Name: Ostruzione microchirurgica della fusione dei testicoli in Spodoptera litura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 38 s
Description: Impara la tecnica microchirurgica per bloccare la fusione testicolare in Spodoptera litura. Questo metodo minimamente invasivo permette di studiare la comunicazione tra organi e le vie di segnalazione negli insetti.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Nos.:31772519, 31720103916; ) e da una sovvenzione aperta dello State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (No.: sklsgb2013003).

1. Allevamento e manutenzione degli insetti
<ol><li>Coltivare le larve di Spodoptera litura in camere di simulazione ambientale con una dieta artificiale fino al raggiungimento del giorno 4 del 6° instar (L6D4). Seleziona le larve maschili quando i vermi entrano nel primo giorno del 6 ° instar (L6D0) in base alla struttura a forma di triangolo inverso sull'ottavo addome14. NOTA: Le tecniche di allevamento e manutenzione delle larve sono state pubblicate in precedenza4,14.</li>
</ol>2. Preparazione prechirurgica
<ol><li>Tagliare il foglio di alluminio in pezzi rettangolari con angoli arrotondati (1 mm x 2 mm, Figura 2).</li>
	<li>Sterilizzare la piattaforma chirurgica e gli elementi correlati (superficie del tavolo, microscopio, ghiacciaia, scatola degli insetti, vassoio di cera, spilli e filo) spruzzando il 75% di alcol sulla loro superficie e pulendoli.</li>
	<li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici (incluso il foglio di alluminio) con uno sterilizzatore a vapore ad alta pressione per 30 minuti e metterli in un forno di riscaldamento e asciugatura a 120 °C.</li>
	<li>Assicurarsi che gli operatori indossino abiti da laboratorio puliti, maschere chirurgiche e guanti sterili.</li>
</ol>3. Posizionamento microchirurgico di una barriera tra i testicoli
NOTA: Il flusso di lavoro generale è il seguente: congelamento → fissaggio → disinfezione → incisione → posizionamento della barriera → sutura→ alimentazione e ispezione postoperatoria
<ol><li>Posizionare le larve maschili (L6D4) sul ghiaccio per 10-30 minuti per tenerle anestetizzate durante l'operazione.</li>
	<li>Posizionare una larva sul vassoio di cera con il lato dorsale verso l'alto, quindi fissare la testa e la coda della larva con spilli e fili, mostrando l'area chirurgica che è la superficie dorsale sul 9 ° segmento del corpo (Figura 3A).</li>
	<li>Disinfettare l'area chirurgica applicando la tintura di iodio al 3% con un batuffolo di cotone sull'epidermide (9 ° segmento del corpo), seguito da alcol al 70% per rimuovere lo iodio (Figura 3B). NOTA: Concentrarsi sulla larva attraverso la regolazione grossolana e fine del microscopio chirurgico (Figura 3C). Posizionare il vassoio di cera su un piatto di coltura più grande pieno di ghiaccio per mantenere l'anestesia.</li>
	<li>Fai un'incisione lunga 2 mm sull'epidermide dorsale del 9 ° segmento del corpo. Successivamente, utilizzare un batuffolo di cotone sterile per rimuovere eventuali perdite di emolinfa e corpi grassi e ottenere una visione chiara dell'area chirurgica. NOTA: È importante evitare il cuore durante la procedura. Questo può essere fatto facendo l'incisione leggermente vicino alla linea mediana nel 9 ° segmento del corpo o all'articolazione tra il 9 ° e il 10 ° segmento del corpo per evitare che i testicoli fuoriescano a causa della pressione interna larvale. Durante l'utilizzo del bisturi, fare prima una fessura verticale con la lama (Figura 4A), quindi ruotarla di 45 ° verso l'epidermide prima di tagliare uniformemente e continuamente l'epidermide (Figura 4B).</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta chirurgica per inserire un foglio di alluminio tra i testicoli (Figura 5).</li>
	<li>Alla fine dell'intervento chirurgico, chiudere l'incisione per evitare l'infezione e consentire alle larve di riprendersi dall'intervento chirurgico.<ol>
<li>Chiudere l'epidermide con una sutura in esecuzione (Figura 6).</li>
		<li>Utilizzare un portaago e una pinzetta chirurgica per legare un nodo quadrato chirurgico, richiedendo due nodi semplici a immagine speculare opposti (Figura 6D, E).</li>
		<li>Usa le forbici per tagliare la sutura in eccesso dalle code del cappio, lasciando dietro di sé un filo di 2 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo la sutura, posare delicatamente la larva nella scatola di allevamento e mantenerla in una camera di simulazione ambientale pulita. Continua a osservare le larve. NOTA: La ferita smette di perdere emolinfa e le larve si riprendono gradualmente dopo l'intervento chirurgico. I vermi continuano a completare la loro metamorfosi.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig02.jpg"> Figura 2: Barriera fisica preparata utilizzando un foglio di alluminio (1 mm x 2 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig03.jpg"> Figura 3: Prima dell'incisione. (A) Fissare la larva. (B) Disinfezione dell'epidermide dell'area chirurgica. C) Esecuzione di interventi chirurgici al microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig04.jpg"> Figura 4: Incisione. (A) Tagliare le larve verticalmente con la lama. (B) Ruotare la lama di 45° verso l'epidermide prima di tagliarla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig05.jpg"> Figura 5: Inserimento della barriera fisica (foglio di alluminio) tra i testicoli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig06.jpg"> Figura 6: Sutura. (A) Inserire l'ago. (B) Ritirare l'ago. (C) Prelevare e bloccare l'ago. (D) Legare il primo nodo semplice. (E) Legare il nodo semplice opposto con immagini speculari. (F) Tagliare il filo di sutura in eccesso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Dopo aver ostruito microchirurgicamente la fusione dei testicoli in Spodoptera litura, il numero di fasci di spermatozoi è diminuito, il che ha supportato l'ipotesi che questa fusione sia benefica per la capacità riproduttiva. La manipolazione chirurgica è stata utilizzata per studiare lo sviluppo fisiologico degli insetti sin dall'inizio del 20 ° secolo. Per determinare se il nervo cranico è regolato dalla metamorfosi degli insetti, alcuni ricercatori hanno eseguito procedure come la legatura e la de...

La fusione è un fenomeno comune nello sviluppo di tessuti o organi. Gli esempi includono la chiusura dorsale e la chiusura del torace in Drosophila1 e morfogenesi del palato, morfogenesi del tubo neurale e morfogenesi cardiaca in topi e polli2. CRISPR e RNAi sono stati applicati per studiare i ruoli dei geni nel processo di fusione2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) è un parassita polifago dannoso che è ampiamente distribuito nelle aree tropicali e subtropicali dell'Asia, tra cui la Cina4,5,6. L'ampia distribuzione di S. litura è in parte attribuita alla sua potente capacità riproduttiva, che è rilevante per lo sviluppo delle gonadi. L'infertilità maschile è un approccio per controllare questo parassita. Come mostrato nella figura schematica della struttura testicolare, i testicoli sono racchiusi dalla guaina testicolare, compresa la guaina esterna (guaina peritoneale) e la lamina basale interna. La lamina basale si estende internamente per formare l'epitelio follicolare e separa l'area interna del testicolo in quattro camere chiamate follicoli (Figura 1).
Nei follicoli, gli spermatogoni si sviluppano in spermatozoi dopo mitosi e meiosi, e quindi gli spermatozoi nelle sacche spermatiche si allineano nella stessa direzione per formare fasci di spermatozoi7. Durante la spermatogenesi, gli spermatociti primari si differenziano in spermatozoi eupireni o spermatozoi apireni. Gli spermatociti nella fase larvale si sviluppano in spermatozoi eupireni con una lunga coda collegata a una testa di un nucleo allungato; questi possono fecondare le uova. Al contrario, gli spermatociti nella fase mid-pupal si sviluppano in spermatozoi apireni con un nucleo scartato; questi spermatozoi aiutano la sopravvivenza, il movimento e la fecondazione degli spermatozoi eupireni9,10. Il 6 ° giorno della pupa è il periodo durante il quale i testicoli hanno abbondanti fasci di spermatozoi eupirene e apirene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma schematico della struttura testicolare degli insetti lepidotteri11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La fusione testicolare si verifica nella maggior parte degli insetti dell'ordine dei lepidotteri11,12, specialmente in quelle specie che sono parassiti agricoli. La fusione testicolare si riferisce a una coppia di testicoli che crescono bilateralmente nella fase larvale, avvicinandosi e aderendo l'uno all'altro, integrandosi infine in una singola gonade11. In Spodoptera litura, accade durante la metamorfosi dallo stadio larvale a quello pupale. Dal giorno 1 del 5 ° instar (L5D1) al giorno 4 del 6 ° instar (L6D4), la coppia di testicoli cresce gradualmente di dimensioni e il colore diventa giallo chiaro da bianco avorio. Diventa rosso tenue quando raggiunge la fase prepupale (da L6D5 a L6D6). Due testicoli simmetrici bilaterali si avvicinano l'un l'altro durante lo stadio prepupale, si fondono in uno e ruotano in senso antiorario (vista dorale) per produrre un singolo testicolo nelle fasi pupale e adulta11. Questo fenomeno non si verifica nei bachi da seta, che hanno una notevole importanza economica e sono stati addomesticati per 5000 anni13. Pertanto, si presume che la fusione dei testicoli migliori la capacità riproduttiva.
Per determinare il significato della fusione testicolare di Spodoptera litura , è importante indagare gli effetti del blocco del processo. In questo protocollo, il foglio di alluminio è stato inserito microchirurgicamente tra i testicoli per tenerli separati e sono stati studiati i conseguenti cambiamenti nello sviluppo degli insetti e dei loro testicoli.

<table><tbody><tr><td>75% Alcol denaturato</td><td>Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd</td><td>Q/370285HNW 001-2019</td><td></td></tr><tr><td>Puntine colorate</td><td>Deli Group Co., LTD</td><td>0042</td><td></td></tr><tr><td>Forbici corneali</td><td>Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd</td><td>MR-S221A</td><td>Punta curva e smussata</td></tr><tr><td>Glad Foglio di alluminio</td><td>Clorox Cina (Guangzhou) Limited</td><td>831457</td><td>10 cm * 2,5 cm * 0,6</td></tr><tr><td>Tamponi di cotone medici (sterili)</td><td>Winner Medical Co., Ltd.</td><td>601-022921-01</td><td></td></tr><tr>Medico<td>Iodio Cotton Swab</td><td>Winner Medical Co., Ltd.</td><td>608-000247</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.</td><td>J32030</td> Lama chirurgica sterile <td>con ago sottile da 14 cm</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD</td> <td># 11</td><td></td></tr><tr><td>Suigical Blade Holder</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD</td><td>K6-10</td><td>Filo di sutura dritto 3 #</td></tr> <tr><td>con ago</td><td>Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd</td><td></td><td>ago: 3/8 cerchio, 2,5 * 8; Filettatura: Nylon, 6/0, 25 cm</td></tr><tr><td>Pinze per legatura</td><td>Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd</td><td>MR-F201T-3</td><td>Punta diritta; manico lungo; testa larga 0,12 mm</td></tr></tbody></table>

ostruzione microchirurgica della fusione dei testicoli in spodoptera litura

Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura

Invece di utilizzare metodi genetici come l'interferenza dell'RNA (RNAi) e le brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) / endonucleasi associate a CRISPR Cas9, una barriera fisica è stata inserita microchirurgicamente tra i testicoli di Spodoptera litura per studiare l'impatto di questa microchirurgia sulla sua crescita e riproduzione. Dopo aver inserito un foglio di alluminio tra i testicoli, la muta degli insetti durante la metamorfosi procedeva normalmente. La crescita e lo sviluppo degli insetti non sono stati notevolmente alterati; tuttavia, il numero di fasci di spermatozoi è cambiato se la fusione dei testicoli è stata interrotta dalla microchirurgia. Questi risultati implicano che il blocco della fusione testicolare può influenzare la capacità di riproduzione maschile. Il metodo può essere ulteriormente applicato per interrompere la comunicazione tra gli organi per studiare la funzione di specifiche vie di segnalazione. Rispetto alla chirurgia convenzionale, la microchirurgia richiede solo l'anestesia congelante, che è preferibile all'anestesia con anidride carbonica. La microchirurgia riduce anche al minimo l'area del sito chirurgico e facilita la guarigione delle ferite. Tuttavia, la selezione di materiali con funzioni specifiche richiede ulteriori indagini. Evitare lesioni tissutali è fondamentale quando si praticano incisioni durante l'operazione.

Gli effetti della microchirurgia sulla crescita e lo sviluppo di Spodoptera litura La microchirurgia ha lasciato una ferita lunga 2 mm sull'epidermide larvale dorsale che alla fine ha smesso di perdere emolinfa ed è guarita. Le larve hanno attraversato fasi prepupali e pupali e si sono chiuse, indicando che la microchirurgia non ha avuto un impatto importante sulla crescita e sullo sviluppo. Quando le larve si sono fuse in pupe, i fili di sutura sono stati s...

Il foglio di alluminio è stato inserito microchirurgicamente tra i testicoli di Spodoptera litura per ostruire la fusione del testicolo. La procedura include congelamento, fissaggio, disinfezione, incisione, posizionamento della barriera, sutura, alimentazione postoperatoria e ispezione. Questo approccio fornisce un metodo per interferire con la formazione dei tessuti.

Ostruzione microchirurgica della fusione dei testicoli in Spodoptera litura

Instead of using genetic methods like RNA interference (RNAi) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated ...

Questo protocollo suggerisce che un metodo fisico può essere adottato per aiutare a capire i problemi biologici. Questa tecnica fornisce un metodo per posizionare materiale negli insetti con un'incisione minima e studiare l'influenza della microchirurgia sullo sviluppo degli individui. Questo metodo può essere applicato ad altre larve di lepidotteri e ad altre parti degli insetti, tra cui la testa e il torace.È molto importante esercitarsi a fare incisioni in determinati materiali e suturare abilmente. Inizia posizionando le larve maschili di Spodoptera litura al giorno 4 del 6 ° instar, o L6D4, sul ghiaccio per 10-30 minuti per tenerle anestetizzate durante l'operazione. Posizionare la larva anestetizzata sul vassoio di cera con il lato dorsale verso l'alto.Fissare la testa e la coda della larva con spilli e fili e disinfettare l'area chirurgica applicando la tintura di iodio al 3% con un batuffolo di cotone sull'epidermide, seguito da alcool al 70%. Fai un'incisione lunga 2 millimetri sull'epidermide dorsale al 9 ° segmento del corpo e usa un batuffolo di cotone sterile per rimuovere l'emolinfa che perde e i corpi grassi per ottenere una visione chiara dell'area chirurgica. Utili

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Drosophila melanogaster testicoli possono essere rapidamente ed efficacemente isolato da maschi adulti con aghi dissezione. Con la pratica, si può facilmente isolare in uno o due giorni una quantità di testicoli sufficiente per l'analisi del DNA o RNA mediante sequenziamento throughput elevato o più tradizionali metodi di biologia molecolare o di proteine ​​per i test degli anticorpi-o a base di enzimi.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

Metodi per isolare e preparare Drosophila testicoli campioni (vivere e fissa) per l'imaging dal contrasto di fase e microscopia a fluorescenza sono descritte qui.

L&#39;analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicoli

Questo articolo descrive microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo come una tecnica di trasfezione per le cellule testicolari di topo per studiare processi unici di spermatogenesi. Il protocollo presentato prevede fasi di preparazione capillare di vetro, microiniezione attraverso il dotto efferente, e trasfezione mediante elettroporazione.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

Questo protocollo descrive la dissezione e la coltivazione di testicoli intatti e cisti germinali da pupe di Drosophila melanogaster. Questo metodo consente l'osservazione microscopica della spermatogenesi ex vivo. Inoltre, descriviamo un saggio farmacologico dell'effetto degli inibitori su specifici stadi dello sviluppo delle cellule germinali nei testicoli delle pupe.

Ex vivo Cultura della Drosophila pupa testicolo e singolo maschio cisti germinale: Dissezione, Imaging, e trattamento farmacologico

In questo protocollo, descriviamo la selezione e la preparazione delle celle appropriate per micromanipolazione e l'uso di un micromanipolatore piezoelettrico per riposizionare i cromosomi all'interno di quelle cellule.

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Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'integrità di barriera ematotesticolare iniettando inulina-FITC in testicoli. Si tratta di un metodo efficiente in vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare che può essere compromessa da elementi genetici e ambientali.

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In questo protocollo, vengono descritti metodi per lo svolgimento di consanguineità croci e per valutare il successo di quelle croci, per la formica Vollenhovia emeryi. Questi protocolli sono importanti per esperimenti volti a comprendere le basi genetiche dei sistemi di determinazione del sesso in imenotteri.

Induzione e la valutazione di Inbreeding croci utilizzando la formica, Vollenhovia Emeryi

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Impara la tecnica microchirurgica per bloccare la fusione testicolare in Spodoptera litura. Questo metodo minimamente invasivo permette di studiare la comunicazione tra organi e le vie di segnalazione negli insetti.

Ostruzione microchirurgica della fusione dei testicoli in Spodoptera litura

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