In vitro Induzione di cellule staminali della polpa dentale umana verso lignaggi pancreatici
September 25th, 2021
Questo protocollo presenta un confronto tra due diversi protocolli di induzione per differenziare le cellule staminali della polpa dentale umana (hDPSC) verso le linee pancreatiche in vitro:il protocollo integrativo e il protocollo non integrativo. Il protocollo integrativo genera più cellule produttrici di insulina (IPC).
Questo video mostra l'induzione in vitro di cellule staminali della polpa dentale umana verso lignaggi pancreatici. Le cellule staminali danno un trattamento alternativo in molte malattie tra cui il diabete di tipo I che causano il biolaging delle cellule beta. Il trapianto di cellule produttrici di insulina sarà il nuovo metodo promettente per causare la vita.
In questo video vengono descritti due approcci per la generazione di cellule produttrici di insulina, incluso il protocollo di induzione integrativa e non integrativa. E in questa parte viene spiegato il protocollo di integrazione per indurre cellule produttrici di insulina da cellule staminali della polpa dentale umana. Per il protocollo di induzione è il per mescolare il naturale processo di sviluppo pancreatico.
Per ottenere le cellule produttrici di insulina naturale e funzionale. Per generare cellule produttrici di insulina da cellule staminali mesenchimali come le cellule staminali della polpa dentale, viene utilizzato il protocollo di induzione a più fasi. Le cellule staminali mesenchimali sono utilizzate rispettivamente nella parola endoderma definitivo, endoderma pancreatico, endocrino pancreatico e poi cellule beta pancreatiche o cellule produttrici di insulina.
Per indurre le cellule, l'approccio di induzione in tre fasi viene utilizzato come protocollo backbone. Il protocollo integrativo impiegava la sovraespirazione del fattore di trascrizione pancreatico essenziale, PDX-1, da parte delle cellule staminali della polpa dentale umana. Quindi il PDX-1 sulle cellule staminali espresse sarà ulteriormente indotto utilizzando il protocollo di differenziazione in tre fasi.
Il potenziale di differenziazione pancreatica, tramite il protocollo integrativo, sarà confrontato con il protocollo non integrativo come illustrato nell'animazione. Questa idea è stata eseguita secondo il protocollo approvato dal Comitato Etico della Ricerca Umana, Facoltà di Odontoiatria, Università Chulalongkorn con il consenso informato dei pazienti. Questo protocollo è iniziato con la scadenza eccessiva di PDX-1.
Le cellule staminali della polpa dentale umana in parti da 2 a 5, con confluenza del 70-80%, vengono utilizzate per la trasduzione. Le cellule vengono tripsinite e contate. Quindi un milione di cellule sono sedute sul vaso di trasfezione e incubate durante la notte.
24 ore dopo, l'antivirus appena preparato che trasporta il gene PDX-1 viene aggiunto alla nave coltivata in base alla molteplicità desiderata di infezione. Le cellule trasfettate vengono quindi conservate nell'incubatrice per 24 ore. Quindi il terreno coltivato fresco viene cambiato e mantenuto per un altro periodo di 48.
La morfologia delle cellule trasfettate viene controllata prima dell'uso per un'ulteriore fase di induzione. Le cellule staminali della polpa dentale umana con PDX-1 oltre la scadenza vengono quindi tryptimizzate e sospese nel primo mezzo di induzione pancreatica, il cosiddetto mezzo A.In questo passaggio, viene utilizzato un vaso coltivato a basso attaccamento. Morfologia della PDX-1 su cellule staminali della polpa dentale umana espresse il giorno 3 dopo l'induzione del mezzo A.
Le cellule con una buona morfologia saranno quindi utilizzate per ulteriori fasi di induzione. Il passo successivo, il secondo mezzo di induzione, il cosiddetto mezzo B, viene aggiunto alla nave coltivata. Si osserva la morfologia di PDX-1 sulle cellule staminali della polpa dentale umana espresse il secondo giorno dopo l'induzione del mezzo.
Le cellule con una buona morfologia saranno quindi utilizzate per un'ulteriore fase di induzione. Il passo successivo, il terzo mezzo di induzione, il cosiddetto mezzo C, viene aggiunto al vaso coltivato. 5 giorni dopo si osserva la morfologia cellulare.
Le colonie cellulari vengono raccolte per ulteriori analisi. Compresa la morfologia e le dimensioni della colonia, l'espressione del marcatore genico pancreatico e le proprietà funzionali relative alla secrezione di peptide C stimolata dal glucosio o al test GSCS. Per l'approccio di induzione non integrativa, viene utilizzato il protocollo di induzione in tre fasi menzionato in precedenza.
Un milione di cellule vengono ri-sospese nel mezzo A e sedute su un recipiente di coltura a basso attacco. Poi coltivato per tre giorni. Dopo il controllo della morfologia, serie di mezzi di induzione, tra cui il mezzo B e C, vengono successivamente aggiunti al vaso coltivato rispettivamente il terzo e il quinto giorno.
Al giorno 10 si osserva la morfologia cellulare. Le colonie cellulari vengono raccolte per ulteriori analisi, tra cui la morfologia e le dimensioni delle colonie, l'espressione del marcatore genico pancreatico e le proprietà funzionali relative alla secrezione di peptide C stimolata dal glucosio o al test GSCS. I risultati di entrambi i protocolli di induzione sono confrontati in entrambi i protocolli.
Le cellule staminali della polpa dentale umana sono in grado di formare una struttura simile a una colonia fin dal primo giorno dell'induzione. L'aspetto delle colonie è rotondo e denso. Tutte le colonie galleggiano nei vasi di coltura per tutto il periodo di induzione.
Il numero totale di colonie del protocollo di induzione integrativa è leggermente superiore a quello dell'induzione non integrativa. L'evoluzione sotto la percentuale di dimensioni della colonia mostra un andamento benefico, dalla formazione di colonie di piccole e medie dimensioni all'induzione integrativa, che è importante per ridurre il nucleo necrotico all'interno della colonia. L'analisi dei marcatori genici pancreatici ha rivelato che il protocollo induttivo integrativo produce colonie con elevata scadenza di marcatori pancreatici, tra cui MAP-A, GLUT-2, insulina e GLP-1R, suggerendo la differenziazione verso le cellule produttrici di insulina misurate.
Per la funzione glucosio C-peptide secrezione è importante. I risultati mostrano che entrambi i protocolli di induzione producono le colonie con una buona risposta alla sfida del glucosio. Da questo studio, entrambi i protocolli di induzione pancreatica sono in grado di generare le cellule produttrici di insulina in vitro in termini di scadenza del marcatore pancreatico e proprietà funzionale, i protocolli mostrano una migliore qualità della formazione cellulare produttrice di insulina.
Suggerendo le tendenze delle cellule staminali mesenchimali umane come l'applicazione di cellule staminali della polpa dentale umana nel trattamento del diabete a base di cellule staminali nel prossimo futuro.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo protocollo presenta un confronto tra due diversi protocolli di induzione per differenziare le cellule staminali del polpo dentale umano (hDPSCs) verso i lignaggi pancreatici in vitro. Il protocollo integrativo genera più cellule produttrici di insulina (IPC) rispetto al protocollo non integrativo.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Medicina rigenerativa
- Sviluppo pancreatico
Sfondo
- Le cellule staminali del polpo dentale umano (hDPSCs) sono una fonte promettente per la terapia cellulare.
- Il diabete di tipo I è caratterizzato dalla perdita di cellule beta produttrici di insulina.
- La generazione di IPC dalle hDPSCs potrebbe fornire una nuova via di trattamento per il diabete.
- Diversi protocolli di induzione possono influenzare l'efficienza della generazione di IPC.
Obiettivo dello studio
- Confrontare l'efficacia dei protocolli integrativi e non integrativi per indurre IPC dalle hDPSCs.
- Valutare il potenziale delle hDPSCs nelle terapie rigenerative per il diabete.
- Fornire informazioni sui meccanismi di differenziazione del lignaggio pancreatico.
Metodi utilizzati
- Differenziazone in vitro delle hDPSCs utilizzando due protocolli distinti.
- Valutazione dell'efficienza di generazione delle IPC tra i protocolli.
- Analisi delle caratteristiche cellulari e della funzionalità delle IPC prodotte.
- Confronto dell'integrazione con i processi naturali di sviluppo pancreatico.
Risultati principali
- Il protocollo integrativo ha portato a una maggiore resa di IPC.
- Le cellule generate tramite l'approccio integrativo hanno mostrato una funzionalità migliorata.
- Si sono notate differenze nel comportamento cellulare tra i due protocolli.
- L'integrazione con i segnali di sviluppo ha migliorato i risultati della differenziazione.
Conclusioni
- Il protocollo integrativo è più efficace per generare IPC dalle hDPSCs.
- Comprendere questi protocolli può migliorare la terapia con cellule staminali per il diabete.
- Studi futuri dovrebbero esplorare la vitalità a lungo termine e la funzionalità delle IPC.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs) into insulin-producing cells (IPCs) addresses a critical bottleneck in regenerative diabetes research by providing a scalable, donor-independent cell source. Comparative evaluation of integrative and non-integrative induction protocols informs early-stage pipeline decisions and supports predictive confidence in stem cell-based therapeutic development. These advances enable risk-adjusted prioritization of cell therapy platforms for metabolic disease portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pancreatic lineage commitment from mesenchymal stem cells.
- Supports mechanistic de-risking by comparing genetic and microenvironmental induction strategies.
- Facilitates functional target validation through glucose-stimulated C-peptide secretion assays.
- Provides quantitative readouts for portfolio triage of differentiation protocols.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, multi-step induction workflows for generating IPCs from hDPSCs.
- Standardizes assessment of colony morphology, size, and marker expression for assay readiness.
- Enables quantitative evaluation of functional insulin secretion in response to glucose challenge.
- Prepares validated cell systems for downstream compound screening or mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation outputs with disease-relevant pancreatic biomarkers.
- Supports continuity from discovery-stage induction to preclinical validation of IPC function.
- Provides functional data to inform risk-adjusted advancement of cell therapy candidates.
- Enables mechanistic de-risking prior to in vivo or translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
This induction platform positions hDPSC-derived IPCs as a renewable resource spanning early discovery through preclinical research in diabetes and metabolic disease pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on lineage specification and functional maturation of stem cell-derived IPCs.
- Screening: Delivers standardized, reproducible cell populations for quantitative functional assays.
- Analytics: Provides measurable outputs—colony count, size, gene expression, and C-peptide secretion—for robust protocol comparison.
- Translational Research: Aligns in vitro differentiation with pancreatic biomarker profiles relevant to preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular induction workflow adaptable to other stem cell sources or lineage targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and functional validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of IPC generation protocols.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for cell therapy platform investment and development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regenerative medicine assets targeting diabetes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, genetic manipulation, and multi-step differentiation protocols.
- Demands access to viral transduction systems and quantitative molecular assays.
- Necessitates cross-team standardization of induction and functional testing workflows.
- May require adaptation for different stem cell sources or lineage targets.
- Efficiency and scalability must be validated for translational or preclinical progression.
