Analisi quantitativa basata su microscopia a scansione laser confocale della distribuzione di conidi di Aspergillus fumigatus nel polmone di topo a montaggio intero otticamente cancellato

Il nostro approccio ci consente di eseguire l'analisi quantitativa di una distribuzione di Aspergillus fumigatus Conidia in polmone di topo a montaggio intero otticamente cancellato. Aspergillus fumigatus Conidia può penetrare nel tratto respiratorio e causare malattie potenzialmente letali nei pazienti immunocompromessi. Il tratto respiratorio dei mammiferi è un sistema di vie aeree di diverse generazioni.

Ogni generazione è caratterizzata dalle diverse strutture delle pareti delle vie aeree e dalle popolazioni di cellule immunitarie. Nei rami bronchiali, l'aspergillus fumigatus Conidia deve essere eliminato dalla clearance mucociliare. Tuttavia, nello spazio disponibile, la clearance mucociliare non funziona e i Conidi devono essere eliminati dalle cellule immunitarie, come i macrofagi alveolari e i neutrofili.

Così come gli aspetti temporali spaziali della distribuzione di Conidia nelle vie aeree sono importanti. Tuttavia, non adeguatamente studiato domanda nella comprensione dei meccanismi della malattia. Qui presentiamo un setup sperimentale per l'analisi quantitativa della distribuzione di Aspergillus fumigatus Conidia nelle vie aeree di topi infetti.

Applico 50 microlitri di Aspergillus fumigatus Conidia etichettato al topo. Sei ore dopo, raccogli il polmone. Fissare durante la notte in 2% formaldeide e macchiare con streptavicina coniugato etichettato.

Quindi sottoporre il campione alla compensazione ottica. Posizionare il campione nella bottiglia di vetro riempita con una soluzione acquosa al 50% di metanolo e posizionarlo sul miscelatore del campione a temperatura ambiente per un'ora. Sostituire il 50% di metanolo con il 100% di metanolo e metterlo sotto il mixer del campione per due ore.

Preparare una miscela composta da una parte di alcool benzilico e due parti di benzil-benzoato. Trasferire il campione su una piastra a 24 pozzi e coprirlo con la miscela benzil-benzoato per almeno 30 minuti. Il campione è pronto per l'imaging.

Posare il campione sul portase campioni. E posiziona il supporto nel microscopio. Dopo aver acceso il sistema del microscopio e aperto il software, accendere la luce di trasmissione e selezionare un obiettivo X.

Individuare visivamente il campione nella luce di trasmissione e procedere alla scheda di acquisizione. Selezionare la modalità Lambda della microscopia laser confocale. Accendere i laser appropriati.

Impostare la gamma spettrale del rivelatore e selezionare lo specchio dicroico. Regolare il guadagno del rilevatore e restringere il foro stenopeico a un'unità di area. Imposta la risoluzione dei pixel su 512 per 512.

Attiva la modalità zed-stack e avvia l'imaging dal vivo. Trova il piano focale in cui sono visibili entrambi i dadi. Espandete il pannello zed-stack.

Utilizzando la rotellina di messa a fuoco, individuare e selezionare i piani più basso e più alto del campione. Posizionare il piano focale accanto alla parte inferiore del campione. Disattivare la modalità zed-stack e attivare la modalità di scansione composta.

Se necessario, regolare la posizione X, Y e il numero di tessere. Attivare le modalità zed-stack e dial scan. Impostare il passo di sezionamento zed su cinque micron.

Impostare la velocità di scansione. Avviare l'esperimento. L'imaging richiede in genere diverse ore a seconda delle dimensioni del terreno e della velocità di scansione.

L'immagine ottenuta viene quindi spettralmente non mixata. Per l'unmixing spettrale, utilizzare l'opzione di unmixing lineare. Selezionare le regioni corrispondenti alle aree terrestri etichettate con streptavitina e Conidia.

Inizia a unmixing. Dopo aver annullato la moxing salvare il file non mixato. Per stich i riquadri dall'immagine ottenuta, apri l'immagine.

Seleziona metodi, cuciture geometriche. Selezionare l'immagine nella finestra di input. Nelle opzioni di cucitura, selezionare l'opzione Nuova uscita e Fusibile le tessere.

Utilizzare la modalità di riferimento con il canale selezionato corrispondente alla fluorescenza delle vie aeree. Aprite l'immagine in una vista 3D in eccesso. Se necessario, modificare i colori utilizzati per la presentazione.

Qui mostriamo il canale delle vie aeree in tonalità grigie e il canale Conidia in viola. Per creare una maschera per le vie aeree, utilizzare lo strumento Aggiungi nuova superficie. Selezionare il canale delle vie aeree e scegliere il parametro di levigatura di 10 micron.

Vari filtri possono essere utilizzati per escludere il segnale delle vie aeree. Innanzitutto, ispeziona visivamente la superficie e imposta la soglia di intensità. Filtri aggiuntivi, come la superficie, possono anche essere applicati esclusivamente per selezionare le vie aeree, ma non la pleura o i vasi sanguigni.

Quindi, eliminare manualmente il frammento di superficie selezionato che non appartiene alle vie aeree. Ora potete osservare la superficie creata ed esaminare le parti mancanti per correggerle in un secondo momento. Create una maschera per la superficie delle vie aeree utilizzando le opzioni modifica e maschera tutto.

Selezionate il canale delle vie aeree e impostate le celle di lavoro all'esterno della superficie su 0,001. Qui abbiamo mostrato la maschera risultante in arancione. Salva il canale Conidia e la maschera delle vie aeree in due cartelle separate, come serie T di F.

Aprire il file con l'immagine della maschera delle vie aeree. Rendi l'immagine binaria. Segui il processo binario, rendi binario.

Per assomigliare allo spessore della maschera, applicare diverse funzioni 3D dilate. Segui i plugin, elabora, dilate 3D. A tale scopo, è inoltre possibile utilizzare la funzionalità delle macro.

Dopo diversi cicli di processo di dilata, utilizzare la funzione di riempimento dei fori. Segui il processo, binario, riempi i buchi. Per riempire manualmente i fori residui nella maschera, aprire il gestore della regione di interesse.

segui analisi, strumenti, ROI manager. Utilizzando lo strumento di selezione poligonale, selezionate un'area da riempire in una particolare proiezione. Esegui questa lattina più volte per poche proiezioni in zed-stack in modo da poter interpolare le forme delle regioni di interesse.

Per interpolare le forme selezionate, selezionarle tutte e premere altro, interpolare i ROI. Quindi riempi tutti i ROI con il bianco. Utilizzare ancora una volta la procedura dei fori di riempimento.

Per riassemblare lo spessore della maschera dopo aver riempito i fori, applicare la funzione erode 3D. Segui i plugin, elabora, erodi il 3D. Puoi anche usare micros per questo.

Il numero di iterazioni in erode 3D e LA 3D dovrebbe essere uguale. Avviare l'applicazione Conidia count. Premere il pulsante Aggiungi file e selezionare le cartelle con i file DIFF con la maschera delle vie aeree preparata e le immagini di fluorescenza Conidia.

Impostare una soglia personalizzata tra zero e uno. Premere OK e vedere i risultati. Utilizzando questo approccio, eseguiamo l'analisi quantitativa dei Conidi all'interno e all'esterno dell'albero bronchiale dei topi sei ore dopo l'applicazione di Conidia.

I dati suggeriscono che sulla nostra applicazione originale, la maggior parte dei Conidi penetra nello spazio alveolare e lo assegna all'inizio della risposta immunitaria infiammatoria. L'imaging tridimensionale dei polmoni del topo con microscopia a scansione laser confocale consente l'identificazione di Aspergillus fumigatus Conidia nelle vie aeree. L'elaborazione di immagini tridimensionali utilizzando questo protocollo consente di eseguire analisi quantitative della distribuzione di Conidi all'interno e all'esterno dei rami bronchiali.

Il nostro approccio può anche essere utilizzato per stimare la cinetica dell'eliminazione di Conidia dalle dita dei topi e per confrontare la distribuzione anatomica dei Conidi nei topi immunocompetenti e immunocompromessi. Inoltre, utilizzando questo approccio, si può analizzare la distribuzione delle microparticelle o nano particelle agglomerati nelle vie aeree.