Analisi a livello di genoma della distribuzione delle modificazioni isoniche utilizzando il metodo di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina in Magnaporthe oryzae

Questo metodo può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari alla base della regolazione dei geni bersaglio candidati attraverso modificazioni epigenetiche durante la patogenesi fungina nella patologia vegetale. La tecnologia di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina può rilevare in modo efficiente i segmenti di DNA che interagiscono con gli istoni e i fattori di trascrizione nell'intero genoma. Rispetto ad altri metodi, può migliorare l'efficienza e la risoluzione.

Inizia aggiungendo 100 microlitri di mezzo liquido completo ai piatti Agger di pomodoro di farina d'avena usando una pipetta da 100 microlitri. Usando un ciclo di inoculazione, raschiare i miceli del ceppo wild type e del ceppo knockout. Raccogliere i detriti miceli e trasferirli in 250 millilitri di mezzo liquido completo.

Lavare le ife fungine con 500 millilitri di soluzione di cloruro di sodio molare 0,7. Quindi raccogliere il micelio fungino e pesarlo. Aggiungere circa un millilitro di soluzione di permeazione enzimatica di lisi per un grammo di micelio fungino.

Posizionare le ife per la lezione a 28 gradi Celsius per tre o quattro ore con agitazione a 150 RPM. Lavare le ife a pidocchi con 50 millilitri di soluzione di cloruro di sodio molare 0,7. Centrifugare il campione ed eliminare accuratamente il surnatante.

Sospendere di riconsegnare il protoplasto in 20 millilitri di soluzione di cloruro di sodio molare. Aggiungere 55 microlitri di formaldeide al 37% goccia a goccia a due millilitri di tampone di cloruro di sodio contenente protoplasti per reticolare fino a quando la concentrazione finale è dell'1%Per estinguere la formaldeide non reatta, aggiungere 20 microlitri di 10 volte glicina a ciascun tubo. Scartare accuratamente il surnatante dopo la centrifugazione.

Sospendere di due anni il pellet in un millilitro di soluzione di cloruro di sodio molare. Scartare accuratamente il surnatante dopo la centrifugazione e sospendere di riconsegenza il pellet in 750 microlitri di tampone RIPA. Aggiungere 37,5 microlitri di 20 volte inibitore della proteasi.

Tagliare la cromatina mediante sonicazione per otto minuti utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni. Dopo che il campione è stato rotto ad ultrasuoni, estrai una parte del campione come input contenente tutto il DNA e le proteine rilasciate dopo che il campione è stato sonicato. Per analizzare la lunghezza dei frammenti di DNA, eseguire un'elettroforesi su gel di agarose all'1% dopo la sonicazione.

Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante centrifugato in un tubo centrifugato da 1,5 millilitro e conservarlo a 80 gradi Celsius negativi per un uso successivo. Prima di eseguire l'esperimento IP, diluire ogni campione di cromatina in un rapporto da uno a 10 con una volta tampone RIPA. Pipettare 50 microlitri di perle proteiche super paramagnetiche in un tubo centrifugo da due millilitri.

Posizionare i tubi su un supporto magnetico e lasciare precipitare le perle magnetiche. Quindi rimuovere il surnatante. Aggiungere un millilitro di tampone RIPA pre-raffreddato una volta al tubo e lavare tre volte le perle proteiche super paramagnetiche.

Posizionare i tubi su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante. Aggiungere 100 microlitri di un buffer RIPA una tantum a ciascun tubo. Aggiungere al tubo 30 microlitri del campione di cromatina, 100 microlitri di perle proteiche super paramagnetiche e quattro microlitri di anticorpo H3K4me3, mescolandoli bene.

Posizionare i campioni su uno shaker rotativo per incubarli durante la notte a quattro gradi Celsius a 30 volte G.Lavare l'anticorpo super paramagnetico della proteina perla e il complesso cromatinico risospegnando le perle in un millilitro di una volta tampone RIPA. Lavare il campione con un millilitro di tampone di lavaggio immuno complesso a basso contenuto di sale, quindi con un millilitro di tampone di lavaggio immuno complesso ad alto contenuto di sale. Risciacquare le perle con un millilitro di tampone al cloruro di litio e rimuovere il surnatante.

Quindi aggiungere un millilitro di tampone TE al tubo. Posizionare nuovamente il tubo con un millilitro di tampone TE e rimuovere il surnatante con una pipetta. Aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione a ciascun tubo della centrifuga.

Eseguire l'eluizione a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Centrifugare per un minuto a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante in nuovi tubi centrifuga. Aggiungere otto microlitri di cinque cloruro di sodio molare a tutti i tubi e incubare a 65 gradi Celsius per quattro o cinque ore o durante la notte per invertire i legami incrociati della proteina del DNA.

Aggiungere un microlitro di Rnase A e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere quattro microlitri di proteinasi K a ciascun tubo e incubare a 45 gradi Celsius per una o due ore. Aggiungere 550 microlitri della miscela di cloroformio fenal e alcol isoamilico al tubo della centrifuga.

Centrifugare per 15 minuti a 10.000 volte G e aspirare il surnatante. Aggiungere al tubo 1/10 di volume di tre soluzione molare di acetato di sodio, 2,5 volumi di etanolo assoluto e tre microlitri di glicogeno. Posizionare il campione in frigorifero a 20 gradi Celsius negativi durante la notte per le precipitazioni.

Il giorno successivo, centrifugare i tubi e scartare il surnatante. Lavare il pellet tre volte con un millilitro di etanolo al 75% appena preparato a 10.000 volte G.Aggiungere 50 microlitri di acqua deionizzata sterile per sciogliere sufficientemente il precipitato. Ripara le estremità del DNA per generare DNA smussato usando un kit di riparazione dell'estremità del DNA e le istruzioni menzionate nel manoscritto di testo.

Per aggiungere la base di adenina alle tre estremità prime, aggiungere 30 microlitri di DNA, due microlitri di acqua, cinque microlitri di 10 volte il tampone Taq, 10 microlitri di un dATP millimolare e tre microlitri di Taq DNA polimerasi a un tubo centrifugo PCR da 0,2 microliti. Mescolarli e reagire in una macchina PCR a 72 gradi Celsius per 10 minuti. Eseguire la legatura del linker mescolando 10 microlitri di DNA, 9,9 microlitri di acqua, 2,5 microlitri di tampone T4 DNA ligasi, 0,1 microlitro di oligo mix adattatore e 2,5 microlitri di T4 DNA ligasi in un tubo centrifugo PCR da 0,2 microlitri.

Incubare il tubo a 16 gradi Celsius per quattro ore. Per amplificare il DNA utilizzando primer PCR, aggiungere 10,5 microlitri di DNA, 12,5 microlitri di mix master due volte ad alta fedeltà. un microlitro di primer PCR PE 1.0 e un microlitro di primer PCR PE 2.0 a un tubo centrifugo PCR da 0,2 microlitter e mescolare bene.

I segnali H3K4me3 dei mutanti di delezione mobre2, mospp1 e moswd2 sono stati significativamente ridotti nelle sue regioni target funzionali. Rispetto al ceppo wild type P131, i segnali delle letture di immunoprecipitazione della cromatina H3K4me3 arricchita nei mutanti di delezione mobre2, mospp1 e moswd2 sono stati in gran parte diminuiti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire chip on chip e chip qPCR.

Sono generalmente utilizzati per esaminare il gene bersaglio a valle di una proteina e studiare le interazioni del DNA proteico in siti di legame del genoma noti.