Name: Microirraggiamento laser per studiare il reclutamento del DNA durante la fase S (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Scopri la microirraggiamento laser per analizzare il reclutamento delle proteine di riparazione del DNA durante la fase S utilizzando PCNA fluorescente e microscopia confocale. Questo metodo consente di osservare la cinetica di riparazione in tempo reale nelle cellule viventi.

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Gli autori ringraziano M. Pagano per il suo continuo supporto così come D. Simoneschi, A. Marzio e G. Tang per la loro revisione critica del manoscritto. B. Miwatani-Minter ringrazia R. Miwatani e B. Minter per il loro continuo supporto. G. Rona ringrazia K. Ronane Jurasz e G. Rona per il loro continuo supporto.

<ol><li>Aleksandrov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+in+complex+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics in complex DNA lesions.</a> Molecular Cell. 69 (6), 1046-1061 (2018).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H., Podhorecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization+by+inhibitors+of+DNA+replication+induces+replication+stress+and+DNA+damage+response%3A+Analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: Analysis by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Herce, H. D., Rajan, M., Lattig-Tunnemann, G., Fillies, M., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+permeable+DNA+replication+and+repair+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">A novel cell permeable DNA replication and repair marker.</a> Nucleus. 5 (6), 590-600 (2014).</li>
<li>Keijzers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+exonuclease+1+%28EXO1%29+regulatory+functions+in+dna+replication+with+putative+roles+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in dna replication with putative roles in cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), (2018).</li>
<li>Cheruiyot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29-binding+promotes+Exo1+damage+recruitment+and+suppresses+its+nuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose)-binding promotes Exo1 damage recruitment and suppresses its nuclease activities.</a> DNA Repair (Amsterdam). 35, 106-115 (2015).</li>
<li>Zhang, F., Shi, J., Chen, S. H., Bian, C., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+domain+of+EXO1+recognizes+poly%28ADP-ribose%29+in+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PIN domain of EXO1 recognizes poly(ADP-ribose) in DNA damage response.</a> Nucleic Acids Research. 43 (22), 10782-10794 (2015).</li>
<li>Rona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+recruitment+of+the+FBXL10-RNF68-RNF2+ubiquitin+ligase+to+sites+of+DNA+damage+controls+H2A.Z+loading%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent recruitment of the FBXL10-RNF68-RNF2 ubiquitin ligase to sites of DNA damage controls H2A.Z loading.</a> elife. 7, (2018).</li>
<li>Young, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIMELESS+forms+a+complex+with+PARP1+distinct+from+its+complex+with+TIPIN+and+plays+a+role+in+the+dna+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TIMELESS forms a complex with PARP1 distinct from its complex with TIPIN and plays a role in the dna damage response.</a> Cell Reports. 13 (3), 451-459 (2015).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+to+study+in+vivo+cellular+responses+to+simple+and+complex+dna+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation to study in vivo cellular responses to simple and complex dna damage.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56213(2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensin+I+recruitment+to+base+damage-enriched+DNA+lesions+is+modulated+by+PARP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Condensin I recruitment to base damage-enriched DNA lesions is modulated by PARP1.</a> PLoS One. 6 (8), 23548(2011).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+site-specific+induction+of+oxidative+DNA+damage+reveals+differences+in+recruitment+of+repair+proteins+to+heterochromatin+and+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2330-2345 (2014).</li>
<li>Zerjatke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cell+cycle+analysis+based+on+an+endogenous+all-in-one+reporter+for+cell+tracking+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative cell cycle analysis based on an endogenous all-in-one reporter for cell tracking and classification.</a> Cell Reports. 19 (9), 1953-1966 (2017).</li>
<li>Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+infection+of+cultured+cells+induces+oxidative+stress+and+attenuates+cellular+base+excision+repair+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity.</a> Mutation Research. 845, 403054(2019).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumoniae+infection+induces+reactive+oxygen+species+and+DNA+damage+in+A549+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumoniae infection induces reactive oxygen species and DNA damage in A549 human lung carcinoma cells.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4405-4413 (2008).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amsterdam). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Muster, B., Rapp, A., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+DNA+damage+induction+and+DNA+repair+pathway+activation+by+continuous+wave+visible+light+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of DNA damage induction and DNA repair pathway activation by continuous wave visible light laser micro-irradiation.</a> AIMS Genetics. 4 (1), 47-68 (2017).</li>
<li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+human+NTH1%2C+a+homolog+of+Escherichia+coli+endonuclease+III.+Direct+identification+of+Lys-212+as+the+active+nucleophilic+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of human NTH1, a homolog of Escherichia coli endonuclease III. Direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (34), 21585-21593 (1998).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 94 (14), 7429-7434 (1997).</li>
<li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (20), 2575-2584 (2015).</li>
<li>Taccioli, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku80%3A+product+of+the+XRCC5+gene+and+its+role+in+DNA+repair+and+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ku80: product of the XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination.</a> Science. 265 (5177), 1442-1445 (1994).</li>
<li>Marsin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+XRCC1+in+the+coordination+and+stimulation+of+oxidative+DNA+damage+repair+initiated+by+the+DNA+glycosylase+hOGG1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of XRCC1 in the coordination and stimulation of oxidative DNA damage repair initiated by the DNA glycosylase hOGG1.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44068-44074 (2003).</li>
<li>Thompson, L. H., Brookman, K. W., Jones, N. J., Allen, S. A., Carrano, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+human+XRCC1+gene%2C+which+corrects+defective+DNA+strand+break+repair+and+sister+chromatid+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the human XRCC1 gene, which corrects defective DNA strand break repair and sister chromatid exchange.</a> Molecular and Cell Biology. 10 (12), 6160-6171 (1990).</li>
<li>Scharer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+excision+repair+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide excision repair in eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 5 (10), 012609(2013).</li>
<li>Oeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+protein+migration+and+localization+after+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of protein migration and localization after laser micro-irradiation.</a> Science Reports. 9 (1), 3148(2019).</li>
<li>Mistrik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+and+stripes%3A+A+novel+quantitative+photo-manipulation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique.</a> Science Reports. 6, 19567(2016).</li>
<li>Durand, R. E., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity%2C+mutagenicity+and+dna+damage+by+hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity, mutagenicity and dna damage by hoechst 33342.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (2), 111-116 (1982).</li>
<li>Tobey, R. A., Oishi, N., Crissman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization%3A+reversible+induction+of+G2+synchrony+in+cultured+rodent+and+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization: reversible induction of G2 synchrony in cultured rodent and human diploid fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 87 (13), 5104-5108 (1990).</li>
<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+phosphorylation%3A+Its+role+in+DNA+damage+response+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">H2AX phosphorylation: Its role in DNA damage response and cancer therapy.</a> Journal of Nucleic Acids. 2010, (2010).</li>
</ol>

Gli autori affermano che la pubblicazione del lavoro presentato è stata sponsorizzata da Nikon Corporation. Gli autori dichiarano che non esistono interessi concorrenti.

Passaggi critici e potenziali problemi/modifiche del protocollo Un adeguato vaso di coltura tissutale per la micro-irradiazione è fondamentale per il successo. La maggior parte dei sistemi di imaging ad alta risoluzione sono ottimizzati per uno spessore del vetro di copertura di 0,17 mm. L'utilizzo di camere di imaging di spessore superiore o inferiore o di quelle realizzate con polimeri plastici (non ottimizzate per l'imaging a 405 nm) può ridurre significativamente la qualità dell'immagine. Quando si utilizzano superfici di vetro, assicurarsi che siano trattate con colture tissutali per migliorare l'adesione cellulare. Se non sono trattate con coltura tissutale, queste camere dovranno essere rivestite, ad esempio, con poli-D-lisina prima di seminare le cellule. Quando si placcano le celle nel vetro di copertura camerato, la densità cellulare ideale è fondamentale per evitare irregolarità del ciclo cellulare e stress aggiuntivo per le cellule. Un corretto equilibrio termico dei componenti del microscopio prima della sperimentazione per mantenere una temperatura stabile è fondamentale sia per mantenere la messa a fuoco durante l'imaging time lapse sia per garantire una DDR omogenea nel tempo e nei campioni.
È fondamentale che le cellule siano in condizioni sane prima della micro-irradiazione per ridurre i dati artefatti. Se le cellule hanno una morfologia irregolare post-infezione / selezione, consentire alle cellule di progredire attraverso più passaggi fino a quando la morfologia non ritorna alla normalità. Assicurarsi sempre che le linee di cellule utilizzate siano prive di contaminazione da micoplasma. Tra i molti effetti avversi dell'infezione da micoplasma, provoca anche danni al DNA delle cellule ospiti e potrebbe influenzare le loro vie DDR14,15. Il modo più sensibile per rilevare il micoplasma nella coltura cellulare è attraverso la PCR (versus. rilevamento con DAPI o Hoechst).
La sovraespressione ottimale della proteina di riparazione di interesse dovrebbe essere paragonabile ai livelli endogeni, tuttavia, abbastanza alta per il rilevamento. Il promotore utilizzato sui vettori virali, il titolo virale durante l'infezione e la durata del tempo di infezione possono essere regolati per i livelli di espressione ideali. Per risultati coerenti, isolare i singoli cloni cellulari per garantire livelli di espressione omogenei e una normale morfologia cellulare. Si raccomanda di utilizzare costrutti vettoriali che non sovraesprimano il PCNA marcato a livelli superiori a quelli endogeni per una corretta funzione di marcatore di riparazione del DNA e del ciclo cellulare. Anche bassi livelli di sovraespressione di PCNA sono sufficienti per discriminare le cellule in fase S. I vettori pBABE retrovirali sono stati utilizzati con successo per questo scopo (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PcNA può essere etichettato con qualsiasi proteina fluorescente monomerica rossa(ad esempio, mPlum, mCherry, mRuby, ecc.) o monomerica verde fluorescente (ad esempio, mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, ecc.) che potrebbe quindi essere combinata con un POI alternativamente taggato. La sovraespressione di un POI con tag fluorescenti presenta alcune limitazioni e considerazioni. I tag fluorescenti possono interrompere la normale funzione e localizzazione delle proteine. Pertanto, la posizione del tag (N o C-terminale) deve essere considerata. Utilizzare sempre proteine fluorescenti monomeriche, poiché l'oligomerizzazione di varianti non monomeriche può influenzare la funzione del POI.
Le impostazioni laser devono essere determinate per ciascun sistema di imaging poiché molti componenti del percorso ottico influenzeranno la potenza effettiva erogata nelle celle. La microirraggiamento laser può causare diversi tipi di lesioni del DNA a seconda della lunghezza d'onda di eccitazione, della potenza erogata dal laser FRAP e se sono stati utilizzati agenti pre-sensibilizzanti (come Bromodeoxyuridine o Hoechst). I laser a 405 nm possono causare danni ossidativi al DNA, rotture a singolo e doppio filamento16,17. Utilizzando impostazioni di uscita laser più elevate, la quantità di DSB aumenta. In questo protocollo non sono stati utilizzati metodi di pre-sensibilizzazione, ma queste tecniche sono ampiamente trattate in letteratura e ricapitole nella discussione seguente. A nostro parere, il modo migliore per verificare se la lesione desiderata viene generata è testare il reclutamento di geni specifici del percorso di danno al DNA noti. Il reclutamento di NTHL1 o OGG1, componenti della via BER, suggerisce l'induzione delle basi di DNA ossidato10,11,17,18,19,mentre FBXL10 o XRCC5 indicano la presenza di DSB8,20,21. Il reclutamento di XRCC1 può indicare sia la presenza di basi di DNA ossidate che di rotture a singolo filamento (SSB)22,23. XPC (cioè RAD4) è un buon indicatore di NER che rimuove gli addotti di DNA voluminosi generati dalla luce ultravioletta (UV)17,24. Poiché il reclutamento di proteine esogene può introdurre alcune irregolarità, la colorazione immunofluorescente di proteine o marcatori di riparazione del DNA endogeno (come γH2A.X per le rotture a doppio filamento) può confermare la presenza di specifiche lesioni del DNA. In alternativa, potrebbero essere utilizzati anche anticorpi sollevati contro specifici tipi di lesioni del DNA. Per regolare la potenza del laser erogata, è possibile modificare sia il tempo di permanenza che la potenza del laser.
Con l'aiuto della modellazione matematica, è stato possibile eseguire un'analisi cinetica dettagliata in grado di fornire preziose informazioni sulle proprietà di reclutamento del POI (ad esempio, contributo di più domini di legame del DNA, sensibilità verso diversi eventi di segnalazione, ecc.). La valutazione automatizzata del reclutamento e il monitoraggio delle cellule potrebbero essere combinati per creare flussi di lavoro robusti 1,25.
Vantaggi e limiti della pre-sensibilizzazione del DNA La pre-sensibilizzazione del DNA prima della micro-irradiazione è uno strumento comunemente usato per il reclutamento delle proteine di riparazione del DNA16,17. La sensibilizzazione del DNA prima della micro-irradiazione lo rende più suscettibile ai DSB. I due metodi più comuni per la pre-sensibilizzazione del DNA sono il pre-trattamento delle cellule con bromodeossiuridina (BrdU) o colorante Hoechst. Per i sistemi non in grado di microirraggiare ad alte potenze laser, questi metodi possono essere necessari per indurre lesioni del DNA come i DSB. Inoltre, in assenza di un rivelatore di luce trasmessa o di un segnale fluorescente che evidenzi il nucleo cellulare (ad esempio, quando si studia il reclutamento di proteine di riparazione del DNA endogene senza tag), Hoechst agisce sia come strumento di presensibilizzante che come macchia nucleare fluorescente. Tuttavia, la pre-sensibilizzazione del DNA può introdurre complicazioni significative. BrdU (utilizzato ad una concentrazione finale di 10 μM) deve essere aggiunto alle cellule 24 ore (o tempo equivalente a un ciclo cellulare completo nella linea cellulare utilizzata) per incorporarsi correttamente nel DNA e può causare interferenze del ciclo cellulare26. Hoechst 33342 (utilizzato ad una concentrazione finale di 1 μg/mL) è citotossico dopo lunghi periodi di incubazione, ma richiede tempo sufficiente per saturare il nucleo con il colorante. Pertanto, dovrebbe essere applicato solo 15-20 minuti prima della microirraggiamento; in caso contrario, i dati di reclutamento non saranno coerenti. Le cellule macchiate in questo modo non possono essere tenute in coltura per più di qualche ora27,28. Assicurarsi di non utilizzare Hoechst 33358, che non è permeabile alle cellule come il colorante Hoechst 33342. La pre-sensibilizzazione può anche introdurre inutili variazioni tra gli esperimenti e rende l'esperimento ancora più sensibile alle differenze nella densità cellulare (poiché ciò influenzerà la quantità di colorante / cellula incorporato).
Vantaggi e limiti della microscopia confocale La velocità di imaging della microscopia confocale può essere limitante rispetto alla microscopia a campo largo. Tuttavia, un microscopio confocale dotato di uno scanner risonante può migliorare enormemente la velocità di imaging (a scapito della risoluzione) avvicinandosi alle velocità della microscopia a disco rotante. Tre caratteristiche rendono il sistema confocale A1R HD25 una scelta eccellente per il protocollo qui presentato. In primo luogo, il FOV di 25 mm del sistema consente di eseguire l'immagine tra 15-20 celle in un singolo campo scansionato (rispetto alle 5-10 celle nelle configurazioni regolari), limitando il numero di acquisizioni necessarie per ottenere abbastanza celle per l'analisi statistica. In secondo luogo, il modulo FRAP e due teste di scansione consentono di image e micro-irradiare le cellule contemporaneamente, non solo in sequenza. Infine, la flessibilità di avere sia gli scanner risonanti che galvano offre la possibilità di passare facilmente tra l'imaging ad alta risoluzione temporale con una velocità eccezionale che riduce al minimo la tempra dei fluorofori e l'imaging ad alta risoluzione spaziale che utilizza velocità di scansione più lente per produrre immagini con un rapporto segnale/rumore più elevato. Mentre il sistema utilizzato consentiva la suddetta flessibilità, per assomigliare a configurazioni di microscopio confocale più ampiamente disponibili, solo lo scanner galvano è stato utilizzato negli esperimenti presentati (sia per la micro-irradiazione che per l'imaging successivo).
Vantaggi e limiti della microirraggiamento Mentre la microirraggiamento fornisce una risoluzione spaziale e temporale senza rivali, non è senza limitazioni. Il danno al DNA da microirraggiamento laser è altamente raggruppato in parti specifiche del nucleo rispetto agli agenti dannosi presenti in natura. Pertanto, la risposta alla cromatina dovuta alla microirraggiamento può differire rispetto al danno distribuito in modo omogeneo. Inoltre, la microirraggiamento richiede molto tempo e può essere condotta solo su poche dozzine di cellule, mentre i metodi biochimici basati su grandi popolazioni (frazionamento della cromatina, immunoprecipitazione, ChIP) possono fornire una maggiore robustezza studiando migliaia di cellule alla volta. Verificare le osservazioni fatte dalla microirraggiamento con tecniche biochimiche tradizionali è una strategia efficace per conclusioni affidabili. Sebbene sia possibile la microirraggiamento simultaneo di molte cellule in un determinato FOV, il sistema di imaging avrà bisogno di più tempo per eseguire l'attività. Pertanto, misurare la dinamica delle proteine che reclutano molto rapidamente le lesioni del DNA limita il numero di possibili ROI per la microirraggiamento utilizzate contemporaneamente. Sul sistema di imaging utilizzato per questo protocollo, la microirraggiamento di un singolo ROI lungo 1024 pixel richiede 1032 ms utilizzando un tempo di permanenza di 1000 μs e 3088 ms utilizzando un tempo di permanenza di 3000 μs per essere completato. L'utilizzo di più linee di ROI aumenterà significativamente il tempo necessario per completare la microirraggiamento (ad esempio, il ROI lungo 7 x 1024 pixel richiede 14402 ms utilizzando il tempo di permanenza di 1000 μs e 21598 ms utilizzando il tempo di permanenza di 3000 μs). Questo tempo è perso dall'acquisizione di immagini e deve essere preso in considerazione. Quando si visualizzano eventi di reclutamento rapido, utilizzare il ROI più breve possibile e micro-irradiare solo una cella alla volta.
Vantaggi e limitazioni rispetto ai metodi di sincronizzazione Per gli studi specifici del ciclo cellulare, i metodi esistenti prevedono la sincronizzazione delle cellule in specifiche fasi del ciclo cellulare o l'utilizzo di reporter fluorescenti per identificare la specifica fase del ciclo cellulare della cellula. Tuttavia, ognuno di questi metodi fornisce le proprie sfide e limitazioni.
Il sistema FUCCI3 (che si basa su proteine fluorescenti marcate forme troncate di CDT1 e Geminina) è uno strumento particolarmente utile per gli studi sul ciclo cellulare, ma ha dei limiti quando si tratta di differenziare tra le fasi S e G2 del ciclo cellulare. I livelli di Geminina sono già alti dalla fase S media e rimangono alti fino alla fase M, rendendo queste fasi difficili da separare. L'utilizzo del sistema FUCCI significa anche che due canali ottici del microscopio non possono essere utilizzati per l'imaging del POI.
Le linee cellulari non tumorali potrebbero essere sincronizzate in G0 mediante la rimozione dei fattori di crescita trovati nel siero (fame sierica) causando poco o nessun danno al DNA alle cellule. Tuttavia, la maggior parte delle linee cellulari tumorali continuerà parzialmente a progredire attraverso il ciclo cellulare anche senza adeguate quantità di siero nei loro mezzi. Inoltre, le cellule iniziano parzialmente a perdere la sincronizzazione entro la fine di G1, la fase S iniziale. Oltre alla fame di siero, ci sono numerosi metodi chimici per ottenere la sincronizzazione del ciclo cellulare. I blocchi di idrossiurea, afildicolina e timidina sono metodi per fermare la replicazione del DNA per sincronizzare le cellule nella fase S iniziale. Mentre questi metodi sono economici e semplici, introducono lo stress di replicazione che provoca danni al DNA. Questi inibitori della replicazione del DNA hanno dimostrato di indurre la fosforilazione di H2A. X, un noto marcatore di DSB2,29. Il metodo di utilizzo del PCNA marcato come marcatore per le cellule in fase S riduce il potenziale di artefatti causati dalla sincronizzazione chimica e può essere applicato a una vasta gamma di linee cellulari rispetto alla fame sierica.
Conclusione Il danno al DNA è una forza trainante per le malattie genetiche in cui le lesioni mutagene possono portare alla trasformazione maligna delle cellule. Il targeting del meccanismo di sintesi del DNA è una strategia terapeutica fondamentale nel trattamento di malattie iperproliferative come il cancro. Per trattare queste malattie in modo più mirato, abbiamo bisogno di una migliore comprensione delle proteine che riparano le lesioni del DNA. Il protocollo qui descritto aiuta gli studi basati sulla microirraggiamento in fase S riducendo al minimo le sfide presentate dai metodi di sincronizzazione tradizionali per ridurre i possibili artefatti e aumentare la riproducibilità degli esperimenti.

Diversi percorsi di riparazione del DNA si sono evoluti per affrontare i diversi tipi di lesioni del DNA che possono insorgere nelle cellule, che sono tutte altamente regolate sia nello spazio che nel tempo. Uno dei periodi più vulnerabili del ciclo cellulare è la fase S, quando avviene la sintesi del DNA. Mentre la proliferazione è fondamentale per la vita, fornisce anche una grande sfida. Le cellule devono garantire una replica fedele del loro genoma per evitare che le mutazioni vengano trasmesse alle generazioni future. Di conseguenza, la proliferazione fornisce un punto di intervento terapeutico che è stato impiegato per lo sviluppo di approcci terapeutici nel campo dell'oncologia.
Tutte le principali tecniche utilizzate per studiare il reclutamento proteico nelle lesioni del DNA hanno i loro punti di forza e limiti. La microirraggiamento ha una migliore risoluzione spaziale e temporale1 rispetto alla maggior parte dei metodi alternativi come l'imaging immunofluorescente di focolai indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF), la cromatina-immunoprecipitazione (ChIP) o il frazionamento biochimico. Tuttavia, la micro-irradiazione la robustezza delle tecniche di cui sopra che possono campionare un gran numero di cellule contemporaneamente.
Per studiare la riparazione del DNA in fase S, si deve essere in grado di distinguere le cellule della fase S in una popolazione asincrona di coltura cellulare. Esistono molti metodi ben noti per affrontare questo problema, che coinvolgono la sincronizzazione delle cellule o la visualizzazione delle diverse fasi del ciclo cellulare. Tuttavia, entrambi gli approcci introducono sfide significative e possibili artefatti. I metodi di sincronizzazione chimica ampiamente utilizzati per arricchire le cellule nella fase S iniziale (ad esempio, doppio blocco di timidina, aphidicolin e trattamento con idrossiurea) ottengono la sincronizzazione attraverso l'induzione dello stress di replicazione e alla fine del danno al DNA stesso. Ciò limita l'uso di questi metodi per studiare i processi di riparazione del DNA nella fase S2. La sincronizzazione attraverso la fame e il rilascio di siero è applicabile solo a un numero limitato di linee cellulari, in gran parte escluse le linee cellulari tumorali che si basano meno sui fattori di crescita per la progressione del ciclo cellulare rispetto alle linee cellulari non trasformate. Il sistema FUCCI (Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator) è uno strumento particolarmente utile per studiare il ciclo cellulare, ma ha un limite fondamentale quando si differenzia tra le fasi del ciclo cellulare S e G23.
Qui è dimostrato che l'uso di PCNA con tag fluorescenti come marcatore non invasivo per la fase S limita gli svantaggi dei metodi di sincronizzazione chimica del ciclo cellulare, consentendo al contempo una maggiore specificità e flessibilità rispetto al sistema FUCCI. Come singolo marcatore, non solo il PCNA può evidenziare le cellule della fase S in una popolazione asincrona, ma può anche mostrare l'esatta progressione delle cellule all'interno della fase S(cioèfase S iniziale, media o tardiva) 4 . Bassi livelli di espressione di PCNA esogeno e marcato assicurano interferenze minime sia con la progressione del ciclo cellulare che con i processi di riparazione del DNA. È importante sottolineare che il PCNA funge anche da controllo interno per una corretta induzione del danno al DNA in quanto è coinvolto nella riparazione di diverse lesioni del DNA e viene reclutato nei siti di danno al DNA indotti localmente1,4.
Gli esperimenti qui presentati dimostrano come misurare le dinamiche di reclutamento di EXO1b in fase S e come questo è influenzato dal consolidato inibitore PARP, olaparib. L'attività della nucleasi EXO1b è rilevante per una vasta gamma di percorsi di riparazione del DNA, tra cui la riparazione del mismatch (MMR), la riparazione dell'escissione nucleotidica (NER) e la riparazione della rottura a doppio filamento (DSB). Nella fase S, EXO1b svolge un ruolo importante nella ricombinazione omologa (HR) attraverso la formazione di sporgenze di 3' ssDNA durante la resezione del DNA5. EXO1b è stato ulteriormente implicato nella replicazione del DNA con ruoli nell'attivazione del checkpoint per riavviare le forchette del DNA in stallo, nonché nella rimozione del primer e nella maturazione del frammento di Okazaki nel filamento in ritardo durante lo spostamento del filamento nella replicazione5. Il reclutamento di EXO1b in siti di DNA danneggiati è regolato dall'interazione diretta con il poli (ADP-ribosio) (PAR)6,7. A causa delle numerose implicazioni specifiche del ciclo cellulare di EXO1b, è una scelta eccellente per gli studi di reclutamento specifici della fase S che utilizzano PCNA.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434-500G</td><td>Per estinguere la formaldeide</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale di coniglio Anti-EXO1</td><td>Proteintech</td><td>16253-1-AP</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Anti-fosfo-istone H2A. X (Ser139) Anticorpo, clone JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td>anticorpo primario</td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td>BSA per il blocco</td></tr><tr><td>di BrdU (5-Bromo-2'-deossiuridina)</td><td>Merck</td><td>19-160</td><td>agente pre-sensibilizzante</td></tr><tr><td>Citifluor&commercio; Soluzione montante AFR3</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>17973-10</td><td>antidissolvenza contenente soluzione PBS per imaging</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>colorante di acido nucleico</td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td>Terreno di coltura cellulare per cellule HEK293T</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Solvente per il controllo e la dissoluzione dei veicoli</td></tr><tr><td>EGFP-FBXL10</td><td>Addgene</td><td>#126542</td><td>vettore di espressione virale per EGFP-FBXL10</td></tr><tr><td>EXO1b-AcGFP&nbsp; (in pRetroQ)</td>Il <td></td><td>cDNA EXO1b è stato clonato nei siti NheI, BamHI del vettore pRetroQ-AcGFP1-N1.</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Integratore di terreni</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>Terreno privo di rosso fenolo per microscopia</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo di capra IgG (H+L) altamente adsorbito, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td>anticorpo secondario</td></tr><tr><td>HEK293T cellule</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td>Linea cellulare per imballaggio virale</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>Agente tampone per integrare il terreno di imaging su cellule vive</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td> agente <td>pre-sensibilizzante</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A (Modificato) Medium</td><td>Life Technologies</td><td>16600-108</td><td>Terreno di coltura cellulare per cellule U-2 OS</td></tr><tr><td>mCherry-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55117</td><td>costrutto PCNA non virale adatto per il marcatore del ciclo cellulare</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55994</td><td>costrutto PCNA non virale adatto per il marcatore del ciclo cellulare</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA (in pBABE)</td><td>clonazione personalizzata</td><td>na</td><td>Il cDNA mPlum-PCNA è stato clonato da Addgene #55994 nei siti BamHI, SalI di pBABE (puro)</td></tr><tr><td>Nikon A1R-HD25 Testina di scansione confocale e controller</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>sistema di imaging confocale</td></tr><tr><td>Unità laser Nikon LUN4</td><td>Sistema</td><td>di eccitazione</td><td></td></tr><tr><td>Nikon na Unità laser FRAP Nikon LUN-F 50 mW 405 nm</td><td>Unità</td><td>laser Nikon na FRAP Unità laser</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements Confocal Controller</td><td>Software Nikon</td><td>na</td><td>Software di controllo confocale</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>base per microscopio epifluorescente invertito</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-LAPP Sistema di illuminazione modulare</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>sistema di illuminazione</td></tr><tr><td>NTHL1-mCherry (in pRetroQ)</td><td>clonazione personalizzata</td><td>na</td><td>NTHL1 Il cDNA è stato clonato nei siti NheI, SalI del vettore pRetroQ-mCherry-N1.</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Coverglass a camera (4 pozzetti)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382PK</td><td>Camera di coltura cellulare per microscopia su cellule vive</td></tr><tr><td>Olaparib</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1060</td><td>Inibitore di PARP</td></tr><tr><td>Opti-MEM Terreni di sieroplastica ridotti Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Terreno di diluizione per trasfezione transitoria Soluzione</td></tr><tr><td>acquosa di paraformaldeide (32%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-494</td><td>Fissativo</td></tr><tr><td>pBABE (igro)</td><td>Addgene</td><td>#1765</td><td>vettore di espressione retrovirale (per bassi livelli di espressione)</td></tr><tr><td>pBABE (neo)</td><td>Addgene</td><td>#1767</td><td>vettore di espressione retrovirale (per bassi livelli di espressione)</td></tr><tr><td>pBABE (puro)</td><td>Addgene</td><td>#1764</td><td>vettore di espressione retrovirale (per bassi livelli di espressione)</td></tr><tr><td>pBABE (zeo)</td><td>Addgene</td><td>#1766</td> vettore <td>di espressione retrovirale (per bassi livelli di espressione)</td></tr><tr><td>Anticorpo PCNA (PC10)</td><td>Anticorpo primario Santa Cruz</td><td>sc-56</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>Integratore di terreni</td></tr><tr><td>polibrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td>Aumenta l'efficienza dell'infezione virale</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-C1</td><td>Takara</td><td>632506</td><td>vettore di espressione retrovirale</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-N1</td><td>Takara</td><td>632505</td><td>vettore di espressione retrovirale</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-C1</td><td>Takara</td><td>632567</td><td>vettore di espressione retrovirale</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-N1</td><td>Takara</td><td>632568</td><td>vettore di espressione retrovirale</td></tr><tr><td>pUMVC</td><td>Addgene</td><td>#8449</td><td>Vettore di imballaggio virale</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific 11360070</td><td></td><td>Supplemento per terreno di imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>Triton X-100 soluzione acquosa (10%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>Diluire in PBS per tampone di permeabilizzazione cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-EDTA 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>Diluire in PBS per dividere le cellule</td></tr><tr><td>U-2 OS Cells</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; HTB-96</td><td>Linea cellulare ottimale per esperimenti di microscopia</td></tr><tr><td>Kit universale di rilevamento del micoplasma</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td><td>Kit di rilevamento del micoplasma basato su PCR</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Vettore dell'involucro proteico virale</td></tr></tbody></table>

microirraggiamento laser per studiare il reclutamento del dna durante la fase s

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

La riparazione del danno al DNA mantiene l'integrità genetica delle cellule in un ambiente altamente reattivo. Le cellule possono accumulare vari tipi di danni al DNA a causa di fonti sia endogene che esogene come attività metaboliche o radiazioni UV. Senza la riparazione del DNA, il codice genetico della cellula viene compromesso, minando le strutture e le funzioni delle proteine e potenzialmente causando malattie. 
Comprendere le dinamiche spaziotemporali dei diversi percorsi di riparazione del DNA in varie fasi del ciclo cellulare è cruciale nel campo della riparazione del danno al DNA. Le attuali tecniche di microscopia fluorescente forniscono ottimi strumenti per misurare la cinetica di reclutamento di diverse proteine di riparazione dopo l'induzione del danno al DNA. La sintesi del DNA durante la fase S del ciclo cellulare è un punto peculiare nel destino cellulare per quanto riguarda la riparazione del DNA. Fornisce una finestra unica per schermare l'intero genoma alla ricerca di errori. Allo stesso tempo, gli errori di sintesi del DNA rappresentano anche una minaccia per l'integrità del DNA che non si incontra nelle cellule che non si dividono. Pertanto, i processi di riparazione del DNA differiscono significativamente nella fase S rispetto ad altre fasi del ciclo cellulare e tali differenze sono poco comprese. 
Il seguente protocollo descrive la preparazione di linee cellulari e la misurazione della dinamica delle proteine di riparazione del DNA in fase S in siti di danno al DNA indotti localmente, utilizzando un microscopio confocale a scansione laser dotato di una linea laser a 405 nm. Tagged PCNA (con mPlum) è usato come marcatore del ciclo cellulare combinato con una proteina di riparazione di interesse marcata AcGFP (cioè EXO1b) per misurare il reclutamento del danno al DNA in fase S.

Le cellule affrontano ogni tipo di lesione del DNA in un modo specifico che dipende anche dalla fase del ciclo cellulare in cui si trovano. Ad esempio, dopo la microirraggiamento, le rotture a doppio filamento (DSB) verranno elaborate mediante unione finale non omologa (NHEJ) o HR a seconda della fase del ciclo cellulare. Le nucleasi che agiscono più estesamente durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare creano sporgenze di DNA che sono cruciali per una corretta HR. Per promuovere la valutazione delle cellule in fase S, il PCNA è stato impiegato come marcatore del ciclo cellulare a colore singolo. La Figura 1A mostra il profilo di localizzazione di mPlum-PCNA durante la progressione del ciclo cellulare. Il PCNA ha una distribuzione completamente omogenea nel nucleo in fase G1 e G2 (pur essendo per lo più escluso dai nucleoli). Nella fase S, PCNA si localizza in siti di replicazione del DNA, che possono essere visualizzati come punti luminosi nel nucleo. Nelle prime cellule della fase S, le macchie sono relativamente piccole e equamente distribuite in tutto il nucleo della cellula. Progredendo nella fase S media, le macchie diventano sfocate e si localizzano maggiormente verso il perimetro del nucleo e dei nucleoli. Nella fase S tardiva, le macchie si riducono in numero ma diventano sempre più grandi man mano che il PCNA si concentra nei siti di replicazione tardiva (Figura 1B). È importante sottolineare che l'espressione esogena di PCNA dalla spina dorsale del vettore pBABE era inferiore ai livelli endogeni, ma era sufficiente per il rilevamento al microscopio che riduce al minimo i potenziali artefatti nella progressione del ciclo cellulare e nella DDR. La Figura 1C mostra l'estensione della sovraespressione di PCNA rispetto ai livelli endogeni. Si noti che la banda corrispondente a mPlum-PCNA migra più lentamente a causa delle sue dimensioni maggiori.
Abbiamo mirato a introdurre DSB durante la microirraggiamento per studiare il reclutamento PARP1/2-dipendente di EXO1b a queste lesioni in fase S. La Figura 2A mostra che basse dosi di energia (1000 μs di tempo di permanenza) non inducono il reclutamento di EGFP-FBXL10, un responder DSB (componente del complesso FRUCC 8),mentre è stato sufficiente indurre il reclutamento di NTHL1-mCherry, una proteina pathway di riparazione dell'escissione di base (BER), reclutando in siti di danno ossidativo al DNA10,11,12. A 3000 μs di tempo di permanenza, sia EGFP-FBXL10 che NTHL1-mCherry reclutano, dimostrando un'uscita laser che genera sia lesioni ossidative che DSB. Rafforzando questi risultati, la Figura 2B mostra la colorazione di immunofluorescenza contro γH2A.X (marcatore DSB), che è chiaramente più evidente quando si utilizzano dosi di energia più elevate. PcNA funge sia da marcatore del ciclo cellulare che da marcatore per il successo della microirraggiamento, in quanto recluta adeguatamente con entrambe le impostazioni del tempo di permanenza laser. È importante sottolineare che sia il PCNA esogeno che/o endogeno con tag proteico fluorescente può essere utilizzato per questa funzione reporter in quanto si comportano in modo simile (Figura 3). Il PCNA etichettato in modo endogeno è stato progettato inserendo mRuby nel telaio con il primo esone in un allele del locusPCNA 13 (la linea cellulare era un dono gentile di Jörg Mansfeld).
La Figura 4A e la Figura 4C mostrano il reclutamento di EXO1b con tag AcGFP nelle celle della fase S. EXO1b raggiunge il massimo livello di accumulo nei siti di microirraggiamento intorno a 1 minuto e poi inizia lentamente a disimpegnarsi dalle lesioni del DNA in seguito. Gli arricchimenti nei siti di microirraggiamento sono indicati da un'unità di fluorescenza relativa &gt; 1 sul grafico. In presenza di olaparib, l'accumulo di EXO1b sulla striscia laser a 1 minuto è significativamente inferiore rispetto al controllo del veicolo. Questi risultati sono in accordo con la letteratura6,7. La figura 4B illustra le regioni rappresentative per la quantificazione (aree A, B e C) come descritto al punto 6 del protocollo. La Figura 4D mostra i livelli di espressione comparabili di EXO1b endogeno e EXO1b-AcGFP esogeno nelle cellule utilizzate per la microirraggiamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig01.jpg"> Figura 1: Modello di localizzazione di PCNA. (A) Le immagini mostrano il modello di localizzazione di PCNA esogeno stabilmente integrato durante tutto il ciclo cellulare in cellule U-2 OS. (B) Le immagini mostrano modelli di focolai PCNA in diverse fasi della fase S (iniziale, media e tardiva) nelle cellule OS U-2. (C) Western blot che mostra livelli endogeni ed esogeni di PCNA nelle cellule U-2 OS utilizzate per l'imaging. La barra della scala rappresenta 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig02.jpg"> Figura 2: Induzione di DSB attraverso l'uscita di potenza laser ottimizzata. (A) Le impostazioni laser possono essere ottimizzate per indurre diverse forme di danno al DNA. Le cellule U-2 OS che esprimono stabilmente sia EGFP-FBXL10 che NTHL1-mCherry sono state utilizzate per identificare rispettivamente DSB e siti di lesioni ossidative. La microirraggiamento con una linea laser a 405 nm è stata effettuata su celle asincrone U-2 OS con tempo di permanenza di 1000 μs o 3000 μs. La barra di scala rappresenta 20 μm. (B) La colorazione immunofluorescente contro γH2A.X è stata eseguita su cellule epiteliali pigmentate retiniche umane (hTERT RPE-1) con PCNA endogeno marcato con mRuby. Le cellule sono state fissate ed elaborate 5 minuti dopo la microirraggiamento con un tempo di permanenza di 1000 μs o 3000 μs. La barra della scala rappresenta 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig03.jpg"> Figura 3: Reclutamento comparabile di mRuby-PCNA endogeno e mPlum-PCNA esogeno in siti di microirraggiamento a 1000 μs o 3000 μs di tempo di permanenza laser. Sia il PCNA endogeno che l'esogeno marcata formano focolai di replicazione durante la fase S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig04.jpg"> Figura 4: Reclutamento PARP1/2-dipendente di EXO1b in fase S. Le cellule U-2 OS che esprimono stabilmente EXO1b-AcGFP e mPlum-PCNA sono state micro-irradiate con una linea laser FRAP a 405 nm utilizzando un tempo di permanenza di 3000 μs. (A) Immagini rappresentative di cellule microirraggiate nei punti temporali indicati dopo il pretrattamento con controllo del veicolo (DMSO) o olaparib (1 μM). La barra di scala rappresenta 20 μm. (B) Immagini rappresentative di regioni definite di aree A, B e C per l'analisi del reclutamento. La barra della scala rappresenta 20 μm. (C) La dinamica di reclutamento del danno al DNA è stata catturata dall'imaging di cellule vive. I valori medi di fluorescenza relativa e le immagini sono stati acquisiti ogni 5 s per 12 min. Per ogni condizione, sono state valutate ≥30 cellule. I valori medi di fluorescenza relativa (linee nere solide) e l'errore standard (intervallo visualizzato da un'area ombreggiata) sono stati tracciati rispetto al tempo. La linea tratteggiata mostra i valori di reclutamento a 1 minuto dopo la microirraggiamento. La differenza tra il trattamento con DMSO (n=32) e olaparib (n=31) è stata calcolata utilizzando un test di Mann-Whitney. Asterix indica p&lt;0.0001. (D) Western blot confronta i livelli di espressione di EXO1b endogeno e EXO1b-AcGFP esogeno in cellule utilizzate per la microirraggiamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un metodo non invasivo per identificare in modo efficiente le cellule in fase S per studi di microscopia a valle, come la misurazione del reclutamento di proteine di riparazione del DNA mediante microirraggiamento laser.

Microirraggiamento laser per studiare il reclutamento del DNA durante la fase S

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

Questo protocollo aiuta a comprendere il reclutamento spaziale e temporale delle proteine di riparazione del danno al DNA, prendendo in considerazione la fase del ciclo cellulare. Per la discriminazione del ciclo cellulare, utilizziamo pcNA con tag proteina fluorescente come marcatore della fase S, che aggira gli artefatti introdotti da altri metodi di sincronizzazione del ciclo cellulare. Questo, combinato con la microirraggiamento basato su laser, offre una risoluzione spaziotemporale senza precedenti alla cinetica delle proteine di riparazione del danno al DNA.Il successo nell'utilizzo di routine del nostro protocollo si basa sulla conoscenza di base dell'imaging confocale. 24 ore prima della microirraggiamento, piastra un totale di otto per 10 alle quarte celle in 500 microlitri a un millilitro di mezzo su un vetro di copertura a quattro pozzetti. Un'ora prima della microirraggiamento, scambiare il mezzo di crescita regolare con un mezzo di imaging contenente olaparib o un controllo del veicolo come DMSO.Almeno quattro ore prima dell'imaging, accendere la camera ambientale e i componenti del microscopio. Accendere il riscaldamento, l'alimentazione di anidride carbonica e il regolatore di umidità. Inizializzare le sorgenti luminose insieme alle linee laser almeno un'ora prima di trasferire le cellule al microscopio.Oliare l'obiettivo del microscopio e posizionare un vetro di copertura camerato sotto il microscopio. Per selezionare le cellule della fase S in una popolazione asincrona, esaminare attraverso l'oculare il modello di localizzazione univoco del PCNA mPlum taggato in fase S e selezionare un campo visivo che abbia abbastanza celle di fase S per la micro-irradiazione. Impostare la regione di interesse per la microirraggiamento utilizzando il software associato per inserire linee binarie.Per impostare il numero desiderato di linee e spaziatura, fare clic su binario, quindi selezionare Inserisci linea, cerchio ed ellisse per disegnare il numero desiderato di linee, quindi convertire queste linee binarie in ROI di stimolazione facendo clic su ROI, spostare binario in ROI, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse su uno qualsiasi dei ROI e selezionare Usa come stimolazione ROI S1. Posiziona queste linee nel campo visivo in modo che passino attraverso il nucleo delle cellule. Prima della microirraggiamento, per identificare i focolai PCNA per un'analisi successiva, scatta un'immagine a risoluzione più elevata del campo visivo impostando i parametri necessari nella GUI compatta LFOV A1 e nelle finestre dell'area di scansione LFOV A1, quindi premendo il pulsante di acquisizione. Per impostare la microirraggiamento, aprire la scheda di stimolazione ND, quindi accedere alla finestra temporale per acquisire una serie di immagini di pre-stimolazione e quindi una serie di immagini post-stimolazione utilizzando gli scanner Galvano.Impostare tre fasi nella finestra di pianificazione temporale. Nella colonna acquisizione e stimolazione, selezionare l'acquisizione, la stimolazione e l'acquisizione rispettivamente per le tre fasi. Per la fase di stimolazione, impostare S1 come ROI.Nella finestra Galvano XY, impostare la potenza di uscita laser al 100% per la linea laser a 405 nanometri e impostare il tempo di permanenza per la microirraggiamento. Per impostare l'imaging timelapse per la finestra temporale e gli intervalli desiderati, utilizzare la GUI compatta A1 LFOV e le finestre dell'area di scansione A1 LFOV. Ottimizza la percentuale di potenza del laser, il guadagno e le impostazioni di offset per ridurre lo sbiancamento delle foto durante l'imaging nella finestra GUI compatta A1 LFOV.A seconda della cinetica della proteina, estendere o abbreviare l'intervallo tra le immagini o la durata del timelapse totale impostando l'intervallo e la durata desiderati per la riga di acquisizione della terza fase nella finestra del programma temporale. Premere run now per eseguire la microirraggiatura e il successivo timelapse imaging. Al termine dell'imaging timelapse, salvare i ROI di stimolazione come immagini separate, che saranno utili per identificare le coordinate di microirraggiamento in qualsiasi software a valle utilizzato per l'analisi.Il PCNA ha una distribuzione completamente omogenea nel nucleo nelle fasi G1 e G2. Nella fase S, PCNA si localizza in siti di replicazione del DNA, che possono essere visualizzati come punti luminosi nel nucleo. Nelle prime cellule della fase S, le macchie sono relativamente piccole e equamente distribuite in tutto il nucleo della cellula.Mentre progrediscono nella fase S media, le macchie diventano sfocate e si localizzano maggiormente verso il perimetro del nucleo e dei nucleoli. Nella fase S tardiva, le macchie si riducono di numero, ma diventano sempre più grandi man mano che il PCNA si concentra nei siti di replica tardiva. Basse dosi di energia, come 1.000 microsecondi di tempo di permanenza, non inducono il reclutamento di EGFP-FBXL10, un responder di rottura a doppio filamento, ma sono sufficienti per indurre il reclutamento di NTHL1-mCherry, una proteina del percorso di riparazione dell'escissione di base che viene reclutata nei siti di danno ossidativo al DNA.A 3.000 microsecondi di tempo di permanenza, vengono reclutati sia EGFP-FBXL10 che NTHL1-mCherry, dimostrando un'uscita laser che genera sia lesioni ossidative che rotture a doppio filamento. EXO1b raggiunge un livello massimo di accumulo e siti di micro-irradiazione circa un minuto, per poi iniziare lentamente a disimpegnarsi dalle lesioni del DNA. In presenza di olaparib, l'accumulo di EXO1b sulla striscia laser in un minuto è significativamente inferiore rispetto al controllo del veicolo.È fondamentale che al microscopio venga dato ampio tempo per riscaldarsi e che la cultura e le condizioni siano ottimali per ogni esperimento per garantire risultati coerenti. Inoltre, è importante ottimizzare le impostazioni laser con diversi reporter di danni al DNA per testare specifiche lesioni del DNA. Dopo la microirraggiamento, considerare la convalida dei risultati con metodi biochimici classici, come il frazionamento, l'immunoprecipitazione o la ChIP.Questi approcci campionano una popolazione cellulare più ampia, fornendo così forza statistica.

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I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.

Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Fluorescenza confocale microscopia e laser micro-irradiazione offrire strumenti per indurre il danno del DNA e monitoraggio della risposta delle proteine di riparazione del DNA in determinate aree sub-nucleare. Questa tecnica ha avanzato significativamente la nostra conoscenza di rilevamento dei danni, di segnalazione e di reclutamento. Questo manoscritto viene illustrato queste tecnologie per esaminare riparazione singola e doppia uscita.

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Studiare la cinetica di riparazione danni del DNA richiede un sistema di indurre lesioni alle regioni definite sub-nucleare. Descriviamo un metodo per creare interruzioni di double-stranded localizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, dotato di un laser di 405 nm e forniscono procedure automatizzate per quantificare la dinamica di fattori di riparazione a queste lesioni.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

Test di sensibilità visiva in lucertole utilizzando un paradigma di condizionamento operante che si avvale di riproduzione video di casuale-puntino kinematograms e generati dal computer invertebrati.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

GFP-fusion proteine ​​sono ampiamente utilizzati per visualizzare organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, lo screening per le mutazioni che influenzano la morfologia degli organelli generalmente richiede mutagenesi individuale e richiede molto tempo. Qui, dimostriamo un metodo per integrare simultaneamente organello-GFP marcatori in quasi 5.000 non essenziali geni nel lievito.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

Un protocollo dettagliato è descritto per l'imaging in tempo reale la formazione di complessi di riparazione del DNA...

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis</em

Danno renale acuto (AKI) negli esseri umani è un problema comune clinico causato da un danno alle cellule epiteliali che costituiscono nefroni renali e AKI è associata ad elevati tassi di mortalità del 50-70% 1. A seguito di distruzione delle cellule epiteliali, nefroni hanno una limitata capacità di rigenerarsi, anche se i meccanismi e le limitazioni che guidano questo fenomeno sono ancora poco compresi. In questo articolo video, descriviamo la nostra tecnica di ablazione laser mirato delle...

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Qui si descrive la strumentazione e metodi per la rilevazione di molecole proteiche singolo fluorescenza marcata che interagiscono con una singola molecola di DNA sospeso tra due microsfere otticamente intrappolati.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

Scopri la microirraggiamento laser per analizzare il reclutamento delle proteine di riparazione del DNA durante la fase S utilizzando PCNA fluorescente e microscopia confocale. Questo metodo consente di osservare la cinetica di riparazione in tempo reale nelle cellule viventi.

Microirraggiamento laser per studiare il reclutamento del DNA durante la fase S

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