Name: Sistema di induzione organoide retinica per la derivazione di tessuti retinici 3D da cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per generare tessuti retinici 3D da cellule staminali pluripotenti umane senza acido retinoico. Questo metodo quantifica la dimensione degli EB e la densità di piastratura per migliorare efficienza e riproducibilità.

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Questo studio è stato supportato dal National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), dal Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), dal Science & Technology Project della provincia del Guangdong (2017B020230003), dalla Natural Science Foundation (NSF) della Cina (81570874, 81970842), dal programma Hundred talent della Sun Yat-sen University (PT1001010) e dai Fundamental Research Funds dello State Key Laboratory of Ophthalmology.

1. Cultura ed espansione delle hPSC
<ol><li>Cultura HPSC
	<ol>
<li>Rivestire due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con matrice extracellulare (ECM, matrice qualificata hESC). Preparare 50 mL di una soluzione ECM contenente 8-12 μg/mL di ECM nel Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco. In 49 mL di DMEM, aggiungere 1 mL della soluzione stock ECM scongelata (50x). Aggiungere 1 mL di soluzione ECM a ciascun pozzettino di una piastra a 6 pozzetti. Incubarlo per 1 ora in un incubatore a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Preparare il mezzo di manutenzione hPSC (MM) secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>MM preriscaldo a temperatura ambiente (RT) per 30 min.</li>
		<li>Scongelare una fiala criogenica di hPSC (hiPSC o hESC) (circa 1 x 106) da un serbatoio di azoto liquido mediante incubazione a bagnomaria a 37 °C per 30 s.</li>
		<li>Esponi la fiala e disinfettala con cura usando uno spray alcool disinfettante al 75%. Mettilo in un armadietto di biosicurezza.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare dal flaconcino a un tubo da 15 mL, aggiungere 5 mL di MM preriscaldato goccia a goccia al tubo utilizzando una pipetta da 5 mL. Nel frattempo, agitare delicatamente il tubo per frullare le hPSC .</li>
		<li>Centrifugare il tubo a 170 x g per 5 min. Rimuovere la maggior parte del surnatante usando con cura una pipetta da 1 mL e lasciare circa 50 μL di surnatante per evitare di perdere le cellule.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di MM al tubo e risuscievole il pellet tubando delicatamente su e giù una o due volte con una pipetta da 1 mL. NOTA: La sopravvivenza di singole cellule di hPSC è bassa. Piccoli grumi cellulari con 3-5 cellule sono preferiti per mantenere le hPSC che crescono in colonie.</li>
		<li>Rimuovere l'ECM dai pozzi preverniciati (fase 1.1.1), aggiungere 1,5 ml di MM a ciascun pozzo e quindi distribuire 0,5 ml di sospensione cellulare per pozzo.</li>
		<li>Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le hPSC e mettere la piastra in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO2. Non spostare la piastra per almeno 24 ore per promuovere l'aderenza cellulare.</li>
		<li>Cambia MM a giorni alterni e passa le hPSC quando la confluenza ha raggiunto circa l'80%.</li>
	</ol></li>
	<li>Passaggio di hPSC NOTA: il mantenimento dello stato indifferenziato nelle hPSC è piuttosto critico per ulteriori applicazioni. Nelle condizioni aderenti, le hPSC crescono in colonie con un bordo ben definito. Le cellule dovrebbero essere attraversate quando la confluenza di hPSC raggiunge circa l'80%.<ol>
<li>Osservare le cellule al microscopio. Contrassegnare e rimuovere meccanicamente le cellule differenziate chiaramente visibili (<5%) prima di passare.</li>
		<li>Preparare la piastra rivestita in ECM come descritto al punto 1.1.1.</li>
		<li>MM preriscaldante e 1x tampone fosfato soluzione salina (PBS) senza Ca2+ e Mg2+ a RT.</li>
		<li>Preriscaldere la soluzione di EDTA da 0,5 mM (in 1x PBS) a bagnomaria a 37 °C.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura utilizzando un sistema di aspirazione sottovuoto, aggiungere 1 mL di 1x PBS in ciascun pozzetti per lavare le celle usando una pipetta da 1 mL e ripetere due volte.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di EDTA per pozzetta per dissociare le hPSC in un incubatore di colture cellulari a 37 °C e 5% di CO2 per 5 minuti. Non superare il tempo di incubazione raccomandato per evitare la dissociazione a singole cellule.</li>
		<li>Estrai la piastra e controlla il distacco delle cellule al microscopio. Le hPSC confluenti si allentano e ogni bordo cellulare può essere visto, ma le cellule non possono facilmente staccarsi scuotendo delicatamente la piastra cellulare.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di EDTA con una pipetta da 1 mL e aggiungere 1 mL di MM per arrestare la dissociazione. Pipettare delicatamente le hPSC una o due volte con una pipetta da 1 mL per ricaspendare le cellule. Non c'è bisogno di centrifugare per raccogliere le cellule. NOTA: Se la maggior parte delle cellule si stacca dalla piastra dopo l'incubazione con EDTA, le cellule possono essere raccolte mediante centrifuga.</li>
		<li>Rimuovere l'ECM dai pozzi preverniciati (punto 1.2.2) e aggiungere 1,5 ml di MM per pozzo.</li>
		<li>Trasferire 150-200 μL di grumi cellulari in ciascun pozzerà. Generalmente, le hPSC possono essere passaggio con un rapporto di 1:6. Ad esempio, le cellule di un pozzo di una piastra a 6 pozzetti possono essere distribuite a sei nuovi pozzi.</li>
		<li>Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le hPSC e colturare le hPSC nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 per almeno 24 ore senza toccare la piastra.</li>
		<li>Cambiare MM a giorni alterni come descritto nel passaggio 1.1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Differenziazione retinica dalle hPSC
NOTA: Quando le colonie raggiungono ~80% di confluenza (Figura 1B), possono essere guidate a differenziarsi in organoidi retinici seguendo il protocollo schematizzato in Figura 1A. Per garantire che le hPSC abbiano un'alta qualità e una buona resa, valutare regolarmente la pluripotenza con marcatori molecolari come OCT4 o NANOG utilizzando IFC o QPCR. Le HPSC devono essere scartate se le cellule differenziate rappresentano più del 5% delle cellule totali. Verificare la contaminazione da micoplasma con un kit di rilevamento del micoplasma secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare solo hPSC prive di micoplasma poiché il micoplasma può alterare la capacità di differenziazione delle hPSC.
<ol><li>Preparare mezzi e reagenti
	<ol>
<li>Preparare il mezzo di induzione neurale (NIM) mescolando quanto segue: 500 mL di Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 di Dulbecco (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL di supplemento N2 all'1%, 0,5 mL di eparina allo 0,1% (2 mg/mL in 1x PBS) e 5 mL di aminoacidi non essenziali MEM all'1% (NEAA).</li>
		<li>Preparare il mezzo di differenziazione retinica (RDM) contenente 300 mL di DMEM/F-12, 200 mL di DMEM basic, 10 mL di supplemento B27 al 2%, 5 mL di Antibiotic Antimycotic all'1% e 5 mL di MEM NEAA all'1%. NOTA: sia NIM che RDM non vengono filtrati, ma viene eseguito un test di sterilità. Togliere 1 mL di mezzo e aggiungerlo in un piatto da 35 mm e colturare per 3-7 giorni in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Il supporto può essere conservato a 4 °C e deve essere utilizzato entro 2 settimane per garantire l'attività dei componenti.</li>
		<li>Preparare 10 mM Blebbistatin (1.000x) in DMSO. Aggiungere 1.710 μL di DMSO per sciogliere 5 mg di Blebbistatin per ottenere 10 mM di soluzione madre (1.000x), aliquota a 10 μL/tubo e conservare a -20 °C. NOTA: Tutti i supporti e i reagenti devono essere riscaldati a RT per 30 minuti prima dell'uso, se non diversamente specificato.</li>
	</ol></li>
	<li>Formazione del corpo embrioide (EB)
	<ol>
<li>Il giorno 0 (D0), iniziare la differenziazione. Estrai un pozzetti di hPSC da una piastra a 6 pozzetti, che è cresciuta fino a circa l'80% di confluenza. Raccogliere le cellule con la soluzione di dissociazione EDTA come descritto nei passaggi da 1.2.1 a 1.2.6.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di EDTA, aggiungere 1 mL di MM contenente 10 μM di Blebbistatin per fermare la dissociazione cellulare e raccogliere le cellule con una pipetta da 1 mL. La dimensione dei grumi cellulari è uno dei fattori chiave che influenzano la resa degli EB. Approssimativamente, cinque celle per grumo sono preferite per produrre la giusta dimensione di EB su D5 a D7. NOTA: questo è un passaggio chiave. Non pipettare le cellule troppe volte poiché gli aggregati simili a EB sono difficili da formare da singole celle di hPSC.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare (circa 2 x 106 celle) in una capsula di Petri ad attacco ultra-basso da 100 mm e aggiungere 9 ml di MM contenenti 10 μM di Blebbistatina al piatto.</li>
		<li>Agitare delicatamente il piatto due volte per distribuire uniformemente le cellule e mettere il piatto nell'incubatrice a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Su D1, dopo che le cellule sono state coltivate per almeno 24 ore, esportare fuori il piatto e osservarlo al microscopio. Un gran numero di aggregati di piccole cellule si formerà spontaneamente da questo momento (Figura 1C).</li>
		<li>Preparare 12 mL di miscela con MM e NIM con un rapporto 3:1 (9 mL di MM e 3 mL di NIM) in un tubo da 15 mL.</li>
		<li>Trasferire le colture cellulari in un tubo centrifugo da 15 mL con una pipetta da 10 mL perpendicolarmente e aggiungere 10 mL della miscela preriscaldata al piatto.</li>
		<li>Centrifugare il tubo a 60 x g per 3 minuti per raccogliere gli aggregati, rimuovere il surnatante usando una pipetta da 5 ml e lasciare circa 500 μL per evitare di perdere cellule.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL della miscela al tubo e trasferire la sospensione nello stesso piatto (punto 2.2.7).</li>
		<li>Agitare delicatamente il piatto per distribuire uniformemente gli aggregati cellulari e rimettere il piatto nell'incubatrice.</li>
		<li>Su D2, preparare 12 mL di una nuova miscela con MM e NIM con un rapporto 1:1 (6 mL di MM e 6 mL di NIM) in un tubo da 15 mL. Cambiare il mezzo cellulare con la miscela appena preparata ripetendo i passaggi da 2.2.5 a 2.2.10.</li>
		<li>Su D3, cambiare il mezzo cellulare con 15 ml di NIM come descritto sopra. Coltura le cellule per almeno 5 giorni nelle condizioni di sospensione. NOTA: Durante D1 a D3, il mezzo deve essere cambiato ogni giorno, fornendo un'alimentazione sufficiente. Dal momento che D3, NIM può essere cambiato a giorni alterni. Inoltre, gli EB possono essere suddivisi in diversi piatti per fornire un'abbondante nutrizione.</li>
	</ol></li>
	<li>Semina gli EB NOTA: su D5 a D7, scegliere un punto temporale appropriato per placcare gli EB sulle piastre rivestite in ECM in base alle dimensioni degli EB. Gli EB con un diametro approssimativo di 200 μm sono appropriati per la differenziazione retinica. In generale, un pozzo di hPSC in una piastra a 6 pozzetti può produrre da 300 a 1.000 EB. La variazione della resa EB è variata dalle linee hPSC.<ol>
<li>Su D4, preparare piatti rivestiti in ECM per la cultura aderente agli EB. Aggiungere 5 ml di ECM a ciascun piatto di coltura tissutale da 100 mm (trattato in superficie) e metterli nell'incubatrice durante la notte.</li>
		<li>Su D5, rimuovere eCM dai piatti pre-rivestiti e aggiungere 10 ml di NIM preriscaldato a ciascun piatto.</li>
		<li>Togliere il piatto contenente EB. Controlla la qualità degli EB al microscopio e assicurati che siano abbastanza luminosi e di forma rotonda. La dimensione degli EB è di circa 200 μm di diametro. Raccogli tutti gli EB in un tubo da 15 ml. Trasferire gli EB dalle portate a un tubo da 15 ml con una pipetta da 5 ml. Lasciare che gli EB si depositino per 5 minuti. Rimuovere la maggior parte del surnatante, lasciando circa 2 ml di mezzo.</li>
		<li>Distribuire gli EB nelle stoviglie rivestite contenenti 10 mL di NIM goccia a goccia con una pipetta da 1 mL. Seminare gli EB ad una densità di circa 2-3 EB per cm2. Ad esempio, aggiungere circa 120-180 EB in una parabola da 100 mm. Per giudicare approssimativamente il numero EB, posiziona una goccia di sospensione EB su un coperchio e conta il numero di EB al microscopio. NOTA: La densità di placcatura degli EB è uno dei fattori chiave che influenzano l'efficienza dell'induzione retinica. La densità può anche essere regolata da ogni linea hPSC.</li>
		<li>Agitare delicatamente i piatti per distribuire uniformemente gli EB. Mettili nell'incubatrice a 37 °C e 5% CO2. NOTA: Non spostare i piatti per almeno 24 ore per migliorare l'aderenza degli EB.</li>
	</ol></li>
	<li>Induzione di vescicole ottiche (OV) ed epitelio pigmentato retinico (RPE) in condizioni aderenti NOTA: Dopo che gli EB sono stati seminati sulla superficie rivestita di ECM, le hPSC possono sviluppare strutture simili a OV, che possono essere osservate già a D20 dopo la differenziazione. In questo protocollo, specifici fattori di crescita o molecole di segnalazione non sono necessari per guidare le hPSC nel destino retinico, ad eccezione dell'aggiunta di integratori N2 e B27 nei mezzi.<ol>
<li>Su D8-D9, rimuovere le stoviglie e osservare gli EB al microscopio. Tutti gli EB saranno attaccati e sparsi sui piatti (Figura 1D). Aggiungere 10 mL di NIM fresco a ogni piatto da 100 mm contenente 10 mL di vecchio mezzo. Rimetterli nell'incubatrice. NOTA: non rimuovere il vecchio supporto.</li>
		<li>Su D12, cambiare metà del mezzo con NIM usando una pipetta da 10 ml. Mantieni la cultura nell'incubatore.</li>
		<li>Su D16, rimuovere tutti i NIM dalle stoviglie utilizzando un sistema di aspirazione sottovuoto. Aggiungere 20 ml di RDM a ogni piatto. Continua a coltivare in RDM e cambia metà del mezzo a giorni alterni.</li>
		<li>Durante D10-D30, osservare i cambiamenti morfologici delle cellule due volte alla settimana al microscopio e valutare l'efficienza della differenziazione retinica. NOTA: a partire da D10, i domini del campo oculare (EF) sono auto-organizzati nelle zone periferiche degli EB aderenti. Le strutture simili a OV appaiono tra D20 e D25, sporgono gradualmente dal piatto e auto-formano una tazza ottica, che è circondata dall'RPE pigmentato (Figura 1E). Gli AV possono essere facilmente riconosciuti con l'anello NR luminoso, rifrattivo e spesso.</li>
	</ol></li>
	<li>Staccare e colturare OV e RPE in sospensione per ottenere organoidi retinici (RO)
	<ol>
<li>Su D28-D35, la maggior parte degli UV appare nei piatti. Utilizzare un ago di tungsteno o un ago con una siringa da 1 mL per staccare meccanicamente gli AV morfologicamente identificabili insieme all'RPE adiacente. Coltivateli in sospensione. NOTA: l'aspetto e la resa di OV e RPE variano ampiamente nelle diverse linee hPSC. Pertanto, il punto temporale di distacco di OV e RPE è flessibile. Gli OT ovvi con l'RPE adiacente possono essere staccati e quindi spostati in una parabola di coltura a basso attacco contenente RDM. Continua a coltivare il resto delle celle fino a quando tutti gli AV e gli RPE non vengono sollevati.</li>
		<li>Inserire 50-60 OV in ogni piatto di coltura a attacco basso da 100 mm contenente 15 ml di RDM per la formazione di OR (Figura 1F).</li>
		<li>Cambia RDM ogni 2-3 giorni fino a D42, quando i RO sono ben rotondi.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sviluppo e maturazione della retina
NOTA: In questo protocollo, il siero è necessario per mantenere i RO crescere e maturare per la coltura a lungo termine.
<ol><li>
Laminazione retinica e specificazione nelle RO
	<ol>
<li>Preparare 10 mL di taurina da 100 mM (1.000x) in 1x PBS. Pesare 125 mg di taurina e sciogliere in 10 ml di 1x PBS. Filtrare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 μm. Aliquota a 500 μL/tubo e conservare a -20 °C.</li>
		<li>Preparare il terreno di coltura retinica 1 (RC1). Mescolare i seguenti componenti: 250 mL di DMEM/F-12, 175 mL di DMEM basic, 50 mL di siero bovino fetale, 10 mL di supplemento B27 al 2%, 5 mL di Antibiotic Antimycotic all'1%, 5 mL di MEM NEAA all'1%, 0,5 mL di taurina 100 μM e 5 mL di L-alanil-L-glutammina.</li>
		<li>Preparare il terreno di coltura retinico 2 (RC2) contenente 450 mL di DMEM/F-12, 50 mL di siero bovino fetale, 5 mL di supplemento N2 all'1%, 5 mL di Antibiotic Antimycotic all'1%, 0,5 mL di taurina 100 μM, 5 mL di 1% MEM NEAA e 5 mL di L-alnil-L-glutammina. NOTA: RC1 e RC2 non vengono filtrati, ma sottoposti a un test di sterilità. Togliere 1 mL di terreno, aggiungerlo a un piatto da 35 mm e colturare per 3-7 giorni nell'incubatrice a 37 °C e 5% CO2, per garantire la sterilità prima dell'uso. Il supporto può essere conservato a 4 °C e deve essere utilizzato entro 2 settimane per garantire l'attività dei componenti. Tutti i supporti e i reagenti devono essere preriscaldati a RT per 30 minuti prima dell'uso.</li>
		<li>Su D42, passare il terreno di coltura da RDM a RC1.</li>
		<li>Inclinare i piatti a circa 30° e lasciare che i RO si depositino per 30 s. Rimuovere il vecchio RDM con una pipetta da 10 mL lasciando circa 1 mL di mezzo per evitare di perdere RO. Aggiungere 15 ml di RC1 fresco a ciascun piatto.</li>
		<li>Agitare delicatamente i piatti per distribuire uniformemente i RO. Rimettete i piatti nell'incubatrice. Cambia l'intero mezzo due volte a settimana in seguito.</li>
		<li>Durante D50-D90, selezionare l'alta qualità dei RO per la cultura a lungo termine, che sono di forma rotonda con un NR spesso e luminoso. Posizionare 30-40 RO in una parabola di attacco bassa da 100 mm con 20 ml di RC1 e cambiare l'intero mezzo due volte a settimana.</li>
		<li>Per la cultura della sospensione a lungo termine degli RO, pipettare i RO per evitare il riattacco RO-RO utilizzando una pipetta. Trasferisci i RO in nuovi piatti di cultura una volta al mese per evitare che i RO si attacchino alla superficie dei piatti. NOTA: nelle condizioni di coltura della sospensione, gli RO sono di forma rotonda, con un anello NR luminoso e spesso attaccato con più o meno RPE su un lato. La retina neurale laminata si sviluppa e i sottotipi di cellule retiniche appaiono sequenzialmente con le cellule gangliari retiniche generate per la prima volta, seguite da cellule fotorecettrici, cellule amacrine e cellule bipolari.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maturazione dei fotorecettori umani con arricchimento dei coni nelle RO
	<ol>
<li>Dopo D90, passare il mezzo da RC1 a RC2, che è adatto per la maturazione dei fotorecettori.</li>
		<li>Modificare il supporto come descritto nei passaggi 3.1.7-3.1.8. NOTA: in questa condizione di coltura, le RO possono crescere a lungo termine (Figura 1G), fino a D300 testate. Le cellule retiniche nei RO diventano mature e vengono acquisiti anche tutti i sottotipi cellulari della retina neurale, comprese le cellule gliali muller, i bastoncelli e i coni. Senza alcuna aggiunta di RA, i fotorecettori a cono sono anche ricchi di RO.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286(2015).</li>
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<li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483(2015).</li>
<li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li>
<li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li>
<li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development%2C+survival%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li>
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<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li>
<li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li>
<li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li>
</ol>

Xiufeng Zhong è l'inventore del brevetto relativo alla generazione di cellule retiniche da cellule staminali pluripotenti umane.

In questo protocollo di induzione retinica in più fasi, le hPSC sono state guidate passo dopo passo per ottenere il destino retinico e auto-organizzate in organoidi retinici contenenti NR e RPE laminati. Durante la differenziazione, le hPSC hanno ricapitolato tutte le principali fasi dello sviluppo della retina umana in vivo,da EF, OV e RPE, alla laminazione retinica, generando tutti i sottotipi di cellule retiniche, comprese le cellule gangliari retiniche, le cellule amacrine, le cellule bipolari, i fotorecetto...

Le malattie degenerative della retina (NDI), come la degenerazione maculare legata all'età (AMD) e la retinite pigmentosa (RP), sono caratterizzate dalla disfunzione e dalla morte delle cellule fotorecettrici e in genere portano a una perdita irreversibile della vista senza modi efficaci per curare1. Il meccanismo alla base di queste malattie è in gran parte sconosciuto in parte a causa della mancanza di modelli di malattie umane2. Negli ultimi decenni, sono stati compiuti progressi significativi nella medicina rigenerativa attraverso la tecnologia delle cellule staminali. Molti ricercatori, noi compresi, hanno dimostrato che le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), comprese le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), possono differenziarsi in tutti i tipi di cellule retiniche, anche mini-tessuti retinici attraverso vari approcci di differenziazione3,4,5,6,7,8,9,10, 11, fornendo un enorme potenziale nella modellazione delle malattie e nella terapia cellulare12,13,14.
Tuttavia, il processo di induzione dalle hPSC alle cellule retiniche è altamente complicato e richiede tempo con bassa ripetibilità, che richiede ricercatori con una ricca esperienza e competenze elevate. Durante il complesso e dinamico processo di induzione, una serie di fattori influenzerà la resa dei tessuti retinici15,16,17. Inoltre, diversi metodi di induzione spesso variano considerevolmente nei tempi e nell'espressione robusta dei marcatori retinici, il che potrebbe confondere la raccolta del campione e l'interpretazione dei dati3. Pertanto, sarebbe richiesto un protocollo semplice di differenziazione retinica dalle hPSC con una guida passo-passo.
Qui, sulla base dei nostri studi pubblicati18,19,20,21,viene descritto un protocollo di induzione retinica ottimizzato per generare organoidi retinici (RO) con ricchi fotorecettori a cono da hPSC, che non richiede l'integrazione di acido retinoico (RA). Questo protocollo si concentra sulla descrizione del metodo multi-step per generare retina neurale e RPE. La formazione di EB è la parte essenziale della fase iniziale di induzione. Sia le dimensioni che la densità di placcatura degli EB sono ottimizzate quantitativamente, il che migliora scientificamente la resa dei tessuti retinici e promuove la ripetibilità. Nella seconda parte dell'induzione, le vescicole ottiche (OV) si auto-organizzano nella cultura dell'aderenza e le RO si formano nella cultura della sospensione; i corsi di tempo e le efficienze di questa parte variano considerevolmente nelle diverse linee hPSC. La maturazione e la specificazione delle cellule retiniche nei RIO si verificano principalmente nella fase intermedia e tardiva dell'induzione. Senza l'aggiunta di RA, è possibile produrre fotorecettori maturi con coni e aste ricchi.
Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere quantitativamente e dettagliare ogni passaggio per i ricercatori inesperti da ripetere. Varie linee hPSC sono state indotte con successo in RO da questo protocollo con una robusta resa di tessuti retinici ricchi di coni e un'elevata ripetibilità. Le RO derivate da HPSC con questo protocollo possono ricapitolare le fasi principali dello sviluppo retinico in vivoe sopravvivere a lungo termine, il che facilita le applicazioni a valle, come la modellazione delle malattie, lo screening farmacologico e la terapia cellulare.

<table><tbody><tr><td>(&meno;)-Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>B0560-5mg</td><td>ROCK-inhibitor</td></tr><tr><td>1 ml punte</td><td>Kirgen</td><td>KG1313</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>10 ml pipetta</td><td>Sorfa</td><td>3141001</td><td>Pipetta</td></tr><tr><td>100 mm Coltura tissutale</td><td>BIOFIL</td><td>TCD000100</td><td>100 mm Piastra di Petri</td></tr><tr><td>100 mm Falcon</td><td></td><td>353003</td><td>100 mm Piastra di Petri 15</td></tr><tr><td>ml Provette da centrifuga</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td>Provette da centrifuga</td></tr><tr><td>35 mm Piastre per coltura tissutale</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Piastra Petri da 35 mm</td></tr><tr><td>Pipetta da 5 ml</td><td>Sorfa</td><td>313000</td><td>Pipetta</td></tr><tr><td>da 50 ml Provette da centrifuga</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td>Provette da centrifuga</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Piastre per coltura</td></tr><tr><td>Anti-AP2&alpha; Anticorpo</td><td>DSHB</td><td>3b5</td><td>primario&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>ANTIBIOTICO ANTIMICOTICO 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Antibiotico-Antimicotico</td></tr><tr><td>Anti-ISL1 Anticorpo</td><td>Boster</td><td>BM4446</td><td>Primario&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Primario&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-L/M opsina Anticorpo</td><td>regalo dal Dr. jeremy</td><td>/</td><td>Primary&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-PAX6 Anticorpo</td><td>DSHB</td><td>pax6</td><td>Primario&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-coniglio 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td>Asino anti-coniglio IgG (H+L) Anticorpo secondario, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-recoverina</td><td>Millipore</td><td>ab5585</td><td>Primario&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-Rodopsina Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab5417</td><td>Primario&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-pecora 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21436</td><td>Asino anti-pecora IgG (H+L) Anticorpo secondario, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-SOX9</td><td>Clonale</td><td>A19710</td><td>Primario&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-VSX2 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>ab9016</td><td>Primario&nbsp; integratore di anticorpi</td></tr><tr><td>B-27 W/O VIT A (50X)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>Integratore</td></tr><tr><td>Cryotube fiala</td><td>Thermo scientific-NUNC</td><td>375418</td><td>1,8 ml</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>DOJINDO</td><td>D532</td><td>4',6-Diamidino-2-fenilindo dicloridrato; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO) Hybri-max</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td>Fornitori multipli</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Medium</td></tr><tr><td>DMEM /F12</td><td>Gibco</td><td>C11330500BT</td><td></td></tr><tr><td>Medium EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>0.5 M PH 8.0</td></tr><tr><td>FBS</td><td>NATOCOR</td><td>SFBE</td><td>Filtro</td></tr><tr><td></td><td>Siero Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22&mu; m, filtro sterile</td></tr><tr><td>Millex GlutaMax, 100X</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-alanil-L-glutammina</td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>2 mg/ml in PBS per utilizzare</td></tr><tr><td>Matrigel, 100x</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrice extracellulare (ECM)</td></tr><tr><td>Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM NEAA</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEM CELL</td><td>85850</td><td>Integratore di hPSCs Mezzo di mantenimento (MM)</td></tr><tr><td>N2</td><td>Integratore Gibco</td><td>17502048</td><td>Tampone</td></tr><tr><td>salino tamponato con fosfato (PBS)</td><td>GNM</td><td>GNM10010</td><td>Senza Ca+,Mg+,PH7.2&plusmn; Supplemento 0.1 0.1M</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura con attacco ultra-basso Piastra di Petri da 100 mm,</td><td>piastra di Petri</td> <td>Corning</td><td>CLS3262-20EA</td> a basso attacco</tr></tbody></table>

sistema di induzione organoide retinica per la derivazione di tessuti retinici 3d da cellule staminali pluripotenti umane

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Le malattie degenerative della retina sono le principali cause di cecità irreversibile senza un trattamento efficace. Le cellule staminali pluripotenti che hanno il potenziale per differenziarsi in tutti i tipi di cellule retiniche, anche nei tessuti mini-retinici, hanno enormi promesse per i pazienti con queste malattie e molte opportunità nella modellazione delle malattie e nello screening farmacologico. Tuttavia, il processo di induzione dalle hPSC alle cellule retiniche è complicato e richiede molto tempo. Qui, descriviamo un protocollo di induzione retinica ottimizzato per generare tessuti retinici ad alta riproducibilità ed efficienza, adatti a varie cellule staminali pluripotenti umane. Questo protocollo viene eseguito senza l'aggiunta di acido retinoico, che avvantaggia l'arricchimento dei fotorecettori del cono. Il vantaggio di questo protocollo è la quantificazione della dimensione EB e della densità di placcatura per migliorare significativamente l'efficienza e la ripetibilità dell'induzione retinica. Con questo metodo, tutte le principali cellule retiniche appaiono sequenzialmente e ricapitolano le fasi principali dello sviluppo retinico. Faciliterà le applicazioni a valle, come la modellazione delle malattie e la terapia cellulare.

Il processo di induzione retinica in questo protocollo imita lo sviluppo della retina fetale umana. Per avviare la differenziazione retinica, le hPSC sono state dissociate in piccoli grumi e coltivate in sospensione per indurre la formazione di EB. Su D1, si sono formati aggregati di celle uniformate o EB (Figura 1C). Il mezzo di coltura è stato gradualmente trasferito in NIM. Su D5, gli EB sono stati placcati sui piatti di coltura rivestiti in ECM. Le celle migrarono gradualmente fuori dagl...

Qui descriviamo un sistema di induzione organoide retinica ottimizzato, adatto a varie linee di cellule staminali pluripotenti umane per generare tessuti retinici con elevata riproducibilità ed efficienza.

Sistema di induzione organoide retinica per la derivazione di tessuti retinici 3D da cellule staminali pluripotenti umane

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Il processo di induzione dalle hPSC alle cellule retiniche è complicato e richiede molto tempo. Questo protocollo ottimizzato può generare tessuti retinici con elevata riproducibilità e nessun costo. Il vantaggio di questo protocollo è la quantificazione della dimensione EB e della densità di placcatura per migliorare significativamente l'efficienza e la ripetibilità dell'induzione retinica da hPSC.Con questo metodo, tutte le principali cellule retiniche appaiono sequenzialmente e ricapitolano le fasi principali dello sviluppo retinico. Faciliterà la modellazione delle malattie e la terapia cellulare per le malattie degenerative della retina. Dimostrando la procedura, siamo con Yuanyuan Guan, uno studente di dottorato, e Bingbing Xie, un tecnico del laboratorio.Iniziare preparando 50 mL di soluzione ECM aggiungendo 1 mL della terza soluzione stock 50 volte a 50 mL di DMEM. Quindi, aggiungere 1 mL di questa soluzione ECM preparata a ciascun pozzetti di una piastra a sei pozzetti e incubarla per un'ora a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Preparare il mezzo di manutenzione hPSC secondo le istruzioni del produttore e preriscaldarlo a temperatura ambiente per 30 minuti.Versare una fiala criogenica di hPSC da un serbatoio di azoto liquido incubandola a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 30 secondi. Disinfettarlo con cura con uno spray alcolico al 75% e metterlo in un armadietto di bio-sicurezza. Trasferire la sospensione cellulare dal flaconcino a un tubo da 15 millimetri.Quindi, aggiungere 5 mL di mezzo di manutenzione preriscaldato goccia a goccia al tubo usando una pipetta da 5 ml, scuotendo delicatamente il tubo per miscelare gli IPPC. Centrifugare il tubo a 170 volte G per cinque minuti. Rimuovere con attenzione la maggior parte del surnatante utilizzando una pipetta da 1 mL, lasciando circa 50 microlitri di surnatante per evitare di perdere le cellule.Sospendere di ricaspendere il pellet con 1 mL di mezzo di manutenzione mediante pipettaggio su e giù. Rimuovere l'ECM dai pozzi preverniciati e aggiungere 1,5 millilitri di terreno di manutenzione a ciascun pozzo. Quindi distribuire 0,5 millilitri di sospensione cellulare in ciascun pozzo.Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le hPSC. Metti la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per almeno 24 ore per promuovere l'aderenza cellulare. Cambia mezzo ogni giorno e passa hPSC all'80% di confluenza.Il giorno-0, iniziare la differenziazione rimuovendo le cellule di confluenza dell'80% da un pozzo della piastra a sei pozzi. Raccogliere le cellule con la soluzione di dissociazione EDTA come descritto nel manoscritto di testo. Rimuovere la soluzione di EDTA e aggiungere 1 mL di mezzo di mantenimento contenente 10 fluvastatina micromolare per arrestare la dissociazione cellulare.Raccogliere le celle con una pipetta da 1 mL. Trasferire la sospensione cellulare in una capsula di Petri da 100 millimetri ultra-bassa e aggiungere 9 ml di mezzo di manutenzione contenente 10 fluvastatina micromolare alla piastra. Agitare delicatamente il piatto due volte per distribuire uniformemente le cellule.Quindi, mettilo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo che le cellule sono state coltivate per almeno 24 ore, osservarle al microscopio. Aggiungere 9 mL di mezzo di manutenzione e 3 mL di NIM a un tubo da 15 mL.Trasferire le colture cellulari in un tubo di centrifuga da 15 mL e aggiungere 10 mL della miscela NIM preriscaldata al piatto. Centrifugare il tubo a 60 volte G per 3 minuti per raccogliere gli aggregati. Quindi rimuovere il surnatante usando una pipetta da 5 ml, lasciando circa 500 microlitri per evitare di perdere le cellule.Aggiungere 2 ml di miscela al tubo e trasferire nuovamente la sospensione nella stessa capsula di Petri. Agitare delicatamente il piatto per distribuire uniformemente gli aggregati cellulari. Quindi, rimettete il piatto nell'incubatrice.Il giorno 5, rimuovere l'ECM dai piatti pre-rivestiti e aggiungere 10 ml di NIM preriscaldato a ciascun piatto. Eserite il piatto contenente Ebs e controllate la qualità degli EB al microscopio, assicurandovi che siano luminosi e rotondi. Raccogliere tutti gli EB in un tubo da 15 ml e lasciarli depositare per 5 minuti.Quindi, rimuovere la maggior parte del surnatante, lasciando circa 2 ml di mezzo. Dopo aver contato gli EB, seminarli goccia a goccia ad una densità di circa 2-3 EB per centimetro quadrato in piatti rivestiti contenenti 10 ml di NIM. Agitare delicatamente i piatti per distribuire uniformemente gli EB e metterli nell'incubatrice per almeno 24 ore.Utilizzare un ago di tungsteno o un ago con una siringa da 1 mL per staccare meccanicamente le vescicole ottiche morfologicamente identificabili, insieme all'epitelio pigmentato retinico adiacente nei giorni da 28 a 35. Coltivateli in sospensione. Mettere 50-60 vescicole ottiche in ogni piatto di coltura ad attacco basso 100 millimetri, contenente 15 ml di RDM per la formazione di organoidi retinici.Cambia il mezzo ogni 2 o 3 giorni fino al giorno-42. Per avviare la differenziazione retinica, le hPSC sono state dissociate in piccoli grumi e coltivate in sospensione, che hanno formato EB dal Giorno-1. Il giorno 5 gli EB sono stati placcati sui piatti di coltura rivestiti di ECM e le cellule sono gradualmente migrate fuori dagli EB.Il giorno 16, il mezzo di induzione è stato sostituito da RDM, causando la formazione dei domini della retina neurale e gradualmente sporgenti dal piatto, così come la formazione di strutture vescicolari ottiche circondate da cellule RPE. Durante i giorni da 28 a 35, organoidi retinici costituiti dalla retina neurale, attaccati a una sfera RPE. Da un lato, si sono formate le cellule.Con il progredire della differenziazione e della specificazione retinica, le hPSC producevano sottotipi di retina neurale che gradualmente si allineavano in strati, imitando le caratteristiche architettoniche di una retina umana nativa. Le cellule gangliari retiniche sono state inizialmente generate da progenitori retinici e accumulate nel lato basale della neuro retina. Con questo protocollo, gli organoidi retinici si sono sviluppati in fotorecettori altamente maturi con entrambi, bastoncelli ricchi e coni.Le cellule fotorecettrici si trovavano nel lato apicale, mentre le cellule amacrine, le cellule orizzontali, le cellule bipolari e le cellule gliali muller erano tutte situate nello strato intermedio della retina neurale. I punti chiave di questo protocollo sono la creazione di Ebs di alta qualità e la loro semina alla giusta densità.

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