Un test di neutralizzazione rapido e multiplex Dual Reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 per un sistema di analisi del flusso basato su perle multiplexate
6 aprile 2021
Un sistema di analisi di flusso per saggi multiplexati basati su perle che fornisce una lettura a due reporter è stato utilizzato per lo sviluppo di saggi sierologici multiplex e di neutralizzazione degli anticorpi in grado di misurare contemporaneamente gli anticorpi IgG e IgM neutralizzanti per SARS-CoV-2.
Per quanto ne s knowledge, questo è il primo esempio di un protocollo multiplexing basato su perle che utilizza due segnali reporter per misurare contemporaneamente due risultati per analita. Questa tecnica consente all'utente di misurare IgM e IgG antigene-specifiche allo stesso tempo, con meno campione e un tempo più breve per i risultati. Mentre questo metodo dual reporter è specifico per l'isotipizzazione degli anticorpi, potrebbe essere adattato per misurare altre coppie di analiti, come modifiche post-traduzionali o forme di farmaci liberi rispetto a quelli legati.
A dimostrare la nostra procedura oggi abbiamo il Dr.Steve Angeloni, uno scienziato senior delle applicazioni sul campo per Luminex Corporation. Per iniziare il test sierologico IgG e IgM a doppio reporter, preparare le miscele di perle multiplex richieste dalle singole perle di coppia e controllare le scorte di perle ad una concentrazione di una volta 10 alle sei perle per millilitro. Quindi, diluire i campioni di siero di 100 volte aggiungendo 10 microlitri di siero a 990 microlitri di tampone PBS-TBN, quindi diluire i campioni di altre dieci volte aggiungendo 20 microlitri della diluizione 1:100 a 180 microlitri di PBS-TBN.
Quando le miscele di perle e i campioni di siero sono pronti, aggiungere 50 microlitri delle miscele di perle multiplex ai pozzetti assegnati di una piastra microtiter non legante a 96 pozzetti, quindi aggiungere 50 microlitri dei campioni di siero diluito ai pozzetti appropriati. Una volta aggiunti tutti i campioni, coprire la piastra con un sigillo di lamina micropiastra e incubare su uno shaker a piastra riscaldata a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, separare le perle dalla miscela di reazione posizionando la piastra su un separatore di piastre magnetiche per due minuti.
Mantenendo la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo della lamina. Quindi capovolgere con cura la piastra su un contenitore per i rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti. Mentre si tiene ancora la piastra sul magnete, asciugare la piastra su carta assorbente.
Per lavare i pozzi di reazione, rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 microlitri di PBS-TBN a ciascun pozzo. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e incubare sullo shaker riscaldato per due minuti prima di rimetterlo sul magnete della piastra per altri due minuti. Mantenendo la piastra sul magnete, invertire la piastra per scartare il surnatante e tamponare la piastra su carta assorbente.
Dopo il secondo lavaggio PBS-TBN, rimuovere la piastra dal magnete e aggiungere 100 microlitri di miscela fresca di reagente di rilevamento a ciascun pozzo. Dopo aver coperto la piastra con un sigillo di lamina micropiastra, posizionarla su uno shaker a piastra riscaldata per 15 minuti, quindi su un separatore di piastre magnetiche per due minuti. Mentre la piastra è sul magnete, scartare la miscela di reagenti di rilevamento invertendo la piastra su un contenitore di rifiuti e tamponandola su carta assorbente.
Lavare i pozzi di reazione con PBS-TBN due volte come precedentemente dimostrato, quindi rimuovere la piastra dal magnete. Aggiungere 100 microlitri di PBS-TBN a ciascun pozzo, quindi coprire la piastra con guarnizione di alluminio e agitare per due minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere il sigillo della lamina e procedere alla lettura di 50 microlitri del campione da ciascun pozzo nell'analizzatore di flusso.
Per leggere la piastra, selezionare il menu a discesa nell'angolo in alto a sinistra, passare a Configurazione piastra, caricare la piastra configurata in precedenza e selezionare Esegui piastra. Espellere il portapiasle selezionando l'icona Espelli, quindi caricare la piastra sul supporto piastre e selezionare l'icona Retract per ritrarre il portapiatti. Una volta che il supporto della piastra si è protratto nell'analizzatore, selezionare l'icona Esegui per iniziare a leggere la piastra.
Per il test di neutralizzazione a doppio reporter, aggiungere 50 microlitri delle miscele di perle multiplex ai pozzetti assegnati di una piastra microtitolatore non vincolante a 96 pozzetti, quindi aggiungere 25 microlitri di due microgrammi per millilitro ACE2 a ciascun pozzetto e coprire la piastra con un sigillo di lamina. Dopo un'incubazione di due minuti su uno shaker a piastre riscaldate, aggiungere 25 microlitri di diluizioni sieriche 1:500 ai pozzetti assegnati. Una volta aggiunti tutti i campioni, eseguire le fasi di incubazione, lavaggio, rilevamento e analisi come precedentemente dimostrato per il test sierologico.
Un test di anti-IgM coniugato al colorante reporter DyLight 405 utilizzando campioni di siero entro cinque-60 giorni dall'insorgenza dei sintomi e un campione di siero a striscia IgG non ha prodotto un segnale elevato per l'antigene spike. Per i campioni con un'elevata intensità di fluorescenza media IgM, sono stati osservati i segnali più alti per il dominio di legame del recettore e gli antigeni nucleocapsidi. Mentre il titolo IgM avrebbe dovuto essere elevato in alcuni campioni, i livelli di intensità di fluorescenza media osservati non superavano le 140 unità MFI.
Inoltre, il perle di controllo per IgM mancava di un intervallo dinamico significativo per l'intensità mediana di fluorescenza quando si utilizzaVa DyLight 405 coniugato ad anti-IgM rispetto a un anti-IgM etichettato con ficoeritrina alla stessa concentrazione. Per il rilevamento di IgG, il coniugato viola brillante aveva segnali di intensità di fluorescenza mediana più elevati rispetto al coniugato di streptavicina del fluorforo Super Bright 436. Tuttavia, l'intensità del segnale per il coniugato viola brillante variava tra le titolazioni ACE2.
Questa fluttuazione del segnale da parte del coniugato viola brillante attraverso le concentrazioni di ACE2 ha anche interferito nel determinare l'inibizione percentuale da parte di ACE2 attraverso la gamma di titoli IgG. Per il rilevamento di IgM, l'anti-IgM di ficoeritrina ha mostrato segnali più elevati di quelli generati da DyLight 549 IgM anti-umano. Durante la determinazione dell'inibizione ACE2% del legame IgM, c'era una leggera ma insignificante differenza tra i due reagenti di rilevamento IgM.
Quindi uno dei passaggi più importanti della procedura è preparare il mix di perle multiplex dalle singole scorte di perle e assicurarsi di farlo correttamente. Quindi questa procedura può essere utilizzata anche per misurare l'efficacia dei vaccini e monitorare le risposte immunitarie ad altri agenti patogeni.
Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo protocollo di moltiplexaggio basato su perline che consente la misurazione simultanea di anticorpi IgM e IgG contro SARS-CoV-2. Il metodo riduce il volume del campione e il tempo necessario per ottenere i risultati, fornendo una lettura con doppio reporter per aumentare la specificità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Saggi sierologici
- Rilevamento degli anticorpi
Sfondo
- Gli attuali saggi sierologici spesso misurano un solo tipo di anticorpo alla volta.
- Il multiplexing può aumentare l'efficienza e la ricchezza dei dati.
- I saggi basati su microsfere consentono un'analisi ad alto rendimento.
- Comprendere le risposte IgM e IgG è fondamentale per la valutazione dell'efficacia vaccinale.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio multiplex per la rilevazione simultanea di anticorpi IgM e IgG.
- Migliorare la velocità e l'efficienza dei test sierologici.
- Fornire un metodo adattabile ad altri analiti.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di miscele di perline multiplex da stock individuali di perline.
- Diluzione dei campioni di siero e incubazione con le miscele di perline.
- Utilizzo di un analizzatore a flusso per la lettura dei risultati.
- Implementazione di un sistema reporter doppio per un rilevamento potenziato.
Risultati principali
- Il metodo con doppio reporter ha misurato con successo i livelli sia di IgM che di IgG.
- L'intensità del segnale è variata in funzione dei diversi reagenti di rilevamento.
- Sono stati osservati segnali elevati di IgM per antigeni specifici.
- Il metodo ha mostrato potenzialità per il monitoraggio delle risposte immunitarie ai vaccini.
Conclusioni
- Questo saggio multiplo rappresenta un notevole progresso nei test sierologici.
- Può essere adattato per diverse applicazioni oltre al rilevamento di anticorpi.
- Una corretta preparazione delle miscele di perline è fondamentale per il successo del saggio.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo saggio multiplo basato su microsfere consente il rilevamento simultaneo di anticorpi IgM e IgG contro antigeni di SARS-CoV-2, riducendo il volume del campione e accelerando i tempi di ottenimento dei risultati. La progettazione con doppio marcatore supporta lo screening sierologico ad alto rendimento per il monitoraggio dell'efficacia vaccinale e la caratterizzazione della risposta immunitaria. Fornendo dati quantitativi e specifici per isotipo su più antigeni, il metodo aumenta l'affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta e nelle decisioni di carattere traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando le risposte IgM e IgG specifiche per l'antigene spike, il dominio legante il recettore (RBD) e l'antigene della nucleocapside.
- Valore operativo: Riduce il consumo di campioni mediante rilevamento multiplex, preservando campioni preclinici limitati.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico correlando precoci profili IgM/IgG con l'attivazione immunitaria specifica per antigene.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative standardizzate di fluorescenza per tre antigeni di SARS-CoV-2 in un singolo pozzetto.
- Valore operativo: Compatibile con l'infrastruttura esistente di analisi a flusso Luminex, consentendo il riutilizzo della piattaforma e la standardizzazione del saggio.
- Scalabilità: Permette lo screening ad alto rendimento di candidati vaccini o di anticorpi terapeutici utilizzando volumi minimi di siero.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega il profilo immunitario nella fase di scoperta con la valutazione preclinica dei vaccini mediante il monitoraggio longitudinale di IgM e IgG.
- Allineamento dei biomarcatori: Permette il monitoraggio delle risposte anticorpali funzionali attraverso un formato di neutralizzazione basato sull'ACE2 per gli antigeni S e RBD.
- Avanzamento aggiustato per il rischio: Supporta decisioni di proseguimento o interruzione identificando precocemente modelli solidi di sieroconversione multi-antigenica durante lo sviluppo.
Integrazione della Pipeline e del Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo un profilo immunitario precoce che orienta la selezione del composto promettente e la priorità dei candidati vaccinali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi relative alle risposte umorali specifiche per antigene e la chiarificazione dei percorsi mediante la risoluzione multiplex degli isotipi.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili, adatti alla standardizzazione dei saggi nei programmi di sorveglianza sierologica.
- Analisi: Fornisce misurazioni dell'intensità mediana di fluorescenza (MFI) e dati di percentuale di inibizione che consentono analisi comparative tra diverse condizioni e punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Collega il rilevamento precoce dei marcatori immunitari alla valutazione dell'efficacia preclinica attraverso un formato in grado di rilevare la neutralizzazione.
- Riutilizzo aziendale: Il sistema adattabile con doppio reporter può essere riorganizzato per altre coppie di analiti, come modifiche post-traduzionali o formati di farmaci, massimizzando l'utilità della piattaforma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nel profilo immunitario umorale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione attraverso protocolli standardizzati di preparazione delle perline e di lavaggio.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale mediante la moltiplicazione di tre antigeni e due isotipi per pozzetto, riducendo il costo per campione.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati vaccinali aggiustata per il rischio, basata su dati precoci di sieroconversione IgM/IgG multi-antigenici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione di saggi basati su microsfere e nelle tecniche di separazione magnetica.
- È dipendente da strumentazione analitica a flusso in grado di rilevare fluorescenza multiplex.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione delle miscele di microsfere e i protocolli di diluizione.
- L'adattamento ad altri sistemi modello potrebbe richiedere la validazione dell'efficacia dei reagenti di rilevamento su diversi antigeni bersaglio.
- I limiti pratici includono la variabilità del segnale con alcuni fluorofori (ad esempio, coniugati brilliant violet) a diverse concentrazioni dell'analita, il che potrebbe influire sulla coerenza della lettura della neutralizzazione.
