Name: Rilevazione dellanticorpo sars-CoV-2 Receptor-Binding Domain utilizzando un bioreporter basato su HiBiT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Scopri un saggio ad alto rendimento per la rilevazione rapida e sensibile degli anticorpi SARS-CoV-2 nel siero dei pazienti utilizzando un bioreporter HiBiT-RBD. Questo metodo combina velocità e sensibilità per il testing sierologico.

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Apprezziamo e ringraziamo l'assistenza tecnica di Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin e Christiano Tanese De Souza. Ringraziamo anche Mina Ghahremani per il Graphic Design. Vorremmo anche ringraziare tutte le persone che hanno partecipato e donato i loro campioni di sangue per questo studio. DWC è supportato in parte dalla Facoltà di uOttawa e dal Dipartimento di Medicina.

NOTA: Il protocollo descritto di seguito aderisce a tutte le linee guida etiche secondo il codice di protocollo 20200371-01H.
1. Produzione e valutazione del bioreporter HiBiT-RBD
<ol><li>Produrre una quantità sufficiente di bioreporter HiBiT-RBD<ol>
<li>Prepararsi per la coltura cellulare<ol>
<li>Preparare il mezzo Eagle modificato (DMEM) completo di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina/streptomicina. Quindi, riscaldare il supporto a bagnomaria a 37 °C.</li>
			<li>Accendere l'armadio di sicurezza biologica (BSC) e utilizzare il 70% di etanolo v/v per sterilizzare la superficie dell'armadio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coltivare la linea cellulare.<ol>
<li>Estrarre la linea cellulare da -80 °C o azoto liquido e scongelarla a bagnomaria a 37 °C. NOTA: Una linea cellulare appropriata è facile da mantenere in coltura, ha un'elevata efficienza di trasfezione ed è adatta per la produzione di proteine esogene. Rene embrionale umano, cellule HEK293 sono state utilizzate per questo protocollo.</li>
			<li>Mescolare le cellule scongelate con almeno 10 ml di mezzo completo, pipettare la sospensione cellulare su una capsula di Petri di 10 cm e ruotare la piastra per distribuire uniformemente le cellule nel piatto. Posizionare il piatto in un incubatore di colture cellulari a 37 °C, 5% di CO2 e 85-95% di umidità.</li>
			<li>Osservare le cellule al microscopio fino a quando il livello di confluenza raggiunge l'80-90%. Ad alta confluenza, rimuovere il mezzo, lavare le cellule con soluzione salina calda tamponata con fosfato (PBS) e aggiungere 1 ml di acido tetraacetico tripsina-etilendiammina allo 0,25% per staccare le cellule dalla superficie. NOTA: Le celle HEK293 si staccano abbastanza facilmente. Quindi, la fase di lavaggio dovrebbe essere eseguita molto delicatamente per evitare il distacco accidentale e la perdita di cellule.</li>
			<li>Dopo circa 5 minuti, guarda le cellule al microscopio. Se tutte le cellule sono galleggianti, aggiungere almeno 4 ml di mezzo e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo sterile. Contare le cellule usando un emocitometro e aggiungere 1 × 106 cellule in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per la trasfezione. NOTA: Dopo 24 ore, le cellule dovrebbero essere all'80% o più confluenti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Trasfezione del plasmide HiBiT-RBD<ol>
<li>Utilizzare 1 μg del plasmide di espressione HiBiT-RBD con un reagente di trasfezione adatto. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere il volume totale a ciascun pozzetto della piastra, in base alle gocce. NOTA: seguire il protocollo di trasfezione del produttore. In questo caso, una miscela (una quantità specificata) del reagente di trasfezione con DMEM è stata aggiunta al plasmide diluito (1 μg) in DMEM (vedere la tabella dei materiali). Utilizzare un marcatore contenente (ad esempio, plasmide di proteina fluorescente verde [GFP]) come controllo per monitorare l'efficienza della trasfezione.</li>
			<li>Il giorno successivo, sostituire il mezzo contenente la miscela di trasfezione con il mezzo completo. Osservare bene il controllo della trasfezione 48 ore dopo la trasfezione. NOTA: Se la trasfezione è stata positiva ed efficiente (oltre l'80% GFP-positiva), le cellule dovrebbero essere pronte per la raccolta del bioreporter HiBiT-RBD. Il costrutto contiene anche His-tag, che può essere utilizzato per ottenere proteine purificate al posto del surnatante totale.</li>
			<li>Raccogliere il surnatante in microtubi da 1,5 ml. Aggiungere 500 μL di 1x tampone di lisi passiva (PLB) alle cellule; incubare e agitare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente per la lisi cellulare. NOTA: Il surnatante e la soluzione lisata possono essere conservati a -20 °C con lieve perdita di integrità per almeno 6 mesi. Secondo Azad et al.22, il reporter è stabile a un ampio intervallo di pH (4-12) e temperatura (4-42 °C).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Valutazione del segnale luminescente dal bioreporter mediante saggio della luciferasi<ol>
<li>Preparazione dei componenti di reazione<ol>
<li>Utilizzare il surnatante come fonte del bioreporter. NOTA: Sia il surnatante che il lisato contengono il bioreporter HiBiT-RBD e possono essere utilizzati per il test. Tuttavia, il surnatante è raccomandato come fonte a causa di ragioni spiegate nelle note seguenti.</li>
			<li>Diluire l'LgBiT e il substrato a 1x prima dell'uso (la concentrazione di stock è 100x). NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli su LgBiT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Saggio della luciferasi<ol>
<li>Trasferire 50 μL del surnatante da ciascun pozzo o tubo a una piastra da 96 pozzetti e aggiungere 50 μL di 1x LgBiT a ciascun pozzetto. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
			<li>Aprire il software del luminometro, aggiungere 50 μL di 1x substrato (furimazina) a ciascun pozzetto, posizionare la piastra nel luminometro ed eseguire il software. NOTA: Aggiungere il substrato immediatamente prima di leggere la piastra per evitare il consumo del substrato da parte degli enzimi attivi prima della misurazione del segnale.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Rilevamento dell'anticorpo anti-RBD con un test rapido e sensibile
<ol><li>Test di rilevamento degli anticorpi HiBiT-RBD<ol>
<li>Preparare il bioreporter HiBiT-RBD come descritto nella sezione 1.1 del protocollo. NOTA: Si consiglia di utilizzare il surnatante per il seguente dosaggio in quanto è più semplice da raccogliere e contiene la versione glicosilata matura della proteina. Inoltre, il lisato ha diverse altre proteine che potrebbero interferire con l'interazione HiBiT-RBD-anticorpo.</li>
		<li>Combinare 50 μL del surnatante contenente HiBiT-RBD con 1 μg dell'anticorpo commerciale SARS-CoV-2-RBD in un microtubo da 1,5 mL. Aggiungere 20 μL di proteina legante le immunoglobuline (proteina G) alla soluzione. Aumentare il volume totale a 300 μL aggiungendo PBS. NOTA: Il volume totale della miscela può essere ridotto a 150 μL. Volumi totali inferiori non sono raccomandati in quanto potrebbero risultare in una miscelazione inadeguata degli anticorpi con il bioreporter.</li>
		<li>Incubare il tubo o i tubi su uno shaker o rotatore per 30 minuti. Centrifugare a 12.000 × g per 30 s, scartare il surnatante e lavare con PBS. Ripetere il processo tre volte per rimuovere HiBiT-RBD libero. Risospesso in 50 μL di PBS e trasferire in una piastra a 96 pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere 50 μL di 1x LgBiT e attendere 5 min. Quindi, aggiungere 50 μL di 1 substrato NanoLuc. Leggere immediatamente il segnale luminescente con un luminometro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Rilevamento ad alto rendimento degli anticorpi specifici di SARS-CoV-2 da campioni di siero del paziente
<ol><li>Preparare quantità maggiori del bioreporter HiBiT-RBD per un test ad alto rendimento seguendo la sezione 1.1 del protocollo.</li>
	<li>Combinare 20 μL di proteina magnetica G con 50 μL del surnatante HiBiT-RBD in un pozzo di piastra a 96 pozzetti per ogni campione. Aggiungere 10 μL del campione di siero a ciascun pozzetto e portare il volume totale a 150 μL aggiungendo PBS. NOTA: Utilizzare sia IgG non specifici (controllo negativo) che anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 (controllo positivo) alla concentrazione di 1 μg/mL come descritto nel passaggio 2.1.2. Inoltre, i campioni di siero di topi vaccinati possono anche essere valutati per gli anticorpi. In questo test, i campioni di siero sono stati ottenuti dall'Ottawa Hospital General Campus secondo una procedura approvata e con il consenso informato degli individui.</li>
	<li>Incubare per 30 minuti su uno shaker a temperatura ambiente. Posizionare la piastra su una rondella magnetica per precipitare il complesso di anticorpi G della proteina. NOTA: La struttura specifica della rondella magnetica farà precipitare il complesso sulle pareti laterali di ciascun pozzo.</li>
	<li>Scartare la soluzione nella sezione centrale di ciascun pozzetto e aggiungere PBS per il lavaggio. Ripetere la fase di lavaggio almeno tre volte per rimuovere l'eccesso di HiBiT-RBD. Aggiungere 50 μL di 1x PBS e 50 μL di 1x LgBiT. Incubare per almeno 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare il software del luminometro, quindi aggiungere 50 μL di 1x substrato. Posizionare la piastra nella macchina, eseguire il software e registrare i segnali. Confronta i segnali provenienti da campioni di siero, campioni di controllo e sfondo (pozzetti vuoti).</li>
</ol>

<ol><li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+coronavirus+2019+%28COVID-19%29+pandemic+outbreak%3A+A+comprehensive+review+of+the+current+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Vacunas%22%5BJournal%5D)">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li>
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<li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27(2016).</li>
<li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP%2FTAZ-TEAD+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596(2019).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+S1+NanoBiT%3A+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).</li>
<li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li>
<li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li>
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</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Il crescente numero di persone infette da SARS-CoV-2 e lo sforzo in corso per la vaccinazione globale richiedono test sierologici sensibili e veloci che possono essere utilizzati in indagini sierologiche su larga scala. Recenti ricerche dimostrano che i bioreporter a base di nanoluciferasi split possono essere utilizzati per sviluppare tali saggi. Recentemente abbiamo sviluppato il bioreporter HiBiT-RBD per progettare un test che possa essere utilizzato per rilevare gli anticorpi specifici di SARS-CoV-2 nel siero del paz...

La recente comparsa di un nuovo coronavirus, SARS-CoV21, ha causato oltre 2.800.000 morti e 128 milioni di infezioni al 30 marzo 20212. A causa della mancanza di una procedura di trattamento affidabile e consolidata per le terapie cliniche SARS-CoV-2, sono stati fatti molti sforzi per limitare l'ulteriore trasmissione virale e, cosa più importante, per sviluppare un trattamento efficace e robusto o un vaccino3. Ad oggi, ci sono più di 50 candidati vaccini COVID-19 in studi segnalati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità4. Il rilevamento di anticorpi contro SARS-CoV-2 è di fondamentale importanza per determinare la stabilità a lungo termine della risposta umorale alla somministrazione del vaccino e nei pazienti guariti di COVID-195. Alcuni studi hanno dimostrato che esiste la possibilità che i pazienti con SARS-CoV-2 recuperati perdano la maggior parte degli anticorpi che legano RBD dopo 1 anno5,6,7,8,9. Sono necessarie ulteriori indagini per comprendere meglio l'immunità duratura e piattaforme di rilevamento degli anticorpi più sensibili possono aiutare ulteriormente tale lavoro. Anche le segnalazioni di immunità sostenuta di infezioni lievi da SARS-CoV-2, che suggeriscono risposte anticorpali a lungo termine, sono un'area di studio interessante e utile. Un metodo di rilevamento rapido e accurato è essenziale per il monitoraggio degli anticorpi nei sieri degli individui per fornire maggiori informazioni sull'immunità nella popolazione.
Come altri coronavirus, SARS-CoV-2 utilizza la glicoproteina spike sporgente per legarsi all'enzima-2 di conversione dell'angiotensina (ACE2) per avviare una cascata di eventi che portano alla fusione delle membrane virali e cellulari6,7. Diversi studi hanno recentemente dimostrato che l'RBD della proteina Spike ha un ruolo cruciale nell'suscitare una risposta anticorpale potente e specifica contro SARS-CoV28,9,10,11. In particolare, le correlazioni osservate da Premkumar et al. tra il titolo dell'anticorpo legante RBD e la potenza di neutralizzazione sars-CoV-2 del plasma dei pazienti sono coerenti con RBD come compartimento immunogenico della struttura del virus9. Con questo in mente, molti test diagnostici disponibili per il rilevamento degli anticorpi SARS-CoV-2 richiedono tempo e costi, richiedono una lunga procedura di incubazione e lavaggio (saggio immunoassorbente enzimatico [ELISA]) o mancano di sensibilità e accuratezza (saggio immunologico a flusso laterale [LFIA])12. Pertanto, un metodo sierologico complementare quantitativo e rapido di rilevamento degli anticorpi derivati da COVID-19 con elevata sensibilità, risposta rapida e costo relativamente basso servirebbe alla necessità di un test sierologico affidabile per la sorveglianza epidemiologica sars-CoV-2.
Collettivamente, i limiti degli attuali saggi sierologici hanno spinto lo studio del sistema di segnalazione bioluminescente come potenziale agente diagnostico in future indagini sierosoratorie. La bioluminescenza è una reazione enzima/substrato naturale, con emissione luminosa. La nanoluc luciferasi è la più piccola (19 kDa), ma il sistema più luminoso rispetto alla Renilla e alla lucciola luciferasi (36 kDa e 61 kDa, rispettivamente)13,14. Inoltre, Nanoluc ha il più alto rapporto segnale/rumore e stabilità tra i sistemi precedentemente menzionati. L'elevata intensità del segnale di Nanoluc supporta il rilevamento anche di quantità molto basse di fusioni di reporter15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) è una versione divisa del sistema Nanoluc, che è composto da due segmenti: piccolo BiT (11 amminoacidi; SmBiT) e BiT di grandi dimensioni (LgBiT) con interazioni di affinità relativamente bassa (KD = 190 μM ) per formare un complesso luminescente16. NanoBiT è ampiamente utilizzato in vari studi che coinvolgono l'identificazione delle interazioni proteina-proteina15,17,18,19 e delle vie di segnalazione cellulare11,20,21.
Recentemente, è stato introdotto un altro piccolo peptide con un'affinità nettamente superiore a LgBiT (KD = 0,7 nM ), vale a dire il sistema HiBiT Nano-Glo, al posto di SmBiT. L'alta affinità e il segnale forte del test Nano-Glo "add-mix-read" rendono HiBiT un tag peptidico adatto, quantitativo e luminescente. In questo approccio, il tag HiBiT viene aggiunto alla proteina bersaglio sviluppando un costrutto che impone interferenze strutturali minime. La fusione HiBiT-proteina si legherebbe attivamente alla controparte LgBiT, producendo un enzima luciferasi altamente attivo per generare bioluminescenza rilevabile in presenza di reagenti di rilevamento (Figura 1). Allo stesso modo, abbiamo sviluppato un sistema basato su HiBiT Nano-Glo per misurare prontamente il titolo anticorpale neutralizzante nei sieri di individui recuperati da SARS-CoV-2 e recentemente abbiamo sviluppato un RBD SARS-CoV-2 con tag HiBiT. Questo documento descrive il protocollo per la produzione del bioreporter HiBiT-RBD utilizzando procedure e apparecchiature di laboratorio standard e mostra come questo bioreporter può essere utilizzato in un test rapido ed efficiente per rilevare gli anticorpi mirati a SARS-CoV-2 RBD.

<table><tbody><tr><td>5x tampone per lisi passiva</td><td>Promega</td><td>E194A</td><td>30 mL</td></tr><tr><td>Bio-Plex Rondella magnetica portatile</td><td>Bio-Rad</td><td>171020100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di dosaggio della luciferasi Dual-Glo</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td>Kit da 100 ml</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Plasmide Sigma</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HiBiT-RBD</td><td></td><td></td><td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgtgttgg aggtcgctgagtgagtgcgcaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatgctgctggggttg cgctgcttcgggatgtgggggatgatgggagtatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattataa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtatcatatcatcatatgccaagta 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Mab</td><td>SinoBiological</td><td>40592-MM57</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Mx Lettore di micropiastre</td><td>BioTek</td><td></td><td>Luminometro per lettore di piastre a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2520056</td><td>0,25%</td></tr></tbody></table>

rilevazione dell'anticorpo sars-cov-2 receptor-binding domain utilizzando un bioreporter basato su hibit

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

L'emergere della pandemia di COVID-19 ha aumentato la necessità di migliori metodi di rilevamento sierologico per determinare l'impatto epidemiologico della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Il crescente numero di infezioni da SARS-CoV-2 solleva la necessità di migliori test di rilevamento degli anticorpi. Gli attuali metodi di rilevamento degli anticorpi compromettono la sensibilità per la velocità o sono sensibili ma richiedono molto tempo. Una grande percentuale di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 prende di mira il dominio di legame del recettore (RBD), uno dei compartimenti immunogenici primari di SARS-CoV-2. Recentemente abbiamo progettato e sviluppato un RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) altamente sensibile e bioluminescente per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2. Il testo seguente descrive la procedura per produrre il complesso HiBiT-RBD e un test rapido per valutare la presenza di anticorpi mirati alla RBD utilizzando questo strumento. A causa della durata del prodotto proteico HiBiT-RBD su un'ampia gamma di temperature e della procedura sperimentale più breve che può essere completata entro 1 ora, il protocollo può essere considerato un'alternativa più efficiente per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2 nei campioni di siero dei pazienti.

I segnali provenienti sia dal lisato cellulare contenente HiBit-RBD che dal surnatante delle cellule trasfettate sono stati registrati (Figura 2) per valutare la fonte proteica appropriata. HiBiT-RBD e LgBit sono stati utilizzati separatamente come controlli e i dati hanno mostrato uno sfondo basso rispetto a un segnale forte quando entrambe le parti sono state combinate. Pertanto, l'interazione HiBiT-RBD con LgBiT è necessaria per generare un enzima attivo per la digestione del substrato e ...

Il protocollo delineato descrive la procedura per la produzione del complesso proteico del dominio legante il recettore HiBiT e la sua applicazione per il rilevamento rapido e sensibile degli anticorpi SARS-CoV-2.

Rilevazione dell'anticorpo sars-CoV-2 Receptor-Binding Domain utilizzando un bioreporter basato su HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Il mio laboratorio ha lavorato nella ricerca COVID-19 e abbiamo recentemente sviluppato un nuovo test che ci ha permesso di rilevare rapidamente e con precisione gli anticorpi SARS-CoV-2. Questo protocollo delinea un test ad alto rendimento per rilevare gli anticorpi anti-SARS-CoV-2 nei campioni di siero dei pazienti, che è fondamentale data l'attuale pandemia. La maggior parte degli attuali saggi sierologici sacrifica la velocità per la sensibilità o viceversa.I nostri dati mostrano che il nostro test è sensibile e ha un tempo di risposta rapido. Al fine di produrre una quantità sufficiente di bioreporter HiBiT-RBD elevato, iniziare preparandosi per la coltura cellulare. Per prima cosa, prepara il mezzo dell'aquila modificato completo di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina e streptomicina.Quindi riscaldare il supporto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Accendere l'armadio di sicurezza biologica e utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare la superficie dell'armadio. Per coltivare la linea cellulare, estrarla da meno 80 gradi Celsius o azoto liquido e scongelarla in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.Mescolare le cellule scongelate con almeno 10 millilitri di mezzo completo. Pipettare la sospensione cellulare in una capsula di Petri di 15 centimetri e ruotare la piastra per distribuire uniformemente le cellule. Posizionare il piatto in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 85-95% di umidità.Osservare le cellule al microscopio fino a quando il livello di confluenza raggiunge l'80-90% ad alta confluenza, rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS caldo e aggiungere da tre a cinque millilitri di 0,25% tripsina-EDTA per staccare le cellule dalla superficie. Dopo circa cinque minuti, guarda le cellule al microscopio. Se tutte le cellule sono galleggianti, aggiungere almeno quattro millilitri di mezzo e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo sterile.Contare le cellule usando un emocitometro e aggiungere un milione di cellule in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti per la trasfezione. Per eseguire la trasfezione del plasmide HiBiT-RBD, utilizzare un microgrammo del plasmide di espressione HiBiT-RBD con un reagente di trasfezione adatto. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere il volume totale a ciascun pozzetto della piastra a goccia.Il giorno successivo, sostituire il mezzo contenente la miscela di trasfezione con il mezzo completo. Osservare bene il controllo della trasfezione 48 ore dopo la trasfezione. Raccogliere il surnatante in microtubi da 1,5 millilitri.Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi passiva 1X o PLB alle cellule, quindi incubare e scuotere la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente per la lisi cellulare. Successivamente, per valutare il segnale di luminescenza dal bioreporter utilizzando un test di luciferasi, preparare prima i componenti della reazione e utilizzare il surnatante come fonte del bioreporter. Diluire il Grande BiT e il substrato a 1X prima dell'uso.Trasferire 50 microlitri del surnatante da ciascun pozzo o tubo a una piastra da 96 pozzetti e aggiungere 50 microlitri di BiT 1X grande a ciascun pozzo. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Aprire il software del luminometro, aggiungere 50 microlitri di substrato 1X a ciascun pozzetto, posizionare la piastra nel luminometro ed eseguire il software.Per eseguire il test di rilevamento degli anticorpi HiBiT-RBD, preparare il bioreporter HiBiT-RBD come descritto in precedenza e combinare 50 microlitri del surnatante contenente HiBiT-RBD con un microgrammo dell'anticorpo commerciale SARS-CoV-2 RBD in un microtubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 20 microlitri di proteina legante le immunoglobuline o proteina G alla soluzione. Porta il volume totale a 300 microlitri aggiungendo PBS.Incubare i tubi su uno shaker o rotatore per 30 minuti. Centrifugare a 12.000 G per 30 secondi. Quindi scartare il surnatante e lavare con PBS.Ripetere il processo tre volte per rimuovere HiBiT-RBD libero. Risospesciare le celle in 50 microlitri di PBS e trasferirle in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 50 microlitri di BiT 1X grande e attendere cinque minuti.Quindi aggiungere 50 microlitri di substrato 1X NanoLuc. Leggere immediatamente il segnale di luminescenza con un luminometro. Preparare grandi quantità del bioreporter HiBiT-RBD per un test ad alto rendimento e combinare 20 microlitri di proteina magnetica G con 50 microlitri del surnatante HiBiT-RBD in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per ciascun campione.Aggiungere 10 microlitri del campione di siero a ciascun pozzetto e portare il volume totale a 150 microlitri aggiungendo PBS. Incubare per 30 minuti su uno shaker a temperatura ambiente. Quindi posizionare la piastra su una rondella magnetica per precipitare il complesso di anticorpi della proteina G.Scartare la soluzione nella sezione centrale di ciascun pozzetto e aggiungere PBS per il lavaggio. Ripetere la fase di lavaggio almeno tre volte per rimuovere l'eccesso di HiBiT-RBD. Aggiungere 50 microlitri di 1X PBS e 50 microlitri di 1X BiT di grandi dimensioni e incubare per almeno cinque minuti a temperatura ambiente.Preparare il software del luminometro. Quindi aggiungere 50 microlitri di substrato 1X. Posizionare la piastra nella macchina, eseguire il software e registrare i segnali.Confronta i segnali provenienti da campioni di siero, campioni di controllo e segnali di fondo da pozzi vuoti. I segnali provenienti sia dal lisato cellulare contenente HiBiT-RBD che dal surnatante delle cellule trasfettate sono stati registrati per valutare la fonte proteica appropriata. I dati hanno mostrato uno sfondo basso rispetto a un segnale forte quando entrambe le parti sono state combinate.L'aggiunta di proteina G aiuta la precipitazione degli anticorpi. Il test è stato utilizzato per confrontare il segnale di un anticorpo neutralizzante commerciale SARS-CoV-2 con un IgG di controllo. Il segnale anticorpale specifico era robusto, mentre l'anticorpo di controllo aveva un livello di fondo vicino al livello di fondo luminescente.Il virus della stomatite vescicolare oncolitica attenuata ricombinante o VSV con una mutazione in posizione 51 della proteina M che esprime RBD esogena è stato utilizzato per vaccinare i topi. Il siero raccolto da topi vaccinati ha prodotto un segnale robusto rispetto a nessun segnale nei topi iniettati con VSV di controllo. Questo protocollo può essere utilizzato per il rilevamento degli anticorpi SARS-CoV-2 nei campioni di siero dei pazienti.Le fasi di lavaggio successive all'incubazione con la proteina G sono fondamentali per ridurre lo sfondo. Inoltre, è importante aggiungere il substrato il più rapidamente possibile per evitare la perdita di segnale. Con alcune fasi di ottimizzazione aggiuntive, lo stesso test può essere utilizzato per analizzare campioni di sangue e potrebbe essere un metodo efficace per determinare gli anticorpi anti-SARS-CoV-2 nei campioni di sangue dei pazienti.

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Biomolecolare Detection impiega il sensore di immagine interferometrica riflettanza (IRIS)

Il video mostra il dosaggio della luciferasi utilizzato per quantificare le proteine marcate con luciferasi. Il test utilizza un enzima luciferasi ingegnerizzato composto da un frammento di grandi dimensioni che si lega al frammento piccolo, che è coniugato con una proteina di interesse. Le subunità legate formano un enzima attivo che, in presenza del substrato, rilascia un segnale luminescente. Questo segnale viene quindi quantificato utilizzando un luminometro.

Il saggio della luciferasi: un test ad alto rendimento per misurare i segnali luminescenti utilizzando bioreporter ingegnerizzati basati su sistemi di nanoluciferasi

In questo video, mostriamo il test basato sul sistema HiBit-RBD bioreporter per rilevare gli anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2. Questo sistema prende di mira il dominio RBD virale utilizzando un sistema reporter bioluminescente contenente HiBiT fuso al dominio RBD.

Saggio Bioreporter: una tecnica sensibile che utilizza un sistema reporter bioluminescente per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2

Il protocollo qui descritto delinea un metodo rapido ed efficace per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro la proteina spike SARS-CoV-2 valutando la capacità dei campioni di siero convalescente di inibire l'infezione da un virus della stomatite vescicolare potenziato con proteina fluorescente verde pseudotipizzato con glicoproteina spike.

Rilevamento di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 utilizzando l'imaging fluorescente ad alto rendimento dell'infezione da pseudovirus

Un sistema di analisi di flusso per saggi multiplexati basati su perle che fornisce una lettura a due reporter è stato utilizzato per lo sviluppo di saggi sierologici multiplex e di neutralizzazione degli anticorpi in grado di misurare contemporaneamente gli anticorpi IgG e IgM neutralizzanti per SARS-CoV-2.

Un test di neutralizzazione rapido e multiplex Dual Reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 per un sistema di analisi del flusso basato su perle multiplexate

In questo protocollo, i punti quantici coniugati al picco RICOMBINANTE SARS-CoV-2 consentono saggi basati su cellule per monitorare il legame dello spike a hACE2 sulla membrana plasmatica e la successiva endocitosi delle proteine legate nel citoplasma.

Imaging confocale ad alto rendimento di trimeri spike SARS-CoV-2 coniugati quantum dot per tracciare il legame e l'endocitosi nelle cellule HEK293T

Questo articolo descrive un metodo conveniente per monitorare i cambiamenti dinamici nei titoli anticorpali per due isotipi di immunoglobuline contemporaneamente (IgA, IgM o IgG) derivanti da una risposta immunitaria all'infezione o alla vaccinazione da SARS-CoV-2. Questo "Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel" impiega tre test immunologici indiretti costruiti su microsfere codificate che vengono lette utilizzando un lettore multiplex basato sul flusso con funzionalità "dual-channel".

Monitoraggio dinamico della sieroconversione utilizzando un test multianalyte immunobead per Covid-19

Il presente protocollo descrive nuovi strumenti per i saggi di legame SPR per esaminare il legame CV-N a HA, glicoproteina S, glicani di tipo ibrido correlati e oligosaccaridi ad alto mannosio. SPR è usato per determinare il KD per legare CV-N dimerico o monomerico a questi glicani.

Ingegneria di agenti antivirali tramite risonanza plasmonica di superficie

Qui, descriviamo un test immunologico fluorescente multiplex di nuova concezione che utilizza un sistema citometrico a flusso dual-reporter per rilevare contemporaneamente due epitopi unici della proteina spike su particelle virali intatte di coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) che erano state catturate da microsfere magnetiche accoppiate all'enzima di conversione dell'angiotensina-2.

Profilazione degli epitopi proteici di superficie su particelle virali mediante la strategia multiplex dual-reporter

Descriviamo una piattaforma di immunodosaggio di recente sviluppo basata sui principi della biologia sintetica cell-free e sulla tecnica dot-blot per il rilevamento personalizzabile della risposta anticorpale in sieri umani e animali.

Cell-Free Dot Blot come piattaforma di immunodosaggio pratica e adattabile per il rilevamento della risposta anticorpale in sieri umani e animali

Scopri un saggio ad alto rendimento per la rilevazione rapida e sensibile degli anticorpi SARS-CoV-2 nel siero dei pazienti utilizzando un bioreporter HiBiT-RBD. Questo metodo combina velocità e sensibilità per il testing sierologico.

Rilevazione dell'anticorpo sars-CoV-2 Receptor-Binding Domain utilizzando un bioreporter basato su HiBiT

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