Istituzione e manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini
12 febbraio 2022
Un sistema di coltura organoide 3D ex vitro a lungo termine è stato stabilito da epatociti di topo. Questi organoidi possono essere passati e manipolati geneticamente dall'infezione da lentivirus di costruzione shRNA/ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.
Il fegato è l'organo più grande nei mammiferi. Svolge un ruolo molto importante nel metabolismo e nella disintossicazione. Sebbene il fegato abbia una notevole capacità di rigenerazione in vitro, è ancora una grande sfida a lungo termine coltivare epatociti in vitro.
Qui, stabiliamo gli organoidi degli epatociti dagli epatociti maturi. Mantiene le caratteristiche principali degli epatociti nella morfologia e nella funzione. In questo video, introdurremo come coltivare e passare questi organoidi e come eseguire la modificazione genetica di questi organoidi in dettaglio.
In primo luogo, perfusione epatica e digestione. Preparare tutte le regioni e gli strumenti e renderli sterili. Lavare il mouse e aprire l'epidermico e la pelle, quindi cercare di trovare il forno a sacchetto del fegato.
Inietta gli aghi in esso, quindi cattura questo. Fai la perfusione alla velocità di cinque millilitri al minuto, fino a quando il fegato diventa pallido. Cambiali nel tampone di perfusione, posizionali con attenzione, osserva il fegato, fino a quando non diventa morbido.
Di solito ci vogliono dai tre ai cinque minuti, poi tagliare il fegato e metterli nei piatti, e tagliarli a pezzetti con le forbici. Pep su e giù frequentemente. Di solito, ci vogliono dai 10 ai 15 minuti per trasformarli nella singola cellula.
E poi pep su e giù con 10 a 15 minuti e dar loro da mangiare attraverso l'installatore. Trasformali nelle singole celle. Raccogliere tutte le celle nel tubo da 50 millilitri e centrifugarle, con la velocità e quindi raccogliere tutte le piastre per.
Cerca di tenerli sempre nel ghiaccio freddo. Crea le sospensioni a cella singola e contale con il contatore di celle. Di solito gli epatociti se felici, ha la vivace fluorescenza.
La seconda parte, cerchiamo di far sedere le cellule e fare la coltura organoide. Raccogliamo tutte le sospensioni cellulari, e contiamo le cellule con una certa concentro-fusione E poi mescoliamo le. Metrogels. e il supporto del codice.
Di solito prendiamo, con il mezzo e i metrogel, al rapporto di 1 a 2 o 1 a 3. Dopo averli accuratamente miscelati, li sediamo sulle piastre sfumate. Di solito aggiungiamo 100 microlitri al pozzo a 24 piastre.
Mettili nell'incubatrice alla temperatura di 37 gradi. Dopo 20 minuti, li mettiamo in avanti con il fondo in basso e poi al mezzo. Con due o tre giorni di contrasto, di solito vediamo uscire gli organoidi.
Questa è l'immagine tipica dei nostri organoidi. Di solito abbiamo bisogno di singole cellule da organoidi se vogliamo fare il passaggio o fare qualche metodo di modificazione genetica Raccogliamo tutti gli organoidi dalle piastre di contrasto con il tampone di lavaggio del cappotto. Lasciamo cadere il surnatante, quindi al tampone di lavaggio del cappotto nel piatto, mescoliamo, quindi pep su e giù.
E poi di solito pre-laviamo tutte le punte con il tampone dei nastri di lavaggio. Per evitare che tutti gli organoidi si rovescino sulle punte. E poi con il, un nuovo lotto su ghiaccio o senza di esso, raccogliamo tutti gli organoidi per centro-fusione.
Li trattiamo, c'è un conning radients per rimuovere tutti i metrogel. Dopo 20-30 minuti di incubazione su ghiaccio tutti i metrogel vengono rimossi. Raccogliamo tutti gli organoidi puliti e aggiungiamo la tripsina per trasformarli in singole cellule.
Dopo l'aggiunta della tripsina, trattiamo gli organoidi nell'incubatrice. Ci vogliono dai 5 ai 10 minuti perché gli organoidi epatici diventino singole cellule. Aggiungiamo più tamponi di lavaggio per fermare la triplatina.
E poi spingilo su e giù verso di loro. Per il processo di opzione, è possibile lavarli ancora una volta per rimuovere tutta la tripsina. Dopo il lavaggio per centrofusione, possiamo contarli sotto il contatore cellulare.
Quindi mostreremo come fare la transazione o la trasfezione di questi organoidi epatociti. Per prima cosa, etichetta i tubi di ciò che farai, quindi faremo la trasfezione della vista secondo le istruzioni del produttore. Hai bisogno, il reggente del lipoyl fatto addomesticando INI MaX.
Aggiungiamo il. controllare e il gene specifico siRNA, e incubarli con l'ottimale, secondo le istruzioni del produttore. E poi in base alla concentrazione cellulare aggiungiamo il RAN max e li mescoliamo accuratamente.
Quindi aggiungiamo anche il RAN max con l'optimum separatamente e li mettiamo sul ghiaccio. Dopo 5 minuti, creiamo una miscela RAN max separata con diversi siRNA, il gene specifico RANi e il controllo II separatamente e li mescoliamo accuratamente. Mettili di nuovo sul ghiaccio, e poi raccogliamo tutti gli organoidi, la centrofusione lenta, lasciamo cadere tutto il surnatante, aggiungiamo l'RNAi max, la miscela di siRNA in questa piastra cellulare e la pep su e giù accuratamente.
In breve, le cellule e l'etichetta RNAi max e la miscela di siRNA sono state gentrificazione e incubazione per 4-5 ore a 37 gradi. Parte finale, questi organoidi epatociti potrebbero anche essere infettati dal virus Lenti. Il messaggio simile è stato eseguito come trasfezione di siRNA.
Il controllo e i tubi del virus siRNA erano ben preparati e l'optimum è stato aggiunto secondo le istruzioni del produttore. Quindi con le regioni di infezione come poly green e quindi aggiungiamo diversi virus Lenti, secondo la costituzione delle istruzioni del produttore. Unire le sospensioni monocellulari in coltura di organoidi e varie particelle nei tubi eppendorf da 1,5 millilitri, aggiungere, bene, mescolare piaggere questa miscela e concentrarli per 1 ora a 32 gradi.
La fusione concentrata verrà eseguita a 500 G.E dopo 4-5 ore di incubazione a 37 gradi la sospensione cellulare verrà quindi raccolta e seduta in metrogel. E mettili di nuovo nell'incubatrice. L'organo sull'efficienza di formazione o altre analisi funzionali potrebbero essere eseguite da 7 a 10 giorni dopo.
Ecco i nostri risultati rappresentativi. Nella figura 1A, è possibile vedere i nostri epatociti ALB-Cre Rosa 26-GFP o RFP organoidi dal topo. Nella figura 1B si può vedere il segnale positivo Ki67 nella colorazione, che ha dimostrato che i nostri organoidi epatociti stanno proliferando.
In figura 2A e 2B ecco un'espressione genica rappresentativa della nostra espressione interferente dei nostri geni. Dopo la manipolazione genetica negli organoidi epatociti, l'interferenza efficace è molto efficiente. Ecco la figura 2C, si potrebbe vedere dopo la manipolazione genetica con la tecnologia della carsonite nei nostri organoidi murini.
Conclusione, i nostri risultati hanno mostrato che gli organoidi epatociti potrebbero essere espansi in vitro e geneticamente manipolati. In sintesi, in questo video mostriamo come fare la perfusione epatica e la digestione per ottenere gli epatociti. Come catturare gli epatociti e passare gli organoidi degli epatociti.
Inoltre, abbiamo mostrato come fare la trasfezione di siRNA e vettori o l'infezione da virus Lenti per fare la modifica della genetica di questi organoidi. Inoltre, abbiamo due carenze nei nostri organoidi. In primo luogo, non abbiamo usato per nucleo o nucleo di pelliccia per purificare gli epatociti.
E in secondo luogo penso che più fattori di crescita e segnali dovrebbero essere provati per migliorare il tempo di crescita degli organoidi.
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Panoramica
Questo studio stabilisce un sistema di coltura in organoidi 3D ex vitro a lungo termine da epatociti di topo, che mantengono caratteristiche morfologiche e funzionali critiche. Gli organoids possono essere passaggiati e geneticamente modificati utilizzando tecniche avanzate come l'infezione da lentivirus, shRNA, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Sistemi di coltura degli organoids
- Biologia degli epatociti
- Tecniche di ingegneria genetica
Contesto
- Il fegato è essenziale per il metabolismo e la disintossicazione.
- Esistono sfide nella coltura in vitro a lungo termine degli epatociti.
- Questo lavoro affronta queste sfide sviluppando un modello di organoid affidabile.
Metodi utilizzati
- Tecniche di perfusione e digestione del fegato
- Epatociti di topo come sistema biologico
- Metodologie di infezione da lentivirus, trasfezione di siRNA e CRISPR-Cas9
Principali risultati
- Coltura con successo di organoids di epatociti che mantengono proprietà funzionali chiave.
- Gli organoids hanno mostrato una manipolazione genetica di successo, dimostrando l'efficienza dei metodi di trasfezione.
- I risultati convalidano il potenziale di questo sistema di organoids per future ricerche nella biologia del fegato.
Conclusioni
- Lo studio dimostra una nuova tecnica di coltura di organoids da epatociti di topo.
- I risultati hanno implicazioni significative per la ricerca sul fegato e le applicazioni terapeutiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Establishing scalable hepatocyte organoid models addresses a critical bottleneck in preclinical liver research by enabling long-term culture of functional hepatocytes. This supports mechanistic de-risking of hepatotoxicity and metabolic liability assessments in early discovery. The platform enhances predictive confidence for liver-targeted therapeutic candidates through physiologically relevant in vitro modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hepatic gene function and pathway modulation in a physiologically relevant 3D model.
- Operational Value: Supports consistent target engagement studies using genetically tractable organoids.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a reproducible hepatocyte-based system for compound screening with retained metabolic competence.
- Operational Value: Allows for scalable organoid production and passaging to support medium-throughput assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease modeling and preclinical evaluation of liver-directed therapeutics using genetically engineered organoids.
- Operational Value: Enables longitudinal studies through cryopreservation and recovery of organoid lines.
Pipeline & Workflow Integration
The hepatocyte organoid platform integrates into discovery workflows by providing a renewable source of genetically modifiable hepatocytes for target validation and lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via CRISPR-Cas9, siRNA, and lentiviral-mediated gene modulation in hepatocytes.
- Screening: Delivers assay-ready organoids with stable morphology and function for compound response evaluation.
- Analytics: Generates quantitative readouts such as gene expression, proliferation markers, and metabolic activity for data-driven decisions.
- Translational Research: Bridges discovery to preclinical continuity by modeling human-relevant liver biology in a murine system.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable hepatocyte platform applicable across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through functional genomic screening in a liver-relevant context.
- Operational Value: Standardizes hepatocyte preparation and genetic modification protocols across teams.
- Strategic Value: Reduces attrition risk by enabling early identification of hepatotoxic liabilities.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions using mechanistic data from disease-relevant hepatocyte models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, 3D culture, and organoid handling.
- Dependent on extracellular matrix (e.g., Matrigel) and specialized culture media for organoid formation.
- Necessitates standardized protocols for organoid dissociation, passaging, and genetic modification.
- Adaptation to human hepatocytes or disease models may require optimization of growth factors and culture conditions.
- Long-term genetic stability and functional fidelity should be monitored across passages.
