Name: Analisi del microambiente epatico durante la progressione precoce del carcinoma epatocellulare associato alla steatosi epatica non alcolica nel pesce zebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Scopri un protocollo di imaging non invasivo per analizzare il microambiente epatico e la composizione delle cellule immunitarie nel carcinoma epatocellulare associato a NASH usando larve di Danio rerio.

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L'autore desidera ringraziare i tecnici dell'Albert Einstein College of Medicine Zebrafish Core Facility Clinton DePaolo e Spartak Kalinin per l'assistenza e la manutenzione delle nostre linee di zebrafish. FJMN è supportato dal Cancer Research Institute e dalla Fibrolamellar Cancer Foundation.

<ol><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease-Related+Hepatocellular+Carcinoma%3A+A+Problem+of+Growing+Magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Seminals+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude.</a> Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li>
<li>El-Serag, H. B., Kanwal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+hepatocellular+carcinoma+in+the+United+States%3A+where+are+we%3F+Where+do+we+go%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go.</a> Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).</li>
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<li>Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+epidemic+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+demonstrates+an+exponential+increase+in+burden+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease.</a> Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).</li>
<li>Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+innate+immune+response+in+non-alcoholic+Fatty+liver+disease%3A+metabolic+complications+and+therapeutic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools.</a> Frontiers in Immunology. 5, 177(2014).</li>
<li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+non-alcoholic+steatosis+to+steatohepatitis+and+fibrosis+parallels+cumulative+accumulation+of+danger+signals+that+promote+inflammation+and+liver+tumors+in+a+high+fat-cholesterol-sugar+diet+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 193(2015).</li>
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<li>Goessling, W., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+important+tool+for+liver+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An important tool for liver disease research.</a> Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).</li>
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<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zWEDGI%3A+Wounding+and+entrapment+device+for+imaging+live+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae.</a> Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chemical+inhibitors+of+beta-catenin-driven+liver+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose+leads+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+that+is+reversed+by+mechanistic+target+of+rapamycin+%28mTOR%29+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition.</a> Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).</li>
<li>Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid-enriched+diet+induces+hepatic+steatosis+and+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).</li>
<li>Progatzky, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+cholesterol+directly+induces+acute+inflammasome-dependent+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation.</a> Nature Communication. 5, 5864(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Con un aumento dell'incidenza di HCC, in particolare di HCC indotto dalla NASH, è di grande importanza disporre di modelli più efficienti per studiare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nell'HCC associato alla NASH. La deconvoluzione delle interazioni cellula-cellula nel fegato è fondamentale per comprendere meglio la progressione della malattia epatica e l'epatocarcinogenesi. L'approccio descritto in questo protocollo offre un modo unico per analizzare la progressione della malattia epatica in vivo e in modo non invasivo.
La preparazione della dieta è fondamentale per il successo di stabilire un modello HCC associato alla NASH. È importante lasciare che l'etere etilico evapori completamente all'interno della cappa aspirante per evitare effetti dannosi, mentre si preparano diete per zebrafish. Per utilizzare queste diete con le larve (5-12 giorni dopo la fecondazione), è estremamente importante macinare le diete in particelle fini per assicurare l'assunzione di cibo da parte delle larve. L'uso di analoghi degli acidi grassi contrassegnati con fluorescenza può essere utilizzato per valutare l'assunzione di cibo nelle larve.
Prima di posizionare le larve nelle scatole di allevamento e iniziare la procedura di alimentazione, è fondamentale assicurarsi che il campionamento sperimentale sia uniformato mescolando larve da piastre diverse. Questo passaggio è importante poiché diversi microambienti, a partire dal Giorno 0, sono promossi in ciascuna delle piastre e potrebbero influenzare la risposta infiammatoria.
Un altro passo importante è contare le larve, per sapere quanto cibo è necessario per ogni scatola di alimentazione. Se la quantità di cibo non è adeguata al numero di larve presenti in ogni scatola, si verificherà uno dei due scenari: 1) le larve saranno denutrite; 2) le larve saranno sovralimentate. Un'alimentazione imprecisa porterà a condizioni malsane associate a malnutrizione o sovralimentazione, come l'infiammazione, che influenzeranno drasticamente il microambiente epatico. Se si verifica un'alimentazione imprecisa, le larve mostreranno problemi di movimento. In questa fase di sviluppo, le larve dovrebbero nuotare intensamente, quindi se si notano problemi di movimento, le larve sono state allevate in condizioni malsane (malnutrizione o esposizione a dosi tossiche di colesterolo a causa della sovralimentazione). Per questo motivo, le procedure di alimentazione devono essere strettamente controllate sia per le diete, normale che per quella arricchita di colesterolo. Alcuni test possono essere eseguiti per affrontare rapidamente l'accuratezza dell'alimentazione e della salute delle larve, compresa la presenza di epatomegalia (dimensioni del fegato) e l'infiammazione dei tessuti e degli organi, in particolare fegato e intestino (aumento visibile dell'infiltrazione di neutrofili e macrofagi).
La pulizia quotidiana e la sostituzione del 95% di E3 sono fondamentali per ridurre la crescita di microrganismi nelle scatole di alimentazione e migliorare la salute e la sopravvivenza delle larve. In alternativa, le larve possono essere collocate in un sistema rack stand-alone. Per ottenere i migliori risultati, posizionare 60-80 larve in un serbatoio da 3 litri. Mantenere il flusso d'acqua al livello minimo regolando il flusso in una modalità di gocciolamento rapido e alimentando le larve 3-4 mg due volte al giorno (AM e PM). Il flusso d'acqua deve essere controllato regolarmente per garantire il corretto flusso in ogni serbatoio. Nel nostro laboratorio, questo metodo ci dà il 95-100% di sopravvivenza con un'alimentazione a breve termine del 10% di HCD. Inoltre, questo metodo ha notevolmente ridotto il carico di lavoro inerente alla pulizia quotidiana e allo scambio d'acqua necessari nel protocollo di alimentazione statica descritto.
Mentre abbiamo utilizzato una dieta arricchita di colesterolo al 10% per indurre la NASH in un'esposizione a breve termine (5 giorni sono sufficienti per indurre steatoepatite), le alterazioni della dieta possono essere eseguite ed espanse per utilizzare fruttosio 18, acidi grassi (come l'acido palmitico)19 o protocolli di alimentazione che possono essere estesi utilizzando una dieta arricchita di colesterolo al 4%20. Attualmente, ci sono pochi bersagli terapeutici di successo per l'HCC e nessuno per la NASH. L'uso di modelli di zebrafish offre un'opportunità unica per espandere le nostre conoscenze sull'epatocarcinogenesi, ma anche un sistema di vertebrati senza precedenti per eseguire screening farmacologici ad ampio rendimento. Le tecniche descritte in questo protocollo faciliteranno le scoperte future e gli obiettivi terapeutici per le malattie del fegato e l'epatocarcinogenesi.

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è un tumore aggressivo con opzioni terapeutiche limitate. È stato riscontrato che oltre il 30% di tutti i pazienti con HCC sono obesi e hanno NASH, una forma aggressiva di NAFLD 1,2,3,4. Il consumo di diete ricche di calorie aumenta drasticamente la disponibilità di acidi grassi che causano cambiamenti metabolici locali e sistemici e innescano steatosi, lesioni degli epatociti, infiammazione e fibrosi - tutte caratteristiche chiave della NASH. La progressione della NASH verso HCC comporta l'accumulo di lipidi nel fegato, che innesca l'infiammazione e l'alterazione della composizione delle cellule immunitarie 5,6,7. È di particolare interesse e importanza capire come il microambiente epatico e il panorama delle cellule immunitarie sono alterati durante la progressione della malattia epatica e come cambia a causa di determinati fattori eziologici. Per identificare meglio l'impatto che il surplus di colesterolo ha sul microambiente epatico e sul panorama delle cellule immunitarie, abbiamo sviluppato un modello unico di zebrafish di HCC associato alla NASH. L'uso di questo modello ci ha dato una migliore comprensione dell'impatto della dieta e della sovranutrizione sul microambiente epatico e sulla progressione della malattia epatica.
I modelli di mammiferi, come topi e campioni di tessuto umano, sono stati essenziali per comprendere la patogenesi della steatoepatite e della steatosi8. I topi sono il modello preferito per le malattie del fegato e il cancro, ma mancano di chiarezza ottica a livello cellulare, mentre i campioni di tessuto umano spesso mancano dell'ambiente 3D che i modelli animali sono in grado di imitare. Questi ostacoli hanno reso il pesce zebra un modello potente nella comunità di ricerca. I pesci zebra hanno notevoli somiglianze con gli esseri umani, con almeno il 70% di conservazione genetica. Mantengono il microambiente epatico, la composizione cellulare epatica, la funzione, la segnalazione e la risposta alle lesioni 9,10. Utilizzando una dieta ad alto contenuto di colesterolo (HCD) in combinazione con un modello di zebrafish transgenico di HCC, abbiamo sviluppato un modello di zebrafish di HCC associato alla NASH.
Qui presentiamo un protocollo che spiega come generare un modello di zebrafish HCC associato alla NASH e come studiare il microambiente epatico e affrontare le caratteristiche neoplasie precoci in vivo. Utilizzando la microscopia confocale non invasiva in combinazione con linee transgeniche di zebrafish con membrana e nucleo di epatociti marcati in modo fluorescente, possiamo affrontare le caratteristiche di malignità precoce analizzando la morfologia epatica (area, volume e superficie), la morfologia cellulare e nucleare (area degli epatociti, area nucleare, rapporto N/C, circolarità nucleare, micronuclei / punteggio di ernia nucleare) e l'angiogenesi (densità dei vasi). Il microambiente delle cellule immunitarie è anche una caratteristica importante sull'epatocarcinogenesi11,12,13,14, quindi, mostriamo anche come analizzare la composizione delle cellule immunitarie del fegato nelle larve HCC associate alla NASH, utilizzando linee di zebrafish transgeniche con cellule immunitarie marcate (neutrofili, macrofagi e cellule T). Le tecniche descritte sono uniche per il modello ed estremamente utili per valutare il microambiente epatico e la composizione delle cellule immunitarie nella progressione della malattia epatica.

<table><tbody><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>Facilmente degradabile. Negozio -20&deg;C.</td></tr><tr><td>Kit supporto Corning Netwells 15 mm</td><td>Fisher</td><td>07-200-223</td><td></td></tr><tr><td>Inserti Corning Netwells</td><td>Fisher</td><td>07-200-212</td><td></td></tr><tr><td>Etere dietilico</td><td>Fisher</td><td>60-046-380</td><td>Altamente volatile.</td></tr><tr><td>Pinze Dumont #55 dumostar</td><td>Fisher</td><td>NC9504088</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in</td><td>Fisher</td><td>22-183624</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldeide (PFA)</td><td>Microscopia elettronica Scienza</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Golden Pearl Diet 5" 50 nm Active Spheres</td><td>Brine Shrimp</td> <td>Direct-È</td> <td>possibile utilizzare qualsiasi cibo in polvere secco commerciale per larve.</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento graduato</td><td>Fisher</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4, 10X, confezione da 10</td><td>Crystalgen</td><td>221-1422-10</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri 100X20MM</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Fisher</td><td></td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Olio Rosso O soluzione 0,5% isopropanolo</td><td>Sigma</td><td>O1391-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Vactrap</td><td>VWR</td><td>76207-630</td><td>Sistema sottovuoto per raccolta larve</td></tr><tr><td>Microscopi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td> <td>fluorescenteLeica</td><td>M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Microscopio</td> confocale a disco rotante di grandi dimensioni <td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Nikon CSU-W1</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>S9i con base</td><td></td> transilluminata</tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Programma di elaborazione delle immagini Java open source.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.6</td><td>Bitplane; Strumenti di Oxford.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analisi del microambiente epatico durante la progressione precoce del carcinoma epatocellulare associato alla steatosi epatica non alcolica nel pesce zebra

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Il cancro del fegato è attualmente la terza causa di morte correlata al cancro in tutto il mondo e il carcinoma epatocellulare (HCC) rappresenta il 75-90% di tutti i casi di cancro al fegato. Con l'introduzione di trattamenti efficaci per prevenire e curare l'epatite B / C, la steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e la forma più aggressiva nota come steatoepatite non alcolica (NASH), stanno rapidamente diventando i fattori di rischio numero uno per sviluppare HCC nelle società moderne. Per comprendere meglio il ruolo che la NASH ha nello sviluppo dell'HCC, abbiamo progettato un pesce zebra HCC associato alla NASH. La chiarezza ottica e la trattabilità genetica delle larve di zebrafish le rendono un modello attraente e potente per studiare il microambiente epatico e la composizione delle cellule immunitarie utilizzando l'imaging fluorescente dal vivo non invasivo. Questo protocollo descrive come utilizzare un modello di zebrafish HCC associato alla NASH per studiare l'effetto del surplus di colesterolo nel microambiente epatico e il suo impatto sulla composizione delle cellule immunitarie nelle prime fasi della malattia. In primo luogo, nutriamo le larve di HCC (s704Tg), che esprimono beta-catenina attivata specifica per gli epatociti, con una dieta ad alto contenuto di colesterolo al 10% per 8 giorni per sviluppare un modello HCC associato alla NASH. Qui descriviamo come utilizzare diverse linee transgeniche per valutare diverse caratteristiche neoplasie precoci nel fegato mediante microscopia confocale non invasiva, come l'area epatica, la cellula e la morfologia nucleare (area degli epatociti, area nucleare, rapporto nucleare:citoplasmatico (rapporto N:C), circolarità nucleare, micronuclei/punteggio di ernia nucleare) e angiogenesi. Quindi, utilizzando linee transgeniche con cellule immunitarie marcate (neutrofili, macrofagi e cellule T) mostriamo come analizzare la composizione delle cellule immunitarie del fegato nelle larve HCC associate alla NASH. Le tecniche descritte sono utili per valutare il microambiente epatico e la composizione delle cellule immunitarie nelle prime fasi dell'epatocarcinogenesi, ma possono anche essere modificate per studiare tali caratteristiche in altri modelli di malattia epatica.

Introducendo una dieta a breve termine ad alto contenuto di colesterolo in un modello di zebrafish con carcinoma epatocellulare (HCC), che sovraesprime una forma costitutivamente attiva specifica per gli epatociti di beta-catenina (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17, siamo in grado di creare un modello di vertebrato non mammifero di HCC associato alla NASH. La progressione della malattia epatica può essere monitorata precocemente misurando la steatosi epatica, le dimensioni del fegato, l'epatocita, la morfologia nucleare, l'angiogenesi e l'infiltrazione delle cellule immunitarie (Figura 1).
Le larve di HCC alimentate con una dieta normale non mostrano steatosi epatica lieve, misurata dalla colorazione Oil Red O. Tuttavia, le larve di HCC alimentate con una dieta ricca di colesterolo mostrano un aumento significativo della steatosi epatica (Figura 2).
Un marker ben noto di malattia epatica è l'epatomegalia17. Per valutare le dimensioni del fegato, le larve di HCC possono essere incrociate con una linea transgenica che esprime specificamente un marcatore fluorescente sugli epatociti, come il Tg (fabp10a: H2BmCherry). Per valutare l'epatomegalia, vengono eseguite la valutazione dell'area epatica (2D), della superficie epatica e del volume epatico (3D). Dopo 8 giorni di esposizione a un surplus di colesterolo, è stato osservato un ingrossamento del fegato nelle larve di HCC (Figura 3).
Utilizzando l'imaging live non invasivo, linee di pesci transgenici che esprimono proteine fluorescenti nelle membrane degli epatociti (come Tg (fabp10a: Life-actina-EGFPP) e nei nuclei degli epatociti (come Tg (Fabp10a: H2B-mCherry) possono essere utilizzate per valutare le alterazioni morfologiche cellulari e nucleari associate alla malignità negli epatociti. L'area degli epatociti era aumentata nell'HCC associato alla NASH (Figura 4A,B,D), così come nell'area nucleare (Figura 4C,E) e nel rapporto nucleare:citoplasmatico (Figura 4F). Una significativa diminuzione della circolarità nucleare è stata osservata anche nel gruppo HCD+HCC (Figura 4G). La lipotossicità innesca il danno al DNA, una caratteristica della carcinogenesi in presenza di micronuclei. Utilizzando il marcatore H2B-mCherry abbiamo osservato una maggiore incidenza di micronuclei nelle larve di HCC alimentate con una dieta ricca di colesterolo (Figura 4H).
La vascolarizzazione epatica può essere facilmente valutata in modelli di zebrafish utilizzando una linea marcata transgenica, come Tg (kdrl:mCherry o Tg(fli:EGFP), che marcano la vascolarizzazione. Un aumento significativo della densità dei vasi è stato osservato nelle larve di HCC+HCD (Figura 5).
Per osservare la risposta infiammatoria innescata precocemente nell'HCC associato alla NASH, una linea di pesci transgenici che esprime proteine fluorescenti nei macrofagi e nei neutrofili, come Tg (mfap4: tdTomato-CAAX; lyz: BFP), è stata incrociata con la linea transgenica HCC. L'infiltrazione di neutrofili e macrofagi si verifica sia nell'HCC che nell'HCC alimentati con HCD, che è stata valutata mediante quantificazione del numero e della densità dei neutrofili/macrofagi nel fegato e nelle vicinanze (area circostante fino a 75μm) (Figura 6A-H). Tuttavia, l'HCC+HCD ha mostrato un aumento significativo del numero e della densità dei neutrofili (Figure 6F-H). A 13 giorni dalla fecondazione, il sistema immunitario adattativo è già funzionale. Utilizzo di una linea di pesci transgenici che esprimono proteine fluorescenti in cellule T, come la Tg(lck:EGFP), e in combinazione con la linea transgenica HCC; abbiamo valutato l'impatto del surplus di colesterolo sul reclutamento delle cellule T nel fegato. Una significativa diminuzione della densità delle cellule T e del numero complessivo è stata osservata nelle larve di HCC alimentate con HCD (Figura 6I-K).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Linee di pesce zebra transgenico</td>
			<td>Riferimento ZFIN</td>
			<td>Saggio</td>
		</tr><tr><td>Casper</td>
			<td>RoyA9; mitfaw2</td>
			<td>Steat osi epatica</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venere / fabp10a:H2B-mCherry )</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg</td>
			<td>Morfologia del fegato</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venere; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg</td>
			<td>Epatociti e morfologia nucleare</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / y1Tg</td>
			<td>Angiogenesi</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venere;  mfap4:Pomodoro-CAAX; lyzC:BFP)</td>
			<td>s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg</td>
			<td>Reclutamento di macrofagi e neutrofili</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / cz1Tg</td>
			<td>Reclutamento delle cellule T</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Linee di pesci zebra transgenici da utilizzare in diversi saggi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Numero di larve</td>
			<td>Dimensioni della scatola di alimentazione</td>
			<td>Quantità di cibo al giorno (mg)</td>
			<td>Volume E3 (ml)</td>
		</tr><tr><td>30-40</td>
			<td>Piccola scatola di allevamento</td>
			<td>3-4</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>60-80</td>
			<td>Piccola/grande scatola di allevamento</td>
			<td>6-8</td>
			<td>400</td>
		</tr><tr><td>100-150</td>
			<td>Grande scatola di allevamento</td>
			<td>10-15</td>
			<td>500</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Impostare le condizioni delle scatole di alimentazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fenotipo</td>
			<td>Metodo di assegnazione dei punteggi</td>
		</tr><tr><td>Nessuno</td>
			<td>Nuclei normali, Nessun micronuclei o ernia</td>
		</tr><tr><td>Lieve</td>
			<td>Basso numero di micronuclei (meno di 5 per campo visivo) e/o ernia</td>
		</tr><tr><td>Moderato/Grave</td>
			<td>Numero da moderato ad elevato di micronuclei (più di 5 per campo visivo) e/o ernia</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Micronuclei e punteggio di ernia nucleare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma di protocollo che riassume le principali fasi sperimentali e l'approccio analitico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig02.jpg"> Figura 2: Saggio di controllo per la steatosi epatica - colorazione ORO. Le larve di HCC sono state alimentate con una dieta a base di colesterolo normale o alto ed è stata eseguita la colorazione Oil Red O (ORO) per valutare la steatosi epatica. (A) Diagramma della piastra a 12 pozzetti per eseguire la colorazione sequenziale ORO utilizzando gli inserti del pozzetto della rete. (B) Immagine dello strumento ciglia utilizzato per manipolare le larve. (C) immagini rappresentative di fegati macchiati di rosso olio; Larve di HCC e HCC+HCD. (D) Grafico del chi-quadrato che mostra la percentuale di larve con diversi punteggi di steatosi epatica. Barra di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig03.jpg"> Figura 3: Immagini rappresentative dalle dimensioni del fegato. Le larve transgeniche di HCC che esprimono un marcatore epatico (Tg (fabp10a: H2B-mCherry)) sono state visualizzate dal vivo e in modo non invasivo, su un microscopio confocale a disco rotante invertito utilizzando uno zWEDGI. (A) Ricostruzioni rappresentative 3D di fegati in larve di HCC e HCC+HCD. (B-D) Grafico che mostra le alterazioni morfologiche del fegato tra cui l'area epatica (B), l'area della superficie epatica (C) e il volume del fegato (D) nelle larve di HCC e HCC + HCD. Barra di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig04.jpg"> Figura 4: Immagini rappresentative della morfologia degli epatociti e dei nuclei. Sono state visualizzate linee HCC transgeniche che esprimono proteine fluorescenti nelle membrane degli epatociti (Tg(fabp10a:Life-actina-EGFP) e nei nuclei degli epatociti (Tg(fabp10a:H2B-mCherry). (A-C) Ricostruzioni rappresentative 3D di nuclei di F-actina ed epatociti di larve di HCC e HCC+HCD. Le punte di freccia aperte mostrano nuclei allargati; le punte di freccia bianche mostrano un nucleo con forma alterata; e le frecce rosse mostrano micronuclei ed ernia nucleare. (D-G) Grafici che mostrano le medie dei parametri cellulari e nucleari nelle larve di HCC e HCC + HCD di 13 giorni. (D) Area degli epatociti. e) Zona nucleare. (F) Rapporto nucleare:citoplasma. G) Circolarità nucleare. Ogni punto rappresenta le medie per larva. I grafici a punti mostrano grafici medi ± (H) Chi-quadrato che mostrano la percentuale di larve con diversi punteggi di micronuclei e ernia nucleare. Barra di scala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig05.jpg"> Figura 5: Immagini rappresentative dal sistema vascolare epatico. Linee HCC transgeniche che esprimono proteine fluorescenti nei nuclei degli epatociti (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) e nelle cellule endoteliali (Tg)fli:EGFP)). (A) Ricostruzioni rappresentative 3D della vascolarizzazione epatica nelle larve di HCC e HCC+HCD. (B-C) Grafico che mostra l'indice di densità dei vasi per superficie epatica (B) del volume (C) nelle larve di HCC e HCC + HFCD. I grafici a punti mostrano la media ±SEM. Barra di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig06.jpg"> Figura 6: Immagini rappresentative dal panorama delle cellule immunitarie del fegato. Linea HCC transgenica che esprime proteine fluorescenti in macrofagi e neutrofili (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) o in cellule T (Tg(lck-EGFP). (A,C,F) Ricostruzioni rappresentative 3D di fegati e reclutamento di leucociti nell'area epatica in larve di HCC e HCC + HCD di 13 giorni. (B) Diagramma dell'area del fegato visualizzata. (D-E) Grafico che mostra la densità dei macrofagi (D) e il numero (E) nell'area epatica nelle larve di HCC e HCC + HCD. (G-H) Grafico che mostra la densità dei neutrofili (G) e il numero (H) nell'area epatica nelle larve di HCC e HCC + HCD. (G) Ricostruzioni rappresentative 3D del reclutamento delle cellule T nell'area epatica nelle larve di HCC e HCC+HCD. (H-I) Grafico che mostra la densità delle cellule T (H) e il numero (I) nell'area del fegato nelle larve di HCC e HCC + HCD. I grafici a punti mostrano la media ±SEM. Barra di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Tabella supplementare 1: Tabella dei buffer e delle soluzioni <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/JoVE_Table_of_buffersandsolutions.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>

Qui, presentiamo come generare un modello di zebrafish con carcinoma epatocellulare (HCC) associato alla malattia del fegato grasso non alcolico (NAFLD) per studiare l'impatto del surplus di colesterolo sul microambiente epatico e sul panorama delle cellule immunitarie.

Analisi del microambiente epatico durante la progressione precoce del carcinoma epatocellulare associato alla steatosi epatica non alcolica nel pesce zebra

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

I nostri modelli e protocolli di cancro al fegato zebrafish offrono un'opportunità unica per visualizzare in vivo, in modo non invasivo, il microambiente epatico e il panorama immunitario utilizzando la microscopia intravitale. La trasparenza delle larve di zebrafish è senza dubbio il principale vantaggio di questo sistema, che ci consente di eseguire microscopia intravitale non invasiva e ottenere informazioni sul microambiente e sull'infiltrazione delle cellule immunitarie di un tessuto e di un organo profondi, come il fegato. Il nostro modello nefrosico indotto dalla dieta e le tecniche di imaging descritte in questo protocollo possono essere facilmente applicati alle interazioni cellula-cellula contorte in altre malattie del fegato o campi di ricerca, tra cui la sindrome metabolica e le malattie cardiovascolari.A dimostrare la procedura saranno Cassia Michael, il nostro tecnico di laboratorio, e il Dr.Francisco Juan Martinez-Navarro, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio. Per iniziare, pesare quattro grammi di dieta alimentare secca commerciale per le larve di zebrafish in due becher di vetro da 25 millilitri, uno per la dieta normale e l'altro per la dieta ad alto contenuto di colesterolo al 10% o HCD. Pesare 0,4 grammi di colesterolo in un becher di vetro da 10 millilitri e coprire il becher con un foglio.In una cappa aspirante, misurare cinque millilitri di etere etilico usando una siringa da 10 millilitri con un ago da 20 gauge. Quindi, aggiungere l'etere etilico al normale becher dietetico e mescolarlo immediatamente con il cibo secco usando una spatola. Misurare altri cinque millilitri di etere etilico usando la stessa siringa e lo stesso ago e aggiungerlo al becher contenente HCD.Mescolare immediatamente aspirando su e giù con la siringa. Aggiungere rapidamente la soluzione di colesterolo al becher HCD e mescolarla immediatamente con una spatola fino a quando la soluzione è uniforme. Lasciare i bicchieri nel cappuccio per un massimo di 24 ore per far evaporare completamente l'etere etilico.Il giorno successivo, macinare le diete in particelle fini usando un pestello e un mortaio. Trasferire ogni dieta in un piccolo sacchetto di plastica etichettato o in un tubo da centrifuga da 50 millilitri e conservarli a meno 20 gradi Celsius. Impostare linee di pesci transgenici il giorno meno uno.Il giorno zero, raccogli le uova in un colino a rete dopo che il pesce ha deposto le uova. Utilizzando un flacone di lavaggio con E3, sciacquare accuratamente le uova e trasferirle accuratamente in piastre di Petri da 10 centimetri con E3 medio. Pulire le piastre da tutti i detriti che potrebbero essersi accumulati nelle cassette di allevamento, comprese eventuali uova morte o non fecondate per evitare la crescita incontrollata di microrganismi e conseguenti difetti nello sviluppo delle larve.Quindi dividere le uova ad una densità di 70 o 80 uova per piatto contenente 25 millilitri di E3. Il primo giorno, controllare e pulire embrioni morti o embrioni con difetti di sviluppo sotto un cannocchiale di dissezione dotato di una base di transilluminazione. Il quinto giorno, unire le larve di tutti i piatti in una capsula di Petri di 15 centimetri e aggiungere E3 senza blu di metilene. Dividere le larve nelle scatole di alimentazione e dar loro da mangiare come descritto nel manoscritto testuale.Tenere le larve nella stanza del pesce zebra o in un'incubatrice a 28 gradi Celsius in un ciclo buio-luce e dar loro da mangiare due volte al giorno dal giorno 5 al giorno 12. Rimuovere quotidianamente i residui di cibo e dal 90 al 95% del mezzo utilizzando un sistema a vuoto collegato a una punta di pipetta da un millilitro. Quindi, versare con attenzione il nuovo E3 senza blu di metilene in un angolo della scatola di alimentazione per evitare di danneggiare le larve.In alternativa, le larve possono essere divise in serbatoi da tre litri con acqua di sistema e posizionate come unità di sistema autonoma con un basso flusso d'acqua. Questa alternativa consente di risparmiare il tempo necessario per il processo di pulizia quotidiano e il sistema di filtrazione aiuta a mantenere le larve sane fino all'endpoint. Il giorno 13, prepara i piatti di raccolta in base al numero di condizioni sperimentali che sono state impostate.Versare abbastanza E3 senza blu di metilene per coprire il fondo di ogni piatto. Quindi, con attenzione, utilizzando il sistema di aspirazione, aspirare l'acqua dalle scatole di alimentazione. Quando il livello dell'acqua inizia ad abbassarsi, sollevare lentamente la scatola di alimentazione per far nuotare le larve verso uno degli angoli, quindi aspirare nella direzione opposta.Una volta che rimangono solo circa 20-30 millilitri del liquido, decantare accuratamente le larve nella capsula di Petri di raccolta preparata e posizionare il nastro etichettato dalla scatola di alimentazione sul coperchio del piatto. Su uno stereomicroscopio a fluorescenza, schermare le larve anestetizzate per i marcatori fluorescenti desiderati. Quindi aggiungere tricaina E3 nelle camere del dispositivo di ferimento e intrappolamento.Rimuovere le bolle d'aria dalle camere e dal canale di ritenuta utilizzando una micropipetta P-200. Rimuovere tutta la tricaina E3 in eccesso, lasciando solo il volume sufficiente per riempire le camere. Quindi, trasferire una larva anestetizzata nella camera di carico del dispositivo di ferita e intrappolamento e posizionarla per l'imaging del lobo sinistro usando uno strumento ciglia.Immagine della morfologia di tutte le cellule necessarie nel fegato al microscopio confocale come descritto nel manoscritto testuale. Apri il software Fiji. Quindi apri il file immagine e seleziona l'opzione Dividi canali dalla scheda Opzioni di importazione bio-format.Dopo aver creato proiezioni di massima intensità per ciascun canale, creare un ROI che circonda il fegato larvale e misurare l'area del fegato. Quindi, aggiungi una barra della scala come riferimento e crea un secondo ROI che includa l'area del fegato e 75 micrometri dell'area circostante. Nel menu Plugin, seleziona l'opzione Analizza seguita da Cell Counter e conta le cellule immunitarie all'interno dell'area di reclutamento.Registra il numero di cellule immunitarie reclutate su un foglio di calcolo. Calcola le densità di neutrofili, macrofagi e cellule T normalizzando il numero di cellule immunitarie per area epatica. Le larve di pesce zebra HCC alimentate con una dieta normale non mostrano steatosi epatica, misurata dalla colorazione Oil Red O.Tuttavia, le larve di HCC alimentate con HCD mostrano un aumento significativo della steatosi epatica. Dopo otto giorni di esposizione a un surplus di colesterolo, è stato osservato un ingrossamento del fegato nelle larve di HCC. Per valutare l'epatomegalia, sono stati valutati l'area del fegato, la superficie del fegato e il volume del fegato.Nell'HCC associato alla steatoepatite non alcolica, l'area degli epatociti, insieme all'area nucleare, e il rapporto nucleare-citoplasmatico sono aumentati. Una significativa diminuzione della circolarità nucleare è stata osservata anche nel gruppo HCC alimentato con dieta ad alto contenuto di grassi. Utilizzando il marcatore H2B-mCherry, è stata rilevata una maggiore incidenza di micronuclei nelle larve di HCC alimentate con HCD.La valutazione della vascolarizzazione epatica ha mostrato un aumento significativo della densità dei vasi nelle larve di HCC alimentate con HCD. L'infiltrazione di macrofagi e neutrofili si è verificata sia nell'HCC che nell'HCC alimentati con larve di HCD. La quantificazione dei neutrofili nei macrofagi nel fegato e nelle sue vicinanze ha mostrato un aumento significativo del numero e della densità delle cellule nelle larve di HCC alimentate con HCD.Al contrario, è stata osservata una significativa diminuzione della densità delle cellule T nel numero complessivo nelle larve di HCC alimentate con HCD. La pulizia delle vasche e l'alimentazione sono i passaggi più importanti per assicurare la vitalità delle larve ed evitare lo sviluppo di steatosi o infiammazione epatica e cronica sistemica nei controlli a causa della scarsa qualità dell'acqua o di un'alimentazione scorretta. Possono essere eseguiti altri metodi come la microscopia time-lapse e l'analisi dell'interazione tra le diverse cellule che popolano il fegato.Inoltre, la ricerca di RNA a singola cellula di fegati sezionati in diversi stadi del cancro del fegato può essere eseguita per comprendere appieno come il panorama immunitario del fegato si evolve con la progressione della malattia.

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Ricerca sul cancro

Per aiutare a valutare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione epatica guidata dalle vie biliari del pesce zebra, abbiamo stabilito un modello di danno epatico in cui gli epatociti che esprimono nitroreduttasi vengono geneticamente ablati dopo il trattamento con metronidazolo.  In questo protocollo, descriviamo come manipolare, monitorare e analizzare abilmente l'ablazione degli epatociti e la rigenerazione epatica indotta dalle vie biliari.

Ablazione specifiche Hepatocyte in Zebrafish allo Studio biliare-driven Liver Regeneration

La fibrosi sostenuta con deposizione di proteine della matrice extracellulare eccessive porta alla cirrosi. L'abuso di alcol è una delle principali cause di gravi malattie del fegato. Abbiamo stabilito un modello di fegato fibrotico di zebrafish indotto da etanolo per studiare i meccanismi e le strategie di promozione della rigenerazione degli epatociti in seguito a danno indotto dall'alcol.

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

I pesci zebra stanno emergendo come un valido modello di elaborazione dei lipidi alimentari e di malattie metaboliche. Vengono descritti i protocolli di mangimi larvali ricchi di lipidi, l'imaging dal vivo di analoghi lipidici fluorescenti dietetici e la quantificazione dell'assunzione di cibo. Queste tecniche possono essere applicate a una varietà di tecniche di screening, imaging e indagine basata su ipotesi.

Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, l&#39;imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo

Questo protocollo descrive le analisi istologiche dei fegati delle larve di zebrafish che sono state trattate con 2% di etanolo per 24 ore. Tale trattamento di etanolo acuto provoca steatosi epatica e gonfiore della vasculatura epatica.

Analisi istologiche di lesioni al fegato acuto alcolico in Zebrafish

Qui dimostriamo un metodo per quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale, fornendo un modo per valutare gli effetti delle manipolazioni genetiche e farmacologiche sulla crescita e lo sviluppo del fegato.

Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield

Qui, forniamo un protocollo passo-passo, con suggerimenti per generare xenografti e linee guida per l'analisi del comportamento tumorale, l'immunofluorescenza a montaggio intero e la quantificazione dell'imaging confocale.

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Studio di vettori virali in un tridimensionale fegato Modello ripopolata con l&#39;Umano carcinoma epatocellulare Linea cellulare HepG2

La capacità dei cloni metastatici di colonizzare siti distanti dipende dalla loro capacità di proliferazione e/o dalla loro capacità di sopravvivere nel microambiente ospite senza una proliferazione significativa. Qui, presentiamo un modello animale che consente la visualizzazione quantitativa di entrambi i tipi di colonizzazione del fegato da parte di cloni metastatici.

Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni

Descriviamo in dettaglio un modello tumorale del cancro colorettale clinicamente rilevante (CRLM) e l'influenza della reperfusione di ischemia epatica (I/R) nella crescita tumorale e nella metastasi. Questo modello può aiutare a comprendere meglio i meccanismi alla base della promozione metastatica del fegato indotta da un intervento chirurgico.

Modello Murine dei tumori metastatici del fegato nell'impostazione della lesione alla riperfusione dell'ischemia

I modelli murini xenoma uvea-hettale del fegato umano ortotopico sono stati creati utilizzando tecniche di impianto ortotopico chirurgico con pezzi tumorali derivati dal paziente e tecniche di iniezione di aghi con linee cellulari di melanoma uveale umano coltivate.

Generazione di una piattaforma di Melanoma Uvenoma Uvenoft umano del fegato in topi immunodeficienti

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