Name: Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Impara a studiare la fagocitosi di Leishmania braziliensis nei macrofagi utilizzando microscopia confocale e tecniche di trasfezione. Questo metodo permette di analizzare il reclutamento di proteine come LC3, Rab5 e Rab7 nelle vacuoli parassitofore.

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Ringraziamo l'Istituto Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahia, Brasile e il dipartimento di microscopia per l'assistenza. Questo lavoro è stato supportato dal numero 79700287000 di INOVA-FIOCRUZ, P.S.T.V. detiene una sovvenzione per la produttività nella ricerca da CNPq (305235 / 2019-2). I plasmidi sono stati gentilmente forniti da Mauricio Terebiznik, Università di Toronto, CA. Gli autori desiderano ringraziare Andris K. Walter per la revisione in lingua inglese e l'assistenza per il copyediting del manoscritto.

Le cellule sono state ottenute da donatori sani a seguito dell'approvazione delle procedure da parte dei comitati etici nazionali di ricerca (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Colture cellulari
<ol><li>Macrofagi derivati da monociti umani NOTA: Per ottenere macrofagi derivati da monociti umani per la differenziazione in vitro in macrofagi, raccogliere sangue da donatori sani e purificare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) come descritto da D. English e B. R. Andersen21.<ol><li>Dopo aver raccolto il sangue periferico (50 ml), versarlo in un tubo eparinizzato e quindi diluire il sangue 1:1 in una soluzione tampone fosfato (PBS) a temperatura ambiente. Posizionare delicatamente il sangue eparinizzato diluito sopra il mezzo di gradiente di densità precedentemente distribuito.</li>
		<li>Centrifugare le provette a 252 × g per 30 minuti a 24 °C per evitare l'emolisi. NOTA: Impostare l'interruzione della centrifuga per evitare la miscelazione di strati sfumati. Dopo la centrifugazione, dal basso verso l'alto si formano strati sfumati discontinui: eritrociti, mezzo di gradiente di densità, anello PBMC e plasma.</li>
		<li>Trasferire l'anello PBMC, situato tra il mezzo di gradiente di densità e gli strati di plasma, in un nuovo tubo e riempire con PBS per lavare il mezzo di gradiente di densità in eccesso.</li>
		<li>Lavare le celle una volta e centrifugare a 190 × g per 10 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di mezzo RPMI completo.</li>
		<li>Contare le cellule e la piastra 2 × 106 cellule in 500 mL del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrate con 25 mM di N-[2-idrossietil] piperazina-N′-[2-etano solfonico] (HEPES), 2 g/L di bicarbonato di sodio, 2 mM di glutammina, 20 g/ml di ciprofloxacina e il 10% di siero bovino fetale inattivato (FBS) (mezzo RPMI completo) per 7 giorni a 37 °C sotto il 5% di CO2 in una piastra a 24 pozzetti per consentire ai monociti di differenziarsi in macrofagi per adesione.</li>
	</ol></li>
	<li>Colture THP-1<ol><li>Coltivare la linea cellulare THP-1 ad una concentrazione di 2 × 105 cellule in 10 ml di mezzo RPMI completo in un matraccio di coltura da 75 cm2 .</li>
		<li>Mantenere le colture cellulari in un incubatore a 37 °C sotto il 5% di CO2 per 7 giorni.</li>
		<li>Centrifugare le celle a 720 × g per 10 minuti a 4 °C e risospendere il pellet in mezzo RPMI completo.</li>
		<li>Contare le celle in una camera di Neubauer.</li>
		<li>Celle a piastre su vetrini da 13 mm ad una concentrazione di 2 × 10 5 celle per pozzetto in 500 μL di mezzo RPMI completo contenente 100 nM forbolo miristato acetato (PMA) a 37 °C sotto il5 % di CO2 per consentire la differenziazione delle cellule THP1 in macrofagi.</li>
		<li>Dopo tre giorni, lavare due volte le cellule con una soluzione di NaCl allo 0,9% per rimuovere il mezzo contenente PMA.</li>
		<li>Incubare cellule THP-1 differenziate in mezzo RPMI completo privo di PMA a 37 °C sotto il 5% di CO 2 per altri2 giorni prima di iniziare la sperimentazione.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Colture parassitarie e colorazione rossa CellTracker
NOTA: Per visualizzare i parassiti attraverso la microscopia a fluorescenza, eseguire la colorazione utilizzando il colorante fluorescente rosso CellTracker (CMTPX). In alternativa, altri marcatori, tra cui la carbossifluoresceina, possono essere utilizzati in conformità con le istruzioni del produttore o promastigoti che esprimono costitutivamente GFP, RFP o altri geni reporter fluorescenti. I parassiti utilizzati per infettare le cellule sono quelli in fase stazionaria di crescita ottenuti da una coltura axenica promastigote di non più di 7 passaggi.
<ol><li>Coltiva Leishmania spp. promastigoti a 1 x 10 5 parassiti per 1.000 μL di terreno in un matraccio di coltura cellulare contenente5 mL di terreno di coltura di Schneider integrato con 50 μg/mL di gentamicina e 10% di FBS.</li>
	<li>Dopo aver incubato colture axeniche parassitarie in una domanda biochimica di ossigeno (B.O.D.) a 24 °C, eseguire il conteggio giornaliero in una camera Neubauer. Controlla la forma del parassita (sottile, allungata) e la mobilità per 5 giorni. I parassiti sono considerati in fase stazionaria di crescita quando due conteggi consecutivi con 8 ore di intervallo mostrano quantità simili.</li>
	<li>Al raggiungimento della fase stazionaria di crescita, incubare i parassiti in 4 ml di soluzione allo 0,9% di NaCl con 1 μM CMTPX per 15 minuti a 37 °C sotto il 5% di CO2 evitando il contatto con la luce.</li>
	<li>Aggiungere FBS in proporzione 1:1 e incubare la sospensione del parassita per un ulteriore 1 minuto.</li>
	<li>Lavare i parassiti tre volte con PBS, seguito da centrifugazione a 1.781 × g per 10 minuti.</li>
	<li>Risospendere il pellet parassita in 1.000 μL di mezzo RPMI completo.</li>
	<li>Contare i parassiti in una camera Neubauer.</li>
</ol>3. Valutazione del legame della Leishmania ai macrofagi
<ol><li>Seme 2 × 105 cellule THP-1 o macrofagi derivati da monociti umani in 500 μL di mezzo RPMI completo per pozzetto su una piastra da 24 pozzetti con vetrini da 13 mm.</li>
	<li>Coltivare cellule a 37 °C sotto il 5% di CO2 per 24 ore.</li>
	<li>Lavare le celle due volte con una soluzione di NaCl allo 0,9% e incubare in mezzo RPMI completo a 4 °C per 10 minuti.</li>
	<li>Aggiungere i promastigoti di fase stazionaria descritti da A. L. Petersen22 in rapporto 10:1 alle piastre dei pozzetti, quindi centrifugare a 720 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Incubare a 4 °C per 5 min.</li>
	<li>Lavare le cellule due volte con una soluzione di NaCl allo 0,9% per rimuovere eventuali promastigoti non internalizzati.</li>
	<li>Fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare i coprivetrini con 15 mM NH4Cl per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare tre volte con PBS 0,15% albumina sierica bovina (BSA). Incubare con soluzione bloccante (3% BSA in PBS) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare tre volte con PBS e poi permeabilizzare con 0,15% PBS-Saponin per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere falloidina (diluita 1:1.200) per 1 ora a temperatura ambiente e proteggere dalla luce.</li>
	<li>Montare i coprivetrini utilizzando il supporto di montaggio.</li>
	<li>Acquisire immagini tramite un microscopio a fluorescenza confocale utilizzando un obiettivo 63×/1.4.</li>
</ol>4. Valutazione della fagocitosi della Leishmania mediante macrofagi
<ol><li>Seme 2 × 105 cellule THP-1 o macrofagi derivati da monociti umani in 500 μL di mezzo RPMI completo per pozzetto su una piastra da 24 pozzetti con vetrini da 13 mm.</li>
	<li>Coltivare cellule per 24 ore a 37 °C sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Lavare le celle due volte in soluzione di NaCl allo 0,9% e incubare in mezzo RPMI completo in piastra a 24 pozzetti a 4 °C per 10 minuti.</li>
	<li>Aggiungere Leishmania spp. in fase stazionaria come descritto da A. L. Petersen22 in rapporto 10:1 (parassita:cellula ospite), quindi centrifugare a 720 × g per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Incubare le cellule a 4 °C per 5 min.</li>
	<li>Lavare le cellule due volte con una soluzione di NaCl allo 0,9% per rimuovere eventuali promastigoti non internalizzati.</li>
	<li>Incubare le cellule in mezzo RPMI integrato a 37 °C per 1 ora.</li>
	<li>Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti.</li>
	<li>Montare i coprivetrini utilizzando il supporto di montaggio preferito.</li>
	<li>Contare non meno di 400 cellule in campi casuali al microscopio a fluorescenza utilizzando un obiettivo 100×/1.4.</li>
</ol>5. Valutazione della maturazione vacuola indotta da Leishmania
NOTA: La trasfezione cellulare THP-1 deve essere eseguita come descritto da M. B. Maess, B. Wittig e S. Lorkowski 23. Qui riassumiamo questo protocollo, con modifiche minime. La nucleofezione è un metodo di trasfezione specifico che richiede un nucleofector. Come metodo alternativo, le cellule possono essere trasfettate usando lipofectamine24 e lentivirus transduction25.
<ol><li>Per studiare la biogenesi del PV indotto da Leishmania, trasfettare le cellule THP1 con plasmidi PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 o Rab 728,29,31. NOTA: Questa metodologia può essere utilizzata per trasfettare le cellule THP-1 con geni diversi da quelli sopra elencati.</li>
	<li>Cellule THP-1 da seme a 1,5 x 107 in 75 cm² di palloni di coltura tissutale contenenti 10 mL di terreno RPMI completo integrato con 100 ng/mL PMA e 50 μM di 2-mercaptoetanolo per 48 ore.</li>
	<li>Lavare le celle una volta in soluzione di NaCl allo 0,9%.</li>
	<li>Staccare le cellule utilizzando una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica e centrifugare (250 × g) per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere le cellule THP-1 in 1 mL di mezzo RPMI ed eseguire conteggi in una camera Neubauer.</li>
	<li>Centrifugare nuovamente le celle THP-1 a 250 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere 2 × 106 cellule in 100 μL di soluzione di Nucleofector e incubare con 0,5 μg del plasmide che codifica per la proteina di interesse, marcato con una proteina fluorescente.</li>
	<li>Trasferire la sospensione contenente cellule THP-1 e acido nucleico nella cuvetta del nucleofector.</li>
	<li>Transfettare le cellule THP1 utilizzando il programma Nucleofector Y-001.</li>
	<li>Recuperare le cellule trasfettate (2x106) e seminare in mezzo RPMI da 500 μL su piastre a 24 pozzetti con vetrini da 13 mm (4 pozzetti/trasfezione).</li>
	<li>Incubare cellule THP-1 in mezzo RPMI completo a 37 °C per 0,5, 2, 4, 6, 12 e 24 ore.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.13 e 3.13.</li>
</ol>6. Valutazione del reclutamento di LC3 in Leishmania spp.
NOTA: Il marcatore di membrana autofagica LC3 può essere utilizzato per indagare se i fagosomi presentano caratteristiche autofagiche. Il reclutamento di CL3 nei PV indotti da Leishmania può essere valutato durante l'infezione mediante immunomarcatura delle cellule con l'anticorpo anti-LC3, come precedentemente descritto da C. Matte32 e B. R. S. Dias33.
<ol><li>Seed 2 × 10 5cellule THP-1 o macrofagi derivati da monociti umani in mezzo RPMI completo da 500 μL su una piastra da 24 pozzetti con vetrini da 13 mm.</li>
	<li>Coltivare cellule per 24 ore a 37 °C sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Lavare le celle due volte in soluzione di NaCl allo 0,9% e incubare in mezzo RPMI completo.</li>
	<li>Aggiungere Leishmania spp. promastigotes in fase stazionaria come descritto da A. L. Petersen22 in rapporto 10:1 (parassita: cellule ospiti) e centrifugare le cellule a 720 × g per 5 minuti sotto 4 °C.</li>
	<li>Incubare a 37 °C per 30 minuti o 4 ore. Quindi lavare due volte e fissare le cellule per valutare il reclutamento di LC3 nelle membrane PV indotte da Leishmania nelle prime fasi dell'infezione.<ol><li>In alternativa, per valutare il reclutamento di LC3 nelle membrane fotovoltaiche nelle fasi successive dell'infezione, lavare due volte un altro gruppo di macrofagi a 4 ore di infezione per rimuovere eventuali promastigotiti non internalizzati. Incubare le cellule infette in mezzo RPMI completo per ulteriori 12 ore e 24 ore, per infine lavare due volte e risolvere. NOTA: Le celle fisse possono essere conservate in PBS o soluzione allo 0,9% di NaCl a 4 °C fino all'etichettatura.</li>
	</ol></li>
	<li>Contemporaneamente bloccare e permeabilizzare le cellule fisse in 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 20% siero di capra normale, 6% latte secco non grasso e 50% FBS per 20 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare le cellule con anticorpo anti-LC3 (1: 200) diluito in PBS per 2 ore a temperatura ambiente. NOTA: Come controllo negativo dell'immunocolorazione, un gruppo di cellule deve essere incubato con immunoglobuline G (IgG) dall'animale di origine anticorpale primaria in una concentrazione equivalente a quella utilizzata per l'anticorpo primario.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con una soluzione di NaCl allo 0,9% a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare le cellule con IgG anti-coniglio coniugate con AlexaFluor 488 (1:500) o con anticorpi secondari coniugati con colorante fluorescente preferito per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con una soluzione di NaCl allo 0,9% a temperatura ambiente.</li>
	<li>Montare i coprivetrini utilizzando il supporto di montaggio preferito.</li>
	<li>Acquisisci immagini tramite microscopio a fluorescenza confocale utilizzando un obiettivo 63x/1.4.</li>
</ol>7. Acquisizione di microscopia confocale e quantificazione delle Fiji
NOTA: L'acquisizione di immagini di immunofluorescenza deve essere eseguita utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Per ottenere una risoluzione migliore, utilizzare un obiettivo 63x ad immersione d'olio.
<ol><li>Lasciare i vetrini da 13 mm a temperatura ambiente e proteggerli dalla luce almeno 30 minuti prima dell'acquisizione.</li>
	<li>Pulire i vetrini con un fazzoletto assorbente.</li>
	<li>Aggiungi una goccia di olio ad immersione all'obiettivo e aggiungi la diapositiva.</li>
	<li>Spostate l'obiettivo verso l'alto finché l'olio non tocca la diapositiva.</li>
	<li>Osservare e regolare la messa a fuoco sul microscopio e scegliere l'opzione obiettivo 63x con olio.</li>
	<li>Aprite il programma Leica e regolate i laser nelle lunghezze d'onda 488, 552 e 405.</li>
	<li>Selezionare la risoluzione dell'immagine 1.024 x 1.024.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Live , impostare lo stack Z e premere l'opzione Inizio . Quindi, fallo di nuovo e premi il pulsante Fine . Si consiglia 20 μm per lo spessore della fetta per ottenere immagini confocali con buone risoluzioni.</li>
	<li>Attendete l'acquisizione dell'immagine, quindi selezionate l'opzione "Proiezione massima" negli strumenti Leica.</li>
	<li>Salvare l'esperimento.</li>
	<li>Esportare le immagini in formato lif o tiff su un computer e aprire il programma FIJI.</li>
	<li>Apri l'esperimento e imposta lo stack di visualizzazione con l'hyperstack. Quindi selezionare Apri i file singolarmente e cuci le tessere.</li>
	<li>Selezionare lo strumento mani libere nella barra degli strumenti delle Figi e tracciare attentamente la cella a mano.</li>
	<li>Premere il pulsante Analizza e misurare per visualizzare l'intensità della fluorescenza.</li>
	<li>Ripetere questo processo per ogni cella per gruppo.</li>
	<li>Salva le misure ed esportale in un editor di fogli di calcolo.</li>
	<li>Aggiungi questi dati a un programma di analisi statistica ed esegui l'analisi statistica.</li>
</ol>8. Analisi statistica
NOTA: per l'analisi dei dati e la grafica, utilizzare un programma di analisi statistica.
<ol><li>Apri il programma.</li>
	<li>Inserire i dati ottenuti e testare i parametri di normalità.</li>
	<li>Per i dati con distribuzione normale, utilizzare il test t di Student e per i test non parametrici, il test di Mann-Whitney.</li>
	<li>Considerare i dati con una differenza statisticamente significativa quando il valore p è inferiore a 0,05.</li>
	<li>Preparare grafici che rappresentino i dati, con misure di tendenza centrale (media o mediana) e misure di variazione.</li>
</ol>

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</ol>

I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta o analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto. Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

L'interazione Leishmania-macrofagi è un processo complesso e comporta diversi passaggi che possono influenzare lo sviluppo della malattia5. Per comprendere meglio i meccanismi coinvolti nell'interazione tra Leishmania non opisonizzata e cellule ospiti, abbiamo descritto un protocollo che impiega la microscopia a fluorescenza confocale per valutare la fagocitosi dalle fasi iniziali a quelle tardive dell'infezione da Leishmania. L'uso di tecniche di fluorescenza che coinvo...

La leishmaniosi è una malattia tropicale trascurata causata da protozoi parassiti del genere Leishmania, che provoca un ampio spettro di manifestazioni cliniche nell'ospite vertebrato, tra cui la leishmaniosi cutanea, la leishmaniosi mucocutanea e la leishmaniosi viscerale1. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) stima che oltre un miliardo di persone siano a rischio, con oltre un milione di nuovi casi segnalati ogni anno2.
Leishmania spp. sono protozoi intracellulari obbligati che sopravvivono all'interno delle cellule ospiti, inclusi monociti, macrofagi e cellule dendritiche3. L'interazione Leishmania-macrofagi è un processo complesso che coinvolge più recettori delle cellule ospiti e ligandi parassiti sia attraverso l'interazione diretta che per opsonizzazione che coinvolge i recettori del complemento 4,5. I recettori di superficie classici, come CR1, CR3, mannosio-fucosio, fibronectina, recettori toll-like e scavenger, mediano l'attaccamento del parassita ai macrofagi 6,7,8. Questi recettori riconoscono le molecole sulla superficie della Leishmania, tra cui la glicoproteina 63 kDa (gp63) e il glicolipide lipofosfoglicano (LPG)9. Queste sono le molecole più abbondanti sulla superficie dei promastigoti e svolgono un ruolo essenziale nella sovversione della risposta immunitaria dell'ospite, favorendo l'instaurarsi dell'infezione parassitaria nelle cellule di mammifero10. Dopo che i ligandi superficiali del parassita si legano ai recettori dei macrofagi, la F-actina si accumula sulle superfici cellulari dei mammiferi, circondando i parassiti mentre sono fagocitati. Successivamente, questo porta alla formazione di un compartimento indotto dal parassita chiamato vacuolo parassitoforo (PV), che presenta caratteristiche fagolisosomiali11. Una volta all'interno di questi fagolisosomi, i parassiti subiscono diverse alterazioni essenziali per la sopravvivenza e la moltiplicazione3.
La biogenesi dei PV è un processo di traffico di membrana altamente regolato critico per la sopravvivenza intracellulare di questo patogeno12. La formazione di questo compartimento deriva da eventi di fusione sequenziale tra fagosomi e compartimenti della via endocitica dell'ospite. Studi classici di biologia cellulare hanno rivelato che la maturazione dei PV comporta l'acquisizione delle proteine monomeriche G Rab 5 e Rab 7, che sono principalmente associate alla maturazione precoce e tardiva dell'endosoma, rispettivamente13. Inoltre, questi compartimenti acquisiscono le proteine di membrana associate ai lisosomi 1 e 2 (LAMP 1, LAMP 2), i principali costituenti proteici della membrana lisosomiale e la proteina 1A/1B-catena leggera associata ai microtubuli (LC3), un marcatore autofagosomico14. Nonostante apparenti somiglianze, la cinetica della formazione PV15,16 e la morfologia di questi compartimenti variano a seconda delle specie di Leishmania. Ad esempio, l'infezione causata da L. mexicana o L. amazonensis induce la formazione di grandi compartimenti contenenti un gran numero di parassiti17. Al contrario, altre specie, come L. braziliensis e L. infantum, formano vacuoli più piccoli che normalmente contengono solo uno o due parassiti in ogni vacuolo18.
Nonostante questa conoscenza che circonda l'interazione cellula ospite-Leishmania, gli eventi iniziali innescati dal contatto tra i recettori dell'ospite e i ligandi dei parassiti non sono stati completamente chiariti. Questi eventi sono noti per essere determinanti dell'esito dell'infezione parassitaria e dipendono dalle specie di parassiti, dal tipo di recettori delle cellule ospiti reclutati per riconoscere i parassiti e dall'attivazione delle vie di segnalazione dei macrofagi19,20. Pertanto, è essenziale identificare le molecole coinvolte nella biogenesi dei PV indotti da Leishmania e determinare il ruolo svolto da queste molecole nell'instaurazione e nell'esito dell'infezione. Qui, descriviamo un metodo di monitoraggio degli eventi precoci che si verificano durante la fagocitosi della Leishmania, tra cui il legame, l'internalizzazione, la formazione e la maturazione dei fagosomi. Questo lavoro potrebbe aiutare a chiarire la partecipazione di PLC, Akt, Rab5, Rab7 e LC3 nella formazione di PV indotti da diverse specie di Leishmania. È importante sottolineare che questo protocollo può essere utilizzato per studiare la partecipazione di altre proteine coinvolte nella maturazione del PV. Studi futuri amplieranno le conoscenze sui meccanismi coinvolti nell'interazione Leishmania-cellula ospite e contribuiranno alla progettazione di nuove strategie chemioterapiche.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-coniugato capra anti-coniglio IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Tem varios no site</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-LC3</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-1384</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Rosso (CMTPX) Colorante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Centr&iacute; Thermo</td><td>Fisher Scientific Incubatore</td><td></td><td></td></tr> a <tr><td>CO2 Ciprofloxacina</td><td>Isofarma</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza confocale (Leica SP8)</td><td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td></td>Microscopio a fluorescenza <td>Gibco</td> 10270106 <td></td></tr><tr><td>(Olympus Lx73)</td><td>Olympus</td><td>Olympus Lx73</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750045</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Acido N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etano-solfonico)</td><td>Gibco</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Sigma</td><td>NS02L</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Dispositivo</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di nucleofector</td><td>Lonza</td><td>VPA-1007</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di miristato di forbolo (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone fosfato (PBS)</td>Kit <td></td> antisbiadimento <td>Thermo Fisher Scientific</td> 10010023 <td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Insetto di Schneider medio</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X</td><td></td></tr></tbody></table>

studiare la fagocitosi della leishmania usando la microscopia confocale

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

La fagocitosi è un processo orchestrato che coinvolge fasi distinte: riconoscimento, legame e internalizzazione. I fagociti professionali assorbono i parassiti della Leishmania mediante fagocitosi, consistente nel riconoscere i ligandi sulle superfici dei parassiti da più recettori delle cellule ospiti. Il legame della Leishmania alle membrane dei macrofagi avviene attraverso il recettore del complemento di tipo 1 (CR1) e il recettore del complemento di tipo 3 (CR3) e i recettori di riconoscimento dei pattern. Il lipofosfoglicano (LPG) e la glicoproteina 63 kDa (gp63) sono i principali ligandi coinvolti nelle interazioni macrofago-Leishmania . Dopo il riconoscimento iniziale dei ligandi del parassita da parte dei recettori delle cellule ospiti, i parassiti si internalizzano, sopravvivono e si moltiplicano all'interno dei vacuoli parassitoforici. Il processo di maturazione dei vacuoli indotti da Leishmania comporta l'acquisizione di molecole da vescicole intracellulari, tra cui la proteina G monomerica Rab 5 e Rab 7, la proteina di membrana associata lisosomiale 1 (LAMP-1), la proteina di membrana associata lisosomiale 2 (LAMP-2) e la proteina 1A/1B-catena leggera 3 associata ai microtubuli (LC3).
Qui, descriviamo i metodi per valutare i primi eventi che si verificano durante l'interazione della Leishmania con le cellule ospiti usando la microscopia confocale, incluso (i) legame (ii) internalizzazione e (iii) maturazione dei fagosomi. Aggiungendo al corpo di conoscenze che circondano questi determinanti dell'esito dell'infezione, speriamo di migliorare la comprensione della patogenesi dell'infezione da Leishmania e sostenere l'eventuale ricerca di nuovi bersagli chemioterapici.

Questo rapporto si propone di valutare gli eventi precoci che si verificano durante la fagocitosi di L. braziliensis isolati da pazienti che presentano forma di CL L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL. Utilizzando la microscopia confocale, abbiamo studiato i principali eventi associati alla fagocitosi dei parassiti: legame, internalizzazione e maturazione dei fagosomi. Per prima cosa abbiamo valutato il legame e la fagocitosi di L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL mediante ma...

Il meccanismo associato alla fagocitosi nell'infezione da Leishmania rimane poco conosciuto. Qui, descriviamo i metodi per valutare gli eventi precoci che si verificano durante l'interazione di Leishmania con le cellule ospiti.

Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Il meccanismo associato alla fagocitosi nell'infezione da Leishmania rimane poco compreso. Qui descriviamo i metodi per valutare i primi stati di cura durante l'interazione Leishmania con le cellule ospiti. Questa tecnica si presenta come il principale vantaggio, consentendo lo studio di diversi stati di fagocitosi Leishmania e la partecipazione di diverse proteine.Vale la pena notare che questa tecnica può anche essere estesa ad altri tipi di studi, tra cui l'infezione da batteri, lieviti o l'inghiottimento da parte di altri tipi di cellule. Le persone che provano questa tecnica dovrebbero prendersi cura del tempo di esposizione delle cellule alla soluzione Nucleofector. Inoltre, suggeriamo di iniziare a testare la trasfezione utilizzando un massimo di due plasmidi.A dimostrare la procedura sarà Amanda Reboucas, dottoranda del nostro laboratorio. Per cominciare, seminare 0,2 milioni di cellule THP-1 o macrofagi derivati da monociti umani in 500 microlitri RPMI per pozzetto su una piastra da 24 pozzetti con vetrini da 13 millimetri. Incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica, lavare le celle due volte con soluzione salina allo 0,9% e incubare le cellul

investigating-the-phagocytosis-of-leishmania-using-confocal-microscopy

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Imaging in vivo del transgenico parassiti Leishmania in un host live

Un saggio parassita-salvataggio e di trasformazione con THP1 cellule...

Un test Parasite salvataggio e di trasformazione per screening Antileishmanial contro intracellulare<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoti in THP1 umana linea cellulare Leucemia acuta Monocytic

Questo video indaga la virulenza della Leishmania trattando i macrofagi con promastigoti metaciclici, con conseguente formazione di amastigoti intracellulari. La conferma della virulenza della Leishmania si ottiene attraverso la colorazione con colorante fluorescente con acido nucleico. Questa intuizione può contribuire allo sviluppo di nuove terapie per la leishmaniosi.

Valutazione della virulenza della Leishmania nei macrofagi in coltura

Questo video mostra un test per quantificare la crescita intracellulare dei parassiti nei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM). Le cellule macrofagiche sono infettate dagli stadi invasivi mobili e non mobili della Leishmania, rispettivamente i promastigoti metaciclici e gli amastigoti. I parassiti invadono i macrofagi, interiorizzandosi in un vacuolo parassitoforo e moltiplicandosi all'interno. La crescita intracellulare del parassita viene quantificata utilizzando un microscopio dopo...

Un test in vitro per quantificare la crescita intracellulare del parassita nei macrofagi

Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia...

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Tutte le specie di Leishmania patogene risiedono e replicano all'interno dei macrofagi dei loro ospiti vertebrati. Qui, presentiamo un protocollo per infettare i macrofagi murini derivate da midollo osseo nella cultura con Leishmania, seguita da quantificazione precisa della cinetica di crescita intracellulare. Questo metodo è utile per lo studio di singoli fattori che influenzano l'interazione ospite-patogeno e la virulenza di Leishmania .

Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania

Qui, descriviamo la metodologia utilizzata per generare ceppi di L. panamensis e L . donovani che esprimono il gene per eGFP come transgene integrato stabile utilizzando il sistema pLEXSY. I parassiti trasfettati sono stati clonati limitando la diluizione e i cloni con la più alta intensità di fluorescenza in entrambe le specie sono stati selezionati per un ulteriore utilizzo nei saggi di screening farmacologico.

Sviluppo di ceppi di specie di Leishmania con espressione costitutiva di eGFP

Qui presentiamo una valutazione longitudinale di criceti dorati infettati per via intraperitoneale (IP) o per via intragengivale (IG) con L. infantum-Luc mediante imaging bioluminescente e mediante PCR. I criceti sono stati valutati 1 giorno dopo l'infezione (1 dpi), 1 settimana dopo l'infezione (8 dpi) e 3 settimane dopo l'infezione (22 dpi) e soppressi al 50° dpi e 8 mesi dopo l'infezione.

In vivo Imaging di criceti infetti da Leishmania infantum mediante inoculazione gengivale di amastigoti axenici che esprimono luciferasi

Questo esperimento viene visualizzata una guida per l'utilizzo fluorescente un clone molecolare di HIV per vivere esperimenti di imaging confocale.

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l'osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

Impara a studiare la fagocitosi di Leishmania braziliensis nei macrofagi utilizzando microscopia confocale e tecniche di trasfezione. Questo metodo permette di analizzare il reclutamento di proteine come LC3, Rab5 e Rab7 nelle vacuoli parassitofore.

Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale

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