Utilizzo del colorante fluorescente, Rhodamine B, per studiare la competitività dell'accoppiamento nelle zanzare Aedes aegypti maschili
7 maggio 2021
Qui, presentiamo un protocollo per studiare la competitività dell'accoppiamento di Aedes aegypti maschi usando il colorante fluorescente come marcatore. Le zanzare femmine sono esposte a maschi sia marcati che non contrassegnati per la copulazione. Dopo l'accoppiamento, le loro spermatece vengono esaminate al microscopio a fluorescenza per determinare il loro partner di accoppiamento.
Questo protocollo misura la competitività dell'accoppiamento delle zanzare maschili, che è un prerequisito per i programmi di soppressione della popolazione di zanzare basati sul rilascio maschile. Questo criterio di idoneità viene valutato come parte del controllo di qualità e della valutazione del ceppo. Questo metodo riduce il tempo sperimentale del 90% e consente il confronto diretto della competitività dell'accoppiamento tra due linee sterili o infette da Wolbachia.
A eseguire questa procedura saranno Irene Li e Keng Wai Mak. Per iniziare, sesso le zanzare maschio e femmina nella fase pupale, in base alle loro differenze di dimensioni. Per ogni serie di zanzare, trasferire 100 pupe maschili in una gabbia pre-etichettata per l'alimentazione del saccarosio o l'alimentazione del saccarosio Rhodamine B.
Metti le pupe femminili in piccoli lotti da 40 a 50 per gabbia. All'emergere degli imagos, controllare le gabbie per la presenza di zanzare maschio. Per preparare la soluzione di saccarosio 0,2% Rhodamine B, sciogliere 200 milligrammi di polvere di Rhodamine B per ogni 100 millilitri di soluzione di saccarosio al 10%.
Mescolare bene per assicurarsi che tutta la polvere sia sciolta. Preparare 20 bottiglie di alimentazione dello zucchero con uno stoppino. Aggiungere 10 millilitri di saccarosio al 10% a 10 flaconi di alimentazione e 10 millilitri di soluzione di saccarosio 0,2% di Rodamina B per gli altri 10 flaconi di alimentazione.
Metti cinque bottiglie di alimentazione in ogni gabbia maschile preparata e lascia che le zanzare maschio si nutrano per tre giorni prima dell'esperimento di accoppiamento. Accendere la lampada del bruciatore a mercurio e lo stereomicroscopio. Lasciare stabilizzare la sorgente luminosa della lampada del bruciatore a mercurio per 10 minuti.
Quindi impostare i filtri di fluorescenza per la proteina di fluorescenza rossa uno. Aspirare un piccolo numero di zanzare alla volta nel tubo di vetro dell'aspiratore orale. Attraverso il tubo di vetro, osserva il corpo delle zanzare maschio sotto lo stereomicroscopio fluorescente.
Utilizzare solo zanzare maschio contrassegnate con Rhodamine B per l'esperimento. Set di trasferimento Un maschio di zanzare in 12 bicchieri di carta fissati con rete. Metti 10 zanzare maschie nutrite con saccarosio per tazza in sei tazze e 10 saccarosio rhodamine B alimentate con zanzare maschio per tazza nelle altre sei tazze.
Ripeti questo passaggio per impostare le zanzare maschio B. Impostare 12 gabbie per il test di accoppiamento. In ciascuna delle sei gabbie, includono 10 zanzare maschio A che sono marcate Rodamina B, 10 zanzare maschio B set non contrassegnate e 10 zanzare femmine vergini selvatiche.
Nelle altre sei gabbie, includono 10 zanzare maschio A set non contrassegnate, 10 zanzare maschio set B marcato Rhodamine B e 10 zanzare femmine vergini selvatiche. Etichettare queste gabbie per distinguere chiaramente tra le due combinazioni di accoppiamento. Metti le rispettive tazze di maschi nelle gabbie di accoppiamento secondo le etichette.
Rimuovere la rete e picchiettare delicatamente la tazza per spingere i maschi fuori dalla tazza. Rimuovere con attenzione il bicchiere di carta e la rete dalla gabbia per assicurarsi che nessuna zanzara fuoriesca dalla gabbia. Lascia che le zanzare maschio si acclimatino nella gabbia di accoppiamento per almeno un'ora.
Usando un aspiratore orale, trasferisci le zanzare femmine vergini selvatiche in 12 bicchieri di carta, ogni tazza contenente 10 zanzare. Dopo il periodo di acclimatazione per le zanzare maschio, trasferire una tazza di femmine in ogni gabbia di accoppiamento e rimuovere la rete. Spingere delicatamente la tazza per incoraggiare le zanzare femmine rimanenti fuori dalla tazza, quindi rimuovere con cura il bicchiere di carta e la rete dalla gabbia per assicurarsi che nessuna zanzara fuoriesca dalla gabbia.
Lasciare che l'accoppiamento avvenga per tre ore, quindi terminare l'esperimento di accoppiamento rimuovendo tutte le zanzare da ogni gabbia con un aspiratore meccanico. Anestetizzare a freddo le zanzare sul ghiaccio per almeno cinque minuti. Quando le zanzare sono completamente anestetizzate, raccogliere delicatamente le zanzare femmine e ospitarle in un bicchiere di carta separato fissato con una rete.
Etichettare il bicchiere di carta trasferendo la rispettiva etichetta dalla gabbia di accoppiamento alla tazza. Per segnare le spermatece femmine, anestetizzare a freddo le zanzare femmine sul ghiaccio per almeno cinque minuti prima della dissezione al microscopio stereo. Seziona la zanzara femmina sotto lo stereomicroscopio.
Esaminare le spermatece al microscopio. Se la femmina non viene inseminata, tutte e tre le spermatece sarebbero vuote e, se inseminate, due o tre delle spermatece sarebbero riempite con spermatozoi mobili. Per gli individui inseminati, determinare se le spermatece contengono liquido seminale marcato Rhodamine B esaminandoli sotto lo stereomicroscopio fluorescente dotato di un filtro RFP1.
Se le spermatece sono riempite con liquido seminale che non è contrassegnato con Rodamina B, non si osserva fluorescenza. D'altra parte, se la spermateca contiene Rhodamine B marcato liquido seminale, sarebbe fluoresce arancione. L'obiettivo di questo test di competitività dell'accoppiamento era determinare se ci potesse essere una perdita nella forma fisica dell'accoppiamento maschile dopo diverse generazioni di consanguineità.
Sono stati condotti triplicati sperimentali del test di competitività dell'accoppiamento e i dati di inseminazione sono mostrati qui. Le femmine selvatiche sono state inseminate dai maschi consanguinei o incrociati, con marcatura reciproca. I risultati mostrano che la percentuale di femmine inseminate dai maschi consanguinei o incrociati non è stata influenzata dalla marcatura Rhodamine B.
Una percentuale significativamente più alta di femmine accoppiate con i maschi outcross rispetto ai maschi consanguinei in tutti e tre i replicanti, indicando che la consanguineità potrebbe portare alla perdita di forma fisica dell'accoppiamento. È importante preparare gabbie extra di zanzare femmine. Non utilizzare zanzare femmine da una gabbia che è stata contaminata da zanzare maschio, poiché le femmine pre-inseminate renderebbero tutti i dati non validi.
Oltre al test di competitività dell'accoppiamento basato sul laboratorio, questa procedura può essere utilizzata in esperimenti di rilascio-ricatto di marcature per studiare la biologia dell'accoppiamento degli insetti, la dinamica della popolazione e la sua dispersione.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per valutare la competitività nell'accoppiamento nei maschi di zanzare Aedes aegypti, un aspetto importante nelle strategie di controllo della popolazione di zanzare. Utilizzando la Rodamina B come marcatore fluorescente, i ricercatori possono confrontare direttamente il successo nell'accoppiamento dei maschi marcati rispetto a quelli non marcati dopo l'esposizione alle zanzare femmine.
Componenti principali dello studio
Area di ricerca
- Competività nell'accoppiamento delle zanzare
- Strategie di soppressione della popolazione
- Comportamento e biologia degli insetti
Contesto
- La necessità di un efficace controllo della popolazione di zanzare a causa del loro ruolo nella trasmissione delle malattie.
- L'importanza di valutare l'idoneità all'accoppiamento dei maschi per il controllo qualità nei programmi di tecnica degli insetti sterili.
- L'uso di marcatori fluorescenti per migliorare l'accuratezza e l'efficienza sperimentale.
Metodi utilizzati
- Saggi di accoppiamento controllati utilizzando zanzare maschili marcate e non marcate.
- Aedes aegypti come organismo modello.
- Microscopia a fluorescenza per analizzare gli esiti dell'accoppiamento e la presenza di sperma.
Risultati principali
- L'incrocio consanguineo riduce l'idoneità all'accoppiamento nei maschi, come dimostrato dalle minori percentuali di inseminazione nei maschi consanguinei rispetto ai maschi incrociati.
- La marcatura fluorescente non ha influenzato la proporzione di femmine inseminate.
- Il metodo efficiente consente una rapida valutazione della competitività nell'accoppiamento.
Conclusioni
- Questo studio evidenzia l'impatto dei fattori genetici sul successo nell'accoppiamento in Aedes aegypti.
- I risultati sono rilevanti per future ricerche sul controllo delle zanzare e sulla dinamica delle popolazioni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Assessing male mating competitiveness is critical for evaluating strain fitness in sterile insect technique programs, directly impacting the success of vector control strategies. This fluorescent dye-based method enables rapid, quantitative comparison of mating fitness between strains, reducing experimental time by 90% and supporting data-driven go/no-go decisions in pipeline advancement. By providing a scalable, reproducible assay for target validation in vector-borne disease intervention, it enhances predictive confidence in preclinical strain selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of mating fitness as a phenotypic endpoint for strain fitness evaluation.
- Operational Value: Reduces assay duration from days to hours by eliminating blood-feeding and egg-hatching steps.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying competitive mating success between sterile or Wolbachia-infected lines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts for mating partner identification in spermathecae.
- Operational Value: Uses sucrose feeding for non-invasive male marking, enabling high-throughput preparation of labeled cohorts.
- Reproducibility: Standardized Rhodamine B concentration (0.2% in 10% sucrose) ensures consistent labeling across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges laboratory strain evaluation to field release readiness by assessing a key fitness criterion for population suppression.
- Mechanistic De-risking: Detects fitness costs of inbreeding through reduced insemination rates, informing strain maintenance strategies.
- Disease-Relevant System: Uses Aedes aegypti, a vector for dengue, Zika, and chikungunya, aligning with global health priorities.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting strain selection after genetic modification and before field trial planning, by providing a quantitative mating competitiveness metric.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that genetic background influences mating success through competitive male-female interactions.
- Screening: Produces standardized, fluorescent sperm labeling enabling blind scoring of mating outcomes across experimental groups.
- Analytics: Generates proportional insemination data per male strain, facilitating statistical comparison of mating fitness.
- Translational Research: Connects laboratory competitiveness to field efficacy by validating a prerequisite for sterile male release success.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for comparing any two male strains, applicable across vector control programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mating fitness determinants, reducing ambiguity in strain selection.
- Operational Value: Eliminates dependency on blood feeding and embryology, simplifying workflow and increasing throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying fitness defects early, reducing investment in non-competitive strains.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated mating competitiveness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, sex separation at pupal stage, and fluorescence microscopy.
- Necessitates stereo microscope with RFP1 filter set and mercury burner lamp for standardized fluorescence detection.
- Demands cross-team standardization of male marking protocols and female dissection procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to different mosquito species or strains with varying feeding behaviors.
- Includes practical limitations such as the need to avoid pre-inseminated females and ensure proper cage labeling to prevent cross-contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Preparation of Male and Female Mosquitoes
1:11
Preparation of 0.2% RhB Sucrose Solution and Feeding of Male Mosquitoes
1:52
Checking for RhB Fluorescence in Male Mosquitoes
2:46
Mating Competitiveness Assay
5:36
Results: Assessment of Mating Competitiveness in Male Mosquitoes
6:27
Conclusion
