Rilevazione dell'anticorpo sars-CoV-2 Receptor-Binding Domain utilizzando un bioreporter basato su HiBiT

Il mio laboratorio ha lavorato nella ricerca COVID-19 e abbiamo recentemente sviluppato un nuovo test che ci ha permesso di rilevare rapidamente e con precisione gli anticorpi SARS-CoV-2. Questo protocollo delinea un test ad alto rendimento per rilevare gli anticorpi anti-SARS-CoV-2 nei campioni di siero dei pazienti, che è fondamentale data l'attuale pandemia. La maggior parte degli attuali saggi sierologici sacrifica la velocità per la sensibilità o viceversa.

I nostri dati mostrano che il nostro test è sensibile e ha un tempo di risposta rapido. Al fine di produrre una quantità sufficiente di bioreporter HiBiT-RBD elevato, iniziare preparandosi per la coltura cellulare. Per prima cosa, prepara il mezzo dell'aquila modificato completo di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina e streptomicina.

Quindi riscaldare il supporto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Accendere l'armadio di sicurezza biologica e utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare la superficie dell'armadio. Per coltivare la linea cellulare, estrarla da meno 80 gradi Celsius o azoto liquido e scongelarla in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.

Mescolare le cellule scongelate con almeno 10 millilitri di mezzo completo. Pipettare la sospensione cellulare in una capsula di Petri di 15 centimetri e ruotare la piastra per distribuire uniformemente le cellule. Posizionare il piatto in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 85-95% di umidità.

Osservare le cellule al microscopio fino a quando il livello di confluenza raggiunge l'80-90% ad alta confluenza, rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS caldo e aggiungere da tre a cinque millilitri di 0,25% tripsina-EDTA per staccare le cellule dalla superficie. Dopo circa cinque minuti, guarda le cellule al microscopio. Se tutte le cellule sono galleggianti, aggiungere almeno quattro millilitri di mezzo e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo sterile.

Contare le cellule usando un emocitometro e aggiungere un milione di cellule in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti per la trasfezione. Per eseguire la trasfezione del plasmide HiBiT-RBD, utilizzare un microgrammo del plasmide di espressione HiBiT-RBD con un reagente di trasfezione adatto. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere il volume totale a ciascun pozzetto della piastra a goccia.

Il giorno successivo, sostituire il mezzo contenente la miscela di trasfezione con il mezzo completo. Osservare bene il controllo della trasfezione 48 ore dopo la trasfezione. Raccogliere il surnatante in microtubi da 1,5 millilitri.

Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi passiva 1X o PLB alle cellule, quindi incubare e scuotere la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente per la lisi cellulare. Successivamente, per valutare il segnale di luminescenza dal bioreporter utilizzando un test di luciferasi, preparare prima i componenti della reazione e utilizzare il surnatante come fonte del bioreporter. Diluire il Grande BiT e il substrato a 1X prima dell'uso.

Trasferire 50 microlitri del surnatante da ciascun pozzo o tubo a una piastra da 96 pozzetti e aggiungere 50 microlitri di BiT 1X grande a ciascun pozzo. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Aprire il software del luminometro, aggiungere 50 microlitri di substrato 1X a ciascun pozzetto, posizionare la piastra nel luminometro ed eseguire il software.

Per eseguire il test di rilevamento degli anticorpi HiBiT-RBD, preparare il bioreporter HiBiT-RBD come descritto in precedenza e combinare 50 microlitri del surnatante contenente HiBiT-RBD con un microgrammo dell'anticorpo commerciale SARS-CoV-2 RBD in un microtubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 20 microlitri di proteina legante le immunoglobuline o proteina G alla soluzione. Porta il volume totale a 300 microlitri aggiungendo PBS.

Incubare i tubi su uno shaker o rotatore per 30 minuti. Centrifugare a 12.000 G per 30 secondi. Quindi scartare il surnatante e lavare con PBS.

Ripetere il processo tre volte per rimuovere HiBiT-RBD libero. Risospesciare le celle in 50 microlitri di PBS e trasferirle in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 50 microlitri di BiT 1X grande e attendere cinque minuti.

Quindi aggiungere 50 microlitri di substrato 1X NanoLuc. Leggere immediatamente il segnale di luminescenza con un luminometro. Preparare grandi quantità del bioreporter HiBiT-RBD per un test ad alto rendimento e combinare 20 microlitri di proteina magnetica G con 50 microlitri del surnatante HiBiT-RBD in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per ciascun campione.

Aggiungere 10 microlitri del campione di siero a ciascun pozzetto e portare il volume totale a 150 microlitri aggiungendo PBS. Incubare per 30 minuti su uno shaker a temperatura ambiente. Quindi posizionare la piastra su una rondella magnetica per precipitare il complesso di anticorpi della proteina G.

Scartare la soluzione nella sezione centrale di ciascun pozzetto e aggiungere PBS per il lavaggio. Ripetere la fase di lavaggio almeno tre volte per rimuovere l'eccesso di HiBiT-RBD. Aggiungere 50 microlitri di 1X PBS e 50 microlitri di 1X BiT di grandi dimensioni e incubare per almeno cinque minuti a temperatura ambiente.

Preparare il software del luminometro. Quindi aggiungere 50 microlitri di substrato 1X. Posizionare la piastra nella macchina, eseguire il software e registrare i segnali.

Confronta i segnali provenienti da campioni di siero, campioni di controllo e segnali di fondo da pozzi vuoti. I segnali provenienti sia dal lisato cellulare contenente HiBiT-RBD che dal surnatante delle cellule trasfettate sono stati registrati per valutare la fonte proteica appropriata. I dati hanno mostrato uno sfondo basso rispetto a un segnale forte quando entrambe le parti sono state combinate.

L'aggiunta di proteina G aiuta la precipitazione degli anticorpi. Il test è stato utilizzato per confrontare il segnale di un anticorpo neutralizzante commerciale SARS-CoV-2 con un IgG di controllo. Il segnale anticorpale specifico era robusto, mentre l'anticorpo di controllo aveva un livello di fondo vicino al livello di fondo luminescente.

Il virus della stomatite vescicolare oncolitica attenuata ricombinante o VSV con una mutazione in posizione 51 della proteina M che esprime RBD esogena è stato utilizzato per vaccinare i topi. Il siero raccolto da topi vaccinati ha prodotto un segnale robusto rispetto a nessun segnale nei topi iniettati con VSV di controllo. Questo protocollo può essere utilizzato per il rilevamento degli anticorpi SARS-CoV-2 nei campioni di siero dei pazienti.

Le fasi di lavaggio successive all'incubazione con la proteina G sono fondamentali per ridurre lo sfondo. Inoltre, è importante aggiungere il substrato il più rapidamente possibile per evitare la perdita di segnale. Con alcune fasi di ottimizzazione aggiuntive, lo stesso test può essere utilizzato per analizzare campioni di sangue e potrebbe essere un metodo efficace per determinare gli anticorpi anti-SARS-CoV-2 nei campioni di sangue dei pazienti.