Fabbricazione di un inchiostro biomateriale di agarosio incorporato in nanocellulosa cristallina per la coltura di mastociti derivati dal midollo osseo

Questo protocollo offre un approccio facile e rapido per lo screening di inchiostri biomateriali candidati per potenziali effetti citotossici contro cellule primarie e immunitarie sensibili prima di complessi esperimenti di bioprinting 3D. Dopo l'incubazione delle cellule immunitarie sui costrutti di inchiostro del biomateriale, le cellule possono essere facilmente recuperate dai costrutti mediante lavaggio delicato per eseguire analisi di citotossicità o biomarcatori a valle. Questo protocollo è direttamente rilevante per l'ingegneria tissutale in cui i tessuti bioprinted destinati al trapianto devono essere costruiti con cellule primarie e inchiostri biocompatibili di biomateriali.

Per iniziare, preparare una cartuccia d'inchiostro bio per l'installazione sulla bioprinter INKREDIBLE + 3D. In primo luogo, rimuovere i tappi terminali blu dalla cartuccia d'inchiostro biomateriale da tre millilitri e apporre un ugello sterile per bioprinting conico calibro 22 all'estremità Luer lock della cartuccia di inchiostro bio. Collegare il tubo di alimentazione della pressione dell'aria per la testina di stampa uno o PH1 all'estremità opposta della cartuccia e inserire la cartuccia con l'ugello di bioprinting conico collegato nello slot verticale di PH1.

Quindi, posizionare saldamente la cartuccia in PH1 con un ugello di bioprinting conico che si estende sotto la testina di stampa. Stringere la vite su PH1 in senso orario fino a quando non si stringe il dito per bloccare la cartuccia d'inchiostro bio in posizione. Si noti che il bioprinting 3D può essere eseguito con PH2 lasciato vuoto.

Accendi la bioprinter e avvia il software bioprinter su un PC collegato al bioprinter 3D tramite un cavo USB 2.0. Nel software, fai clic sul pulsante connetti per sincronizzarlo con il bioprinter 3D. Osserva tre opzioni nel menu di controllo principale della biostampante 3D.

Innanzitutto, prepara la bioprint. In secondo luogo, menu delle utilità. E terzo, schermata di stato.

Seleziona l'opzione prepara bioprint, quindi scorri verso il basso e seleziona l'opzione home axes. Dopo aver eseguito correttamente la calibrazione degli assi XYZ, l'altezza del letto di stampa si abbasserà leggermente e le testine di stampa si sposteranno al di sopra del punto centrale del letto di stampa. Per procedere con la calibrazione del punto di partenza per la bioprinting in lastre a 24 pozzetti, rimuovere una piastra di coltura sterile a 24 pozzetti dal suo involucro di plastica sigillato e segnare un punto sul punto centrale del pozzo D1 sul lato inferiore della piastra con un marcatore permanente.

Rimuovere il coperchio della piastra e posizionare la piastra di coltura a 24 pozzetti sul letto di stampa con il pozzetto D1 situato nell'angolo anteriore sinistro del letto di stampa. Nel menu di controllo principale, selezionare il menu utilità e quindi spostare l'asse. Spostare le testine di stampa con incrementi di un millimetro lungo gli assi X e Y fino a quando l'ugello di bioprinting conico di PH1 è direttamente sopra il punto contrassegnato sotto il pozzo D1. Se necessario, regolare la posizione dell'ugello di bioprinting conico sul punto spostando le testine di stampa con incrementi di 0,1 millimetri.

Registrare le coordinate X e Y dell'ugello di bioprinting conico quando si trova direttamente sopra il centro del pozzo D1 come indicato nella schermata del pannello di controllo della bioprinter 3D e segnare le coordinate. Quindi, sollevare il letto di stampa con incrementi di un millimetro fino a quando il fondo del pozzo D1 sta quasi toccando l'ugello di bioprinting conico installato in uno della testina di stampa. Se necessario, regolate il movimento del piano di stampa con incrementi di 0,1 millimetri.

Dal menu delle utilità, selezionare l'opzione di calibrazione dell'asse Z e selezionare e confermare ulteriormente l'opzione di calibrazione Z di memorizzazione. Torna al menu principale e seleziona l'opzione prepara bioprint. Scorri verso il basso e seleziona l'opzione Calibra Z.

Aggiorna il codice geometrico della piastra a 24 pozzetti o il codice G con le coordinate del punto di partenza corrette. Aprire il file G-code a 24 pozzetti fornito sul software bioprint. Aggiornare le coordinate X e Y sulla riga uno con i valori ottenuti nei passaggi precedenti e salvare il file con un nuovo nome.

Assicurarsi che la pompa pneumatica sia strettamente collegata alla porta di aspirazione dell'aria posteriore della bioprinter INKREDIBLE + 3D e accenderla. Estrarre la manopola di controllo in avanti situata sul lato destro della bioprinter INKREDIBLE+3D. Assicurarsi che i manometri digitali per PH1 e PH2 situati sulla parte anteriore della bioprinter leggano ciascuno vicino allo zero kilopascal.

Ruotare lentamente la manopola di controllo in avanti in senso orario fino a quando la pressione indicata sul manometro sinistro per PH1 raggiunge i 12 kilopascal. Posizionare una carta velina piegata o un pezzo di pellicola sigillante impermeabile sotto l'ugello di stampa della cartuccia installata, facendo attenzione a non toccare l'ugello di stampa. Dal menu di controllo principale sulla bioprinter 3D, selezionare Prepara bioprint.

Passare a e selezionare Attiva PH1. Si noti che l'inchiostro bio inizia ad estrudersi dall'ugello di stampa. Se necessario, aumentare la pressione di estrusione ruotando la manopola di controllo in senso orario fino a quando l'inchiostro biologico non viene estruso in un filamento continuo e registrare la nuova impostazione della pressione.

Selezionare disattiva PH1 per interrompere l'estrusione dell'inchiostro biologico. Rimuovere la carta velina o la pellicola contenente l'inchiostro bio estruso dal piano di stampa e chiudere la porta della bioprinter. Per eseguire la bioprinting 3D di substrati di idrogel rettilineo in un formato di piastra a 24 pozzetti, selezionare il menu delle utilità dal menu di controllo principale, quindi selezionare disabilita la stampa SD che consentirà al software bioprinter di trasmettere i file G-code al bioprinter 3D per la stampa.

Fare clic sul pulsante di caricamento nel software bioprinter e selezionare il file G-code della piastra a 24 pozzetti aggiornato. Nel pannello di controllo a destra del software, selezionare la scheda di anteprima di stampa e fare clic sul pulsante di stampa per iniziare la bioprinting nel pozzo D1. Al termine della bioprinting dei costrutti rettilinei, coprire la piastra a 24 pozzetti con il coperchio e spostarla in un armadio di biosicurezza di classe II. Immergere ogni costrutto rettilineo in due gocce di soluzione sterile di cloruro di calcio da 50 millimolari e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Aspirare accuratamente la soluzione di cloruro di calcio da ciascun pozzo e risciacquare una volta in un millilitro di 1X PBS per rimuovere il cloruro di calcio in eccesso. Per prevenire la disidratazione dei costrutti idrogel bioprinted, mantenere i costrutti rettilinei bioprinted 3D in PBS 1X fresco fino a quando i mastociti derivati dal midollo osseo sono pronti per essere seminati sui costrutti. Sulla base dei parametri di dispersione avanti e laterale delle BMMC analizzate mediante citometria a flusso, è stato osservato che il substrato di idrogel con la più alta concentrazione CNC non alterava la dimensione nativa o la granularità delle BMMC rispetto alle BMMC coltivate in assenza dei substrati di idrogel D-mannitolo di agarosio CNC.

L'analisi citometrica a flusso della permeabilità delle BMMC allo ioduro di propidio ha dimostrato che nessuna delle concentrazioni CNC testate ha suscitato effetti negativi sulla vitalità del BMMC. Il substrato di agarosio CNC ha aumentato l'espressione dei biomarcatori dei mastociti a concentrazioni CNC maggiori o uguali al 2,5% Tuttavia, i livelli di espressione di questi recettori sono rimasti relativamente coerenti tra il 2,5% e il 12,5% CNC, il che suggerisce un effetto indipendente dalla concentrazione di CNC. Il test XTT ha dimostrato che l'attività metabolica dei BMMC coltivati sugli scaffold di idrogel biostampati in 3D è rimasta relativamente coerente a circa il 100% in tutti i punti temporali testati.

Allo stesso modo, i saggi di rilascio LDH e di esclusione del colorante PI non hanno rivelato cambiamenti significativi nella vitalità dei BMMC. Un'attenta attenzione alla selezione del misuratore dell'ugello di stampa, alla calibrazione degli assi della biostampante 3D e all'impostazione della pressione di estrusione garantirà la stampa riproducibile di costrutti 3D di alta qualità. La facilità con cui i mastociti possono essere recuperati consente loro di essere sondati da una vasta gamma di saggi biologici per studiare ulteriormente qualsiasi aspetto delle loro funzioni cellulari.