizione a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Centrifugare per un minuto a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante in nuovi tubi centrifuga. Aggiungere otto microlitri di cinque cloruro di sodio molare a tutti i tubi e incubare a 65 gradi Celsius per quattro o cinque ore o durante la notte per invertire i legami incrociati della proteina del DNA.
Aggiungere un microlitro di Rnase A e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere quattro microlitri di proteinasi K a ciascun tubo e incubare a 45 gradi Celsius per una o due ore. Aggiungere 550 microlitri della miscela di cloroformio fenal e alcol isoamilico al tubo della centrifuga.
Centrifugare per 15 minuti a 10.000 volte G e aspirare il surnatante. Aggiungere al tubo 1/10 di volume di tre soluzione molare di acetato di sodio, 2,5 volumi di etanolo assoluto e tre microlitri di glicogeno. Posizionare il campione in frigorifero a 20 gradi Celsius negativi durante la notte per le precipitazioni.
Il giorno successivo, centrifugare i tubi e scartare il surnatante. Lavare il pellet tre volte con un millilitro di etanolo al 75% appena preparato a 10.000 volte G.Aggiungere 50 microlitri di acqua deionizzata sterile per sciogliere sufficientemente il precipitato. Ripara le estremità del DNA per generare DNA smussato usando un kit di riparazione dell'estremità del DNA e le istruzioni menzionate nel manoscritto di testo.
Per aggiungere la base di adenina alle tre estremità prime, aggiungere 30 microlitri di DNA, due microlitri di acqua, cinque microlitri di 10 volte il tampone Taq, 10 microlitri di un dATP millimolare e tre microlitri di Taq DNA polimerasi a un tubo centrifugo PCR da 0,2 microliti. Mescolarli e reagire in una macchina PCR a 72 gradi Celsius per 10 minuti. Eseguire la legatura del linker mescolando 10 microlitri di DNA, 9,9 microlitri di acqua, 2,5 microlitri di tampone T4 DNA ligasi, 0,1 microlitro di oligo mix adattatore e 2,5 microlitri di T4 DNA ligasi in un tubo centrifugo PCR da 0,2 microlitri.
Incubare il tubo a 16 gradi Celsius per quattro ore. Per amplificare il DNA utilizzando primer PCR, aggiungere 10,5 microlitri di DNA, 12,5 microlitri di mix master due volte ad alta fedeltà. un microlitro di primer PCR PE 1.0 e un microlitro di primer PCR PE 2.0 a un tubo centrifugo PCR da 0,2 microlitter e mescolare bene.
I segnali H3K4me3 dei mutanti di delezione mobre2, mospp1 e moswd2 sono stati significativamente ridotti nelle sue regioni target funzionali. Rispetto al ceppo wild type P131, i segnali delle letture di immunoprecipitazione della cromatina H3K4me3 arricchita nei mutanti di delezione mobre2, mospp1 e moswd2 sono stati in gran parte diminuiti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire chip on chip e chip qPCR.
Sono generalmente utilizzati per esaminare il gene bersaglio a valle di una proteina e studiare le interazioni del DNA proteico in siti di legame del genoma noti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'analisi della distribuzione genomica delle modifiche istoniche in M. oryzae e in altri funghi filamentosi. Il metodo mira a chiarire i meccanismi molecolari che regolano i geni bersaglio tramite modifiche epigenetiche durante la patogenesi fungina.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Patogenesi fungina
- Epigenetica
- Analisi genomica
Sfondo
- Le modifiche degli istoni svolgono un ruolo cruciale nella regolazione genica.
- Comprendere queste modifiche può consentire l'identificazione di nuovi geni bersaglio coinvolti nelle malattie.
- Il sequenziamento dopo immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) è uno strumento potente per questa analisi.
- Patogeni fungini come M. oryzae influiscono sulla salute e sul rendimento delle piante.
Scopo dello studio
- Analizzare le modifiche istoniche nei funghi filamentosi.
- Identificare nuovi geni bersaglio associati alla patogenesi fungina.
- Migliorare la comprensione della regolazione epigenetica nei patogeni vegetali.
Metodi Utilizzati
- Tecnologia di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina.
- Preparazione delle piastre di agar al pomodoro e avena.
- Innoculo di ceppi wild type e knockout.
- Raccolta e trasferimento di miceli in mezzo liquido completo.
Risultati principali
- Rilevamento efficiente di segmenti di DNA che interagiscono con le istoni.
- Migliore risoluzione ed efficienza rispetto ad altri metodi.
- Identificazione di geni bersaglio candidati in M. oryzae.
- Informazioni sulla regolazione epigenetica durante la patogenesi fungina.
Conclusioni
- Il protocollo migliora la comprensione delle modifiche istoniche.
- Fornisce un quadro di riferimento per futuri studi sui patogeni fungini.
- Applicazioni potenziali in patologia vegetale e gestione delle malattie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere la regolazione epigenetica dei geni di virulenza in patogeni fungini come Magnaporthe oryzae fornisce informazioni meccanicistiche utili per la validazione degli obiettivi nella scoperta di antifungini. La mappatura su scala genomica delle modifiche istoniche permette di verificare ipotesi riguardo ai fattori epigenetici alla base della patogenesi, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva nella selezione degli obiettivi. Questo approccio contribuisce a ridurre i rischi nei programmi della fase iniziale collegando gli stati della cromatina all'espressione genica funzionale in sistemi rilevanti per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche collegando i modelli di metilazione delle istoni a geni bersaglio funzionali nella patogenesi fungina.
- Valore operativo: Permette la riduzione del rischio biologico attraverso la risoluzione su scala genomica delle modifiche della cromatina associate alla virulenza.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive identificando loci genomici regolati epigeneticamente.
- Valore operativo: Supporta la standardizzazione dei saggi attraverso protocolli ChIP-seq riproducibili per il profilo delle modifiche istoniche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega le modifiche epigenetiche alla rilevanza delle malattie nei funghi filamentosi, fornendo indicazioni per l'allineamento traslazionale dei biomarcatori.
- Valore operativo: Favorisce la continuità preclinica fornendo una piattaforma per la riduzione del rischio meccanicistico dei bersagli antifungini.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto promettente, fornendo un contesto epigenetico per la regolazione genica nei patogeni.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il mappaggio su scala genomica delle modifiche istoniche.
- Screening: Migliora la prontezza del saggio definendo regioni genomiche epigeneticamente attive per lo screening di composti.
- Analisi: Genera letture quantitative di ChIP-seq che consentono il confronto dell'arricchimento istonico tra ceppi e condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Collega gli stati epigenetici a risultati fenotipici nella patogenesi fungina, sostenendo un avanzamento proporzionato al rischio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il profilo epigenetico nei funghi filamentosi nei programmi antifungini.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile della validazione degli obiettivi grazie a un'analisi meccanicistica della regolazione epigenetica dei geni di virulenza.
- Valore operativo: Standardizzazione e scalabilità del profilo della cromatina per garantire coerenza tra diversi progetti.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto riducendo l'incertezza biologica nella selezione degli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione degli obiettivi aggiustata per il rischio, basata su evidenze epigenetiche della rilevanza funzionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura fungina, nella preparazione della cromatina e nella preparazione delle librerie di sequenziamento.
- Presuppone l'accesso a infrastrutture per la sonificazione, l'immunoprecipitazione e il sequenziamento ad alto rendimento.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli per l'analisi delle modifiche istoniche tra diversi ceppi.
- Comporta la necessità di adattamenti per diverse specie fungine e la validazione degli anticorpi per i marcatori istonici.
- Comprende limitazioni pratiche, come la specificità degli anticorpi e l'efficienza della frammentazione della cromatina, che influenzano la qualità dei dati.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Preparation of Protoplasts from M. oryzae
1:48
In Vivo Crosslinking and Sonication
3:22
IP of Crosslinked Protein/DNA
4:23
Collecting and Rinsing the IP Products
5:04
Elution and Reverse Crosslinking of Protein/DNA Complexes
5:56
Purification and Recovery of DNA
6:51
DNA Repair and Solexa Library Construction
8:23
Results: Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method for Genome-wide Histone Modification Analysi
8:53
Conclusion
