Analisi del microambiente epatico durante la progressione precoce del carcinoma epatocellulare associato alla steatosi epatica non alcolica nel pesce zebra

I nostri modelli e protocolli di cancro al fegato zebrafish offrono un'opportunità unica per visualizzare in vivo, in modo non invasivo, il microambiente epatico e il panorama immunitario utilizzando la microscopia intravitale. La trasparenza delle larve di zebrafish è senza dubbio il principale vantaggio di questo sistema, che ci consente di eseguire microscopia intravitale non invasiva e ottenere informazioni sul microambiente e sull'infiltrazione delle cellule immunitarie di un tessuto e di un organo profondi, come il fegato. Il nostro modello nefrosico indotto dalla dieta e le tecniche di imaging descritte in questo protocollo possono essere facilmente applicati alle interazioni cellula-cellula contorte in altre malattie del fegato o campi di ricerca, tra cui la sindrome metabolica e le malattie cardiovascolari.

A dimostrare la procedura saranno Cassia Michael, il nostro tecnico di laboratorio, e il Dr.Francisco Juan Martinez-Navarro, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio. Per iniziare, pesare quattro grammi di dieta alimentare secca commerciale per le larve di zebrafish in due becher di vetro da 25 millilitri, uno per la dieta normale e l'altro per la dieta ad alto contenuto di colesterolo al 10% o HCD. Pesare 0,4 grammi di colesterolo in un becher di vetro da 10 millilitri e coprire il becher con un foglio.

In una cappa aspirante, misurare cinque millilitri di etere etilico usando una siringa da 10 millilitri con un ago da 20 gauge. Quindi, aggiungere l'etere etilico al normale becher dietetico e mescolarlo immediatamente con il cibo secco usando una spatola. Misurare altri cinque millilitri di etere etilico usando la stessa siringa e lo stesso ago e aggiungerlo al becher contenente HCD.

Mescolare immediatamente aspirando su e giù con la siringa. Aggiungere rapidamente la soluzione di colesterolo al becher HCD e mescolarla immediatamente con una spatola fino a quando la soluzione è uniforme. Lasciare i bicchieri nel cappuccio per un massimo di 24 ore per far evaporare completamente l'etere etilico.

Il giorno successivo, macinare le diete in particelle fini usando un pestello e un mortaio. Trasferire ogni dieta in un piccolo sacchetto di plastica etichettato o in un tubo da centrifuga da 50 millilitri e conservarli a meno 20 gradi Celsius. Impostare linee di pesci transgenici il giorno meno uno.

Il giorno zero, raccogli le uova in un colino a rete dopo che il pesce ha deposto le uova. Utilizzando un flacone di lavaggio con E3, sciacquare accuratamente le uova e trasferirle accuratamente in piastre di Petri da 10 centimetri con E3 medio. Pulire le piastre da tutti i detriti che potrebbero essersi accumulati nelle cassette di allevamento, comprese eventuali uova morte o non fecondate per evitare la crescita incontrollata di microrganismi e conseguenti difetti nello sviluppo delle larve.

Quindi dividere le uova ad una densità di 70 o 80 uova per piatto contenente 25 millilitri di E3. Il primo giorno, controllare e pulire embrioni morti o embrioni con difetti di sviluppo sotto un cannocchiale di dissezione dotato di una base di transilluminazione. Il quinto giorno, unire le larve di tutti i piatti in una capsula di Petri di 15 centimetri e aggiungere E3 senza blu di metilene. Dividere le larve nelle scatole di alimentazione e dar loro da mangiare come descritto nel manoscritto testuale.

Tenere le larve nella stanza del pesce zebra o in un'incubatrice a 28 gradi Celsius in un ciclo buio-luce e dar loro da mangiare due volte al giorno dal giorno 5 al giorno 12. Rimuovere quotidianamente i residui di cibo e dal 90 al 95% del mezzo utilizzando un sistema a vuoto collegato a una punta di pipetta da un millilitro. Quindi, versare con attenzione il nuovo E3 senza blu di metilene in un angolo della scatola di alimentazione per evitare di danneggiare le larve.

In alternativa, le larve possono essere divise in serbatoi da tre litri con acqua di sistema e posizionate come unità di sistema autonoma con un basso flusso d'acqua. Questa alternativa consente di risparmiare il tempo necessario per il processo di pulizia quotidiano e il sistema di filtrazione aiuta a mantenere le larve sane fino all'endpoint. Il giorno 13, prepara i piatti di raccolta in base al numero di condizioni sperimentali che sono state impostate.

Versare abbastanza E3 senza blu di metilene per coprire il fondo di ogni piatto. Quindi, con attenzione, utilizzando il sistema di aspirazione, aspirare l'acqua dalle scatole di alimentazione. Quando il livello dell'acqua inizia ad abbassarsi, sollevare lentamente la scatola di alimentazione per far nuotare le larve verso uno degli angoli, quindi aspirare nella direzione opposta.

Una volta che rimangono solo circa 20-30 millilitri del liquido, decantare accuratamente le larve nella capsula di Petri di raccolta preparata e posizionare il nastro etichettato dalla scatola di alimentazione sul coperchio del piatto. Su uno stereomicroscopio a fluorescenza, schermare le larve anestetizzate per i marcatori fluorescenti desiderati. Quindi aggiungere tricaina E3 nelle camere del dispositivo di ferimento e intrappolamento.

Rimuovere le bolle d'aria dalle camere e dal canale di ritenuta utilizzando una micropipetta P-200. Rimuovere tutta la tricaina E3 in eccesso, lasciando solo il volume sufficiente per riempire le camere. Quindi, trasferire una larva anestetizzata nella camera di carico del dispositivo di ferita e intrappolamento e posizionarla per l'imaging del lobo sinistro usando uno strumento ciglia.

Immagine della morfologia di tutte le cellule necessarie nel fegato al microscopio confocale come descritto nel manoscritto testuale. Apri il software Fiji. Quindi apri il file immagine e seleziona l'opzione Dividi canali dalla scheda Opzioni di importazione bio-format.

Dopo aver creato proiezioni di massima intensità per ciascun canale, creare un ROI che circonda il fegato larvale e misurare l'area del fegato. Quindi, aggiungi una barra della scala come riferimento e crea un secondo ROI che includa l'area del fegato e 75 micrometri dell'area circostante. Nel menu Plugin, seleziona l'opzione Analizza seguita da Cell Counter e conta le cellule immunitarie all'interno dell'area di reclutamento.

Registra il numero di cellule immunitarie reclutate su un foglio di calcolo. Calcola le densità di neutrofili, macrofagi e cellule T normalizzando il numero di cellule immunitarie per area epatica. Le larve di pesce zebra HCC alimentate con una dieta normale non mostrano steatosi epatica, misurata dalla colorazione Oil Red O.

Tuttavia, le larve di HCC alimentate con HCD mostrano un aumento significativo della steatosi epatica. Dopo otto giorni di esposizione a un surplus di colesterolo, è stato osservato un ingrossamento del fegato nelle larve di HCC. Per valutare l'epatomegalia, sono stati valutati l'area del fegato, la superficie del fegato e il volume del fegato.

Nell'HCC associato alla steatoepatite non alcolica, l'area degli epatociti, insieme all'area nucleare, e il rapporto nucleare-citoplasmatico sono aumentati. Una significativa diminuzione della circolarità nucleare è stata osservata anche nel gruppo HCC alimentato con dieta ad alto contenuto di grassi. Utilizzando il marcatore H2B-mCherry, è stata rilevata una maggiore incidenza di micronuclei nelle larve di HCC alimentate con HCD.

La valutazione della vascolarizzazione epatica ha mostrato un aumento significativo della densità dei vasi nelle larve di HCC alimentate con HCD. L'infiltrazione di macrofagi e neutrofili si è verificata sia nell'HCC che nell'HCC alimentati con larve di HCD. La quantificazione dei neutrofili nei macrofagi nel fegato e nelle sue vicinanze ha mostrato un aumento significativo del numero e della densità delle cellule nelle larve di HCC alimentate con HCD.

Al contrario, è stata osservata una significativa diminuzione della densità delle cellule T nel numero complessivo nelle larve di HCC alimentate con HCD. La pulizia delle vasche e l'alimentazione sono i passaggi più importanti per assicurare la vitalità delle larve ed evitare lo sviluppo di steatosi o infiammazione epatica e cronica sistemica nei controlli a causa della scarsa qualità dell'acqua o di un'alimentazione scorretta. Possono essere eseguiti altri metodi come la microscopia time-lapse e l'analisi dell'interazione tra le diverse cellule che popolano il fegato.

Inoltre, la ricerca di RNA a singola cellula di fegati sezionati in diversi stadi del cancro del fegato può essere eseguita per comprendere appieno come il panorama immunitario del fegato si evolve con la progressione della malattia.