Ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi

Il fegato è un sito primario per il trapianto nel contesto clinico delle isole umane. Il trapianto di isole intraepatiche di topo è tecnicamente impegnativo e un'alta percentuale di topi potrebbe morire per complicazioni chirurgiche, in particolare sanguinamento. In questo studio, i due metodi che abbiamo mostrato entrambi potrebbero prevenire efficacemente la morte del topo indotta dal sanguinamento.

Il nostro metodo può essere applicato alla ricerca sul cancro al fegato e altre malattie del fegato consentendo l'iniezione di cellule tumorali, cellule staminali mesenchimali ed epatociti direttamente al fegato. Per iniziare, stacca una cultura di isole umane con delicati graffi. Utilizzare una siringa da 1 centimetro cubo per raccogliere da 300 a 350 isole in tubi sterili da 1,5 millilitri microcentrifuga sul ghiaccio.

Quando tutte le isole sono state raccolte, centrifugare i tubi per 10 secondi per sedimentare le cellule. Scartare tutti tranne un piccolo volume di surnatante per prevenire la perdita di pellet e risospesciare le isole in 200 microlitri HBSS contenenti il 5% di BSA. Caricare le isole risospese in una siringa da insulina da 5 millilitri e ruotare l'ago della siringa per 1 minuto per lasciare che le isole si depositino allo stantuffo.

Premere lo stantuffo per rimuovere eventuali bolle, mantenendo circa 100-150 microlitri di soluzione nella siringa e invertire la siringa con un tocco delicato per distribuire uniformemente le isole. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, applicare un unguento agli occhi per evitare l'essiccazione. Rasare l'addome del topo anestetizzato per rimuovere la pelliccia e disinfettare l'area chirurgica con tre salviette alternate di 2% di iodio e 75% di alcol.

Quindi, fare un'incisione da 1 a 1,5 centimetri nell'addome e aprire la cavità peritoneale. Posizionare un pezzo sterile di garza intorno all'incisione e utilizzare pinze o punte di cotone per trasferire delicatamente l'intestino sulla garza. Coprire quindi l'intestino con un pezzo di garza imbevuta di soluzione salina ed esporre la vena porta.

Per fermare il sanguinamento indotto dal trasferimento di isole utilizzando schiuma gel, tenere l'ago con la smussatura rivolta verso il basso e posizionare la punta dell'ago con l'apertura parallela alla parete della vena porta prima di inserire l'ago nella vena porta. Ritrarre lo stantuffo per aspirare da 20 a 50 microlitri di sangue nella siringa per mescolarli con le isole prima di infondere le isole nella vena porta mentre si deprime e si ritrae ripetutamente lo stantuffo. Quando tutte le isole sono state consegnate, posizionare un pezzo di schiuma gel di circa 5 per 5 centimetri sul sito di iniezione.

Utilizzare una punta di cotone per premere la schiuma di gel verso il basso mentre si rimuove l'ago dalla vena porta. Tenere il gel in posizione per circa 2 minuti, arrotolando la schiuma gel per assicurarsi che copra la vena porta. Una volta fermato il sanguinamento, riportare delicatamente l'intestino nella cavità peritoneale nella posizione originale e iniettare 500 microlitri di soluzione salina calda nella cavità addominale.

Utilizzare suture per chiudere gli strati muscolari e cutanei. Quindi posizionare il mouse in una gabbia pulita su una piastra riscaldante con monitoraggio fino al completo recupero dall'anestesia, somministrando analgesia ogni 12 ore e riscaldare per 48 ore. Per fermare il sanguinamento indotto dal trasferimento di isole usando un cuscinetto di grasso, dopo aver esposto la vena porta come dimostrato, utilizzare due punte di cotone per tenere la vena esposta sui lati sinistro e destro e individuare il cuscinetto di tessuto adiposo tra il duodeno e la vena porta.

Penetrare il cuscinetto di grasso con la punta dell'ago prima dell'inserimento nella vena porta. Infondere gli isolotti nella vena porta come dimostrato. Quando tutte le isole sono state consegnate, premere il tessuto adiposo con una punta di cotone per circa 1 minuto mentre si rimuove l'ago dalla vena.

Quindi riportare l'intestino nella cavità addominale ed eseguire il resto delle procedure di cura postchirurgica come dimostrato. Gli effetti del trapianto di isole sono dose-dipendenti, poiché la glicemia normale si osserva 30 giorni dopo il trapianto di isole sinergiche quando vengono trasferite 500 isole, ma si osserva solo normoglicemia transitoria quando vengono consegnate 250 isole, con i topi che ritornano all'iperglicemia entro 10 giorni dopo il trapianto. Un aumento del peso corporeo è osservato in entrambi i gruppi e risposte identiche osservate quando le isole umane vengono trapiantate in topi diabetici NOD-SCID, con normoglicemia osservata quando viene trapiantato un numero maggiore di equivalenti di isole ma non numeri più piccoli.

La maggior parte dei topi che hanno sanguinamento dopo il trasferimento muoiono dopo l'intervento chirurgico, mentre i topi senza sanguinamento sopravvivono. A 28 giorni dopo il trapianto, la colorazione dell'insulina rivela una distribuzione uniforme dell'isolotto umano in tutto il fegato, per lo più vicino ai vasi sanguigni. Oltre all'insulina, la fibrina e la filtrazione delle cellule polimorfonucleate sono osservate anche all'interno delle isole umane trapiantate.

Il trapianto di isole intraepatiche genererà un grande foro nella vena porta che può causare sanguinamento. L'utilizzo delle nostre due procedure migliorate può prevenire il sanguinamento e ridurre la mortalità dopo il trapianto di isole. Il modello di trapianto intraportale di isole può imitare il trapianto clinico di isole umane.

Le nostre procedure raffinate possono portare a tassi di sopravvivenza più elevati per i riceventi, che consentono ulteriori studi sulla funzione delle isole dopo il trapianto.