Analisi della restrizione di SAMHD1 mediante citometria a flusso in cellule mieloidi umane U937

Con il crescente interesse per il ruolo dei fattori cellulari nell'infezione da HIV dei macrofagi, abbiamo sviluppato un sistema flessibile di analisi, in particolare per SAM HG uno, che non è espresso nelle cellule U937. Il principale vantaggio del sistema è la sua flessibilità. Una volta configurato, può essere utilizzato per analizzare una varietà di proteine, cellule o virus bersaglio.

È importante mantenere la salute delle cellule e anche sentirsi a proprio agio con la citometria a flusso multicolore. Accendere il citometro e il computer 10 minuti prima di iniziare l'analisi. Assicurarsi che i rifiuti siano vuoti e che il serbatoio della guaina sia pieno.

Quindi accedi e apri il software di analisi. Dopo aver spostato il braccio, togliere il tubo dell'acqua. Impostare la portata su alta e premere prime.

Attendi che la luce si spenga e ripeti questo processo altre tre volte. Riposizionare il tubo dell'acqua e farlo funzionare ad alta portata per tre minuti. Quindi, impostare la portata su bassa e premere standby fino all'acquisizione.

Seleziona esperimento, nuovo esperimento e premi OK per selezionare esperimento vuoto, fai clic con il pulsante destro del mouse sull'esperimento e aggiungi nuovo campione. Premere OK per spegnere il pannello. Fare clic con il pulsante destro del mouse per rinominare con un nome appropriato e aprire l'esemplare facendo clic sul segno più per visualizzare un nuovo tubo.

Fare doppio clic sul tubo per visualizzare le impostazioni del citometro nell'ispettore. Nel menu dei parametri, eliminare i fluorocromi non richiesti ad eccezione del laser blu 53030 e del laser giallo 61020. Nel foglio di lavoro, creare un'area di dispersione diretta rispetto al grafico a punti dell'area di dispersione laterale, all'istogramma YFP, all'istogramma RFP e al grafico a punti RFP rispetto a YFP facendo clic sull'icona corrispondente e modificando gli assi facendo clic sull'etichetta dell'asse.

Caricare il controllo non infetto e non trasdotto e premere Run sulla macchina. Quindi premere acquisisci nel dashboard di acquisizione. Regolare le tensioni di dispersione diretta e laterale nel dashboard per posizionare le celle nel quadrante inferiore sinistro.

Chiudi questa popolazione ed etichettala come P uno. Fare clic con il pulsante destro del mouse sugli altri grafici e selezionare Mostra P uno per rimuovere i detriti dall'analisi successiva. Regolare le tensioni RFP e YFP verso il basso in modo che il picco si trovi a sinistra dell'istogramma.

Caricare il controllo a colore singolo per YFP e acquisire pressa. Regolare la tensione YFP nel cruscotto in modo che la maggior parte delle celle fluorescenti si trovi all'interno dell'intervallo del rilevatore. Quindi ripetere lo stesso per il controllo RFP.

Seleziona l'esperimento. Vai alla configurazione della compensazione e seleziona crea controlli di compensazione e ok per passare a un foglio di lavoro normale, quindi seleziona un foglio di lavoro normale non macchiato. Premere sulla corsa e acquisire per il controllo non macchiato.

Disegna un cancello P attorno alle celle intatte e registra. Rimuovere il tubo e mettere la macchina in standby. Fare clic con il tasto destro su P uno.

Fai clic su Applica a tutti i controlli di compensazione e passa al normale foglio di lavoro RFP. Premi Esegui e registra il controllo RFP a colore singolo e il software cancellerà automaticamente le celle positive. Mettere la macchina in standby e ripetere lo stesso per il controllo YFP.

Seleziona esperimento, vai su Impostazione compensazione, seleziona Calcola compenso e quindi fai clic su link e salva. Passare al foglio di lavoro globale e tornare al tubo del campione. Acquisire le cellule trasdotte con SAM HD di tipo selvaggio infettate da RFP HIV e verificare che quattro popolazioni distinte possano essere viste negli angoli dei quadranti allineati verticalmente e orizzontalmente per YFP e RFP.

Rimuovere il tubo e premere standby. Ricaricate il campione non trasdotto e non infetto e premete Esegui. Nella dashboard di acquisizione, impostare il cancello di arresto su P uno e gli eventi per registrare 30.000 eventi.

Registra stampa. Ripetere lo stesso per altri campioni e controlli premendo il tubo successivo tra ogni tubo. Rinominare gli esempi durante l'esecuzione o post-hawk ed esportare i dati come file FCS punto.

Apri il software e trascina tutti i file FCS nel cruscotto. Selezionare i controlli di compensazione e trascinarli nella sottocartella di retribuzione. Fare doppio clic sul tubo non trasdotto e non infetto per aprire il file e inoltrare la dispersione di un grafico a dispersione laterale contro.

Selezionare lo strumento poligono e il cancello sulla popolazione di celle intatta esclusi i detriti nell'angolo in basso a sinistra e denominarla celle. Sposta l'etichetta in modo che non oscuri le celle. Trascina questa porta sull'intera popolazione di tubi nella barra di tutti i campioni.

Scorri l'intera popolazione utilizzando i pulsanti freccia orizzontale per garantire il gating appropriato per ogni tubo. Fare doppio clic sulle celle e regolare gli assi in base all'altezza rispetto all'area. Selezionare la singola grande popolazione utilizzando un cancello rettangolare per escludere doppietti e consentire al software di suggerire di nominarla automaticamente come celle singole.

Quindi, trascina questa porta su tutte le popolazioni di cellule e controlla che il gating sia appropriato per tutti i campioni. Selezionare la popolazione di singole cellule per il campione non infetto e non trasdotto. Cambiare l'asse Y in laser blu compensato per YFP e l'asse X in laser giallo compensato per RFP.

Seleziona lo strumento di gating del quadrante e fai clic all'estremo in alto a destra della popolazione cellulare negativa. Applicare questo gating preliminare a tutte le popolazioni di singole cellule trascinando sul gate padre nella barra di tutti i campioni. Se le porte dei quadranti non separano la popolazione in modo soddisfacente, eseguire il controllo dei singoli quadranti utilizzando lo strumento poligono.

Scorrere fino al tipo wild SAM HD un solo campione per verificare il corretto gating tra le celle YFP negative non trasdotte e YFP positive. Utilizzare la vista di contorno per discriminare le celle negative dalle celle YFP deboli. Utilizzare la migliore divisione tra YFP negativo e positivo valida per tutti i campioni e scorrere i campioni per verificare il gating rispetto alla positività YFP.

Scorrere fino al campione infetto di RFP HIV non trasdotto e verificare se il gating tra RFP negativo non infetto e RFP positivo infetto è corretto. Se necessario, utilizzare la vista contorno e scorrere gli esempi rimanenti per verificare che il gating sia valido per tutti i campioni. Ogni campione richiede quattro quadranti.

Q1 YFP positivo, Q2 doppio positivo, Q3 RFP positivo e Q4 doppio negativo. Aprire l'editor di tabelle e trascinare le quattro porte del quadrante nella dashboard. Seleziona per archiviare ed eccellere dal menu a discesa.

Scegli la destinazione del file e fai clic su crea tabella. Salvare il foglio di calcolo generato in base alle convenzioni di denominazione dei file locali. Fare clic sull'icona dell'editor di layout per esportare le rappresentazioni di trame e strategie di gating.

Seleziona ogni popolazione e trascinala nell'editor con gli assi, l'etichettatura e la spaziatura richiesti. Per creare un layout con gli stessi grafici mostrati per tutti i campioni nella sezione batch, immetterne uno nella colonna e premere crea report batch. Nel menu File, selezionate la scala in base alla larghezza ed evitate interruzioni di pagina.

Quindi salvare nel formato di file richiesto. Nel foglio di calcolo esportato, generare le colonne come descritto nel testo manuscritto. Utilizzare un software di analisi dei dati appropriato per calcolare la media dei dati di replica per ciascun costrutto SAM HD e calcolare i valori del rapporto di restrizione.

Sono stati generati grafici rappresentativi YFP rispetto a RFP per dati ottimali e subottimali. Il grafico dei dati non ottimale indica che l'infezione da HIV era troppo bassa e creava difficoltà con la compensazione e il gating. Il rapporto di restrizione era 0,5, che è superiore al rapporto atteso di 0,3.

I grafici del rapporto di restrizione per le varianti di SAM HD uno rispetto al wild type e al controllo negativo sono stati generati per i dati ottimali e subottimali. Nei dati ottimali, il tipo wild ha mostrato la restrizione attesa di circa 0,2 e il controllo negativo HD 206 a sette AA aveva il rapporto di restrizione di 1,0. La variante R372D era significativamente diversa dal tipo selvaggio, ma non significativamente diversa dal controllo negativo e ha perso la capacità di limitare.

Nei dati non ottimali, il controllo negativo si è comportato come previsto, ma il tipo selvatico ha mostrato un rapporto di restrizione di 0,5 a causa del basso tasso di infezione. L'R143D ha mostrato un fenotipo intermedio statisticamente diverso dal wild type e dal controllo negativo. La variante G209S era significativamente diversa dal tipo wild ma non significativamente diversa dal controllo negativo e quindi ha perso la capacità di limitare.

È importante avere molte cellule di controllo, in particolare se sei nuovo alla citometria a flusso. In seguito a questo o in parallelo, l'analisi biochimica degli stessi mutanti può essere effettuata per formare un quadro olistico.