Analisi del volume dei linfonodi mediante imaging ecografico ad altissima frequenza nel modello murino geneticamente modificato braf/Pten del melanoma

Il nostro metodo consente di monitorare l'aumento del coinvolgimento metastatico dei linfonodi inguinali misurando l'aumento del loro volume. Questo metodo non invasivo è molto ben tollerato, pertanto è possibile programmare più sessioni di imaging sullo stesso animale sperimentale nel corso di due settimane. Questo metodo è ideale per valutare l'impatto del trattamento farmacologico sulla malattia metastatica.

Abbiamo applicato questo metodo al modello di melanoma Braf / Pten, ma in linea di principio può essere adattato per valutare l'efficacia di vari farmaci in una varietà di modelli murini preclinici di cancro metastatico. A dimostrare la procedura saranno la Dott.ssa Marianna Vitiello, post-doc del mio laboratorio, e la Dott.ssa Claudia Kusmic, collega ricercatrice presso l'IFC-CNR. Per l'induzione del melanoma, applicare tre microlitri di 4-idrossitamoxifene a cinque millimolari su circa un centimetro quadrato di pelle rasata della parte superiore della schiena per tre giorni consecutivi.

Sei settimane dopo la verniciatura della pelle, utilizzare le pinze per misurare il volume del tumore primario e, infine, delle metastasi sottocutanee. Quindi, utilizzare l'imaging ad ultrasuoni per misurare il volume dei linfonodi inguinali. Dopo aver analizzato il tumore primario e i linfonodi mediante ispezione visiva, asportareli per studi istologici.

Dopo aver confermato l'anestesia, trasferire l'animale su una scheda riscaldata della stazione di imaging ad ultrasuoni ad altissima frequenza, tenendo l'animale in posizione supina. Regolare la temperatura della scheda utilizzando una sonda rettale lubrificata con vaselina per mantenere la temperatura corporea del mouse nell'intervallo fisiologico. Rivestire le zampe anteriori e posteriori con pasta conduttiva e fissarle agli elettrodi della piastra ECG incorporati nella scheda.

Verificare che i parametri fisiologici siano correttamente acquisiti e visualizzati. Rimuovere i peli da entrambe le aree inguinali applicando un agente depilatorio e rivestirli con un mezzo di accoppiamento acustico. Quindi, bloccare la sonda lineare ad ultrasuoni ad altissima frequenza in un motore 3D specializzato incorporato nella stazione di imaging, consentendo un movimento automatizzato e graduale della sonda.

Orientare e regolare correttamente la posizione della sonda ad ultrasuoni per ottenere immagini a breve accesso del linfonodo inguinale e posizionare la regione di interesse della zona focale. Impostare la distanza di scansione tra due e cinque millimetri, la dimensione del passo a 44 micrometri con un risultato da 46 a 114 passaggi di scansione per fetta di linfonodo e un tempo di acquisizione da uno a tre minuti per animale. Scansiona l'intero volume del linfonodo inguinale come una sequenza di immagini 2D in modalità B, acquisendo immagini a più livelli mediante movimento lineare del trasduttore con dimensioni del passo su scala micrometrica per generare dati 3D in termini di respirazione e loop cine-dipendenti cardiaci.

Dopo l'imaging, memorizza digitalmente le immagini acquisite in formato raw per ulteriori analisi offline. Per la post-elaborazione delle immagini ad ultrasuoni, aprire il set di dati delle immagini dei linfonodi inguinali 3D, selezionare il metodo multi-slice e premere il pulsante Start per visualizzare sia i fotogrammi correnti che le miniature di tutti i fotogrammi corrispondenti a ciascuna immagine acquisita durante l'acquisizione 3D. Selezionate la miniatura del primo fotogramma in cui il linfonodo è evidente per caricarlo nella vista di contornatura.

Nella vista di contornatura, fare clic con il pulsante sinistro del mouse per rilasciare i punti lungo il bordo del linfonodo. Una volta impostato il numero desiderato di punti, leccare a destra per completare il contorno. Una volta completato il primo contorno, utilizzate la vista miniatura per selezionare l'immagine successiva per il contorno.

Se necessario, saltare diverse immagini tra i contorni per ridurre il numero di tracce manuali necessarie per ogni volume 3D. Ripeti questo processo fino a quando l'intero volume non è stato delineato, quindi fai clic su Fine. Nell'area di lavoro della finestra della modalità 3D, fare clic sull'icona di misurazione del volume sotto l'area di visualizzazione dell'immagine per visualizzare il valore numerico del volume dei linfonodi e attivare la vista della superficie con il rendering 3D del volume dei linfonodi.

Il trattamento dei topi con 4-idrossitamoxifene induce l'attività enzimatica creER, causando un passaggio a livello genomico da Braf wild-type a Braf V600E mutato, mentre Pten viene perso. Quattro settimane dopo il trattamento con 4-idrossitamoxifene, i tumori primari raggiungono un volume da 50 a 100 millimetri cubi e la loro crescita può essere misurata da calibri per altre due settimane, mostrando così un graduale aumento della pigmentazione osservata nei linfonodi inguinali. I depositi di melanina sono invariabilmente dovuti alla presenza di cellule di melanoma metastatizzate, come confermato dalla colorazione immunoistochimica dell'antigene del melanoma MelanA e Braf V600E.

Alla fine della fase di segmentazione, tutte le sezioni hanno mostrato la sovrapposizione del contorno esterno del linfonodo. I rendering 3D di un linfonodo inguinale destro, analizzati a quattro, cinque e sei settimane dopo il trattamento 4-HT sono mostrati qui. È stato anche quantificato l'aumento di volume dei linfonodi inguinali sinistro e destro dello stesso animale nel tempo.

Si raccomanda di accoppiare l'imaging ecografico con un'appropriata colorazione immunoistochimica, in modo che la presenza di cellule tumorali sia confermata a livello molecolare. Oltre ai linfonodi, anche il volume delle metastasi sottocutanee può essere monitorato nel tempo utilizzando l'imaging ad ultrasuoni. Se il periodo di tempo di due settimane è troppo breve per apprezzare gli effetti del farmaco in studio, selezionare un sito di induzione più periferico o un genotipo meno incline al tumore.