Name: Ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Scopri tecniche chirurgiche raffinate per il trapianto intraepatico di isole nel topo, riducendo il sanguinamento post-infusivo e la mortalità. Questi metodi migliorano la sicurezza per studi sul diabete e malattie epatiche.

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Questo studio è stato supportato dal Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR& D Merit I01BX004536) e dal National Institute of Health concede # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, a HW. Vorremmo ringraziarvi mr. Michael Lee e Ms. Lindsay Swaby per l'editing linguistico

Tutte le procedure sono state condotte con l'approvazione dei comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali presso la Medical University of South Carolina e il Ralph H Johnson Medical Center di Charleston.
1. Induzione del diabete con streptozotocina (STZ)
<ol><li>Preparazione dei topi riceventi:<ol>
<li>Pesare tutti i topi individualmente.</li>
		<li>Controllare i livelli di glucosio nel sangue da un campione di sangue della vena della coda utilizzando un glucometro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinazione della dose STZ per tre diversi scenari:<ol>
<li>Per i topi con steatosi epatica iniettare una dose di STZ [40 mg/kg/die, iniezione intraperitoneale (i.p.)] per 5 giorni consecutivi.</li>
		<li>Per i topi NOD-SCID iniettare 125 mg/kg di STZ, iniezione singola, cioè dopo digiuno notturno.</li>
		<li>Per i topi C57BL/6 iniettare 225 mg/kg di STZ, iniezione singola, i.p.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcoli per STZ (13,5 mg/mL): NOTA: Questo calcolo è per cinque topi C57BL/6 con pesi corporei di 30 g:<ol>
<li>Pesi corporei totali: 5 topi x 30 g/mouse = 150g</li>
		<li>STZ necessario: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione STZ:<ol>
<li>Pesare l'STZ seguendo la dose precalcolata.</li>
		<li>Trasferire la polvere STZ pesata in un becher da 10 ml su ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 3 mL di soluzione di citrato di sodio al becher per sciogliere l'STZ.</li>
		<li>Mescolare bene, filtrare sterilizzare attraverso un poro di 0,22 μm e utilizzare la soluzione STZ entro 10 minuti dalla preparazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniezione STZ:<ol>
<li>Caricare la quantità desiderata di soluzione STZ (sufficiente per un mouse) in una siringa da 1 mL.</li>
		<li>Eseguire l'iniezione intraperitoneale nel quadrante inferiore destro dell'addome del topo.</li>
		<li>Osservare i topi per 5 minuti dopo l'iniezione e verificare eventuali segni di disagio durante questo periodo di tempo prima di rimetterli nelle gabbie.</li>
		<li>Monitorare il livello di glucosio nel sangue da un campione di sangue della vena della coda utilizzando un glucometro ogni giorno dopo l'iniezione di STZ. NOTA: In questo esperimento, i topi sono considerati diabetici quando la glicemia non a digiuno è > 350 mg / dL per due giorni consecutivi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione dell'isolotto
NOTA: le isole umane sono state coltivate in mezzi CMRL-1066 integrati con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (P/S) ad una densità di 10.000 isole equivalenti (IEQ) per piatto di coltura cellulare da 100 mm9. Le isole di topo sono state coltivate in DMEM con il 10% di FBS e l'1% di P/S con la stessa densità13. I topi maschi NOD-SCID e C57BL/7 tra le 6-10 settimane di età sono stati ottenuti da fonti commerciali.
<ol><li>Staccare gli isolotti coltivati dal piatto di coltura cellulare con un leggero graffio.</li>
	<li>Selezionare a mano il numero desiderato di isole (ad esempio, 300-350 isole) utilizzando una siringa da 1 cc e metterle in tubi microcentrifuga sterili da 1,5 ml sul ghiaccio.</li>
	<li>Ruotare il tubo per 10 secondi usando la microcentrifuga.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante, lasciando un po' di liquido per evitare di perdere il pellet.</li>
	<li>Sospendere il pellet in 200 μL di HBSS con lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA).</li>
	<li>Aspirare le isole risospese in una siringa da insulina da 0,5 ml.</li>
	<li>Posizionare la siringa in posizione verticale. Lascia che gli isolotti affondino per 1 minuto.</li>
	<li>Spingere la siringa per rimuovere tutte le bolle, lasciando circa 100-150 μL di liquido contenente isole.</li>
	<li>Posizionare la siringa a testa in giù e picchiettare delicatamente il lato della siringa per consentire alle isole di distribuirsi equamente in tutto il liquido. Le isole sono ora pronte per l'iniezione.</li>
</ol>3. Trapianto di isole
<ol><li>Indurre e mantenere il topo in anestesia generale con il 2% di isoflurano. Controllare la mancanza di riflessi del pedale per garantire una corretta anestesia dell'animale.</li>
	<li>Rasare e rimuovere la pelliccia nella zona dell'addome del mouse.</li>
	<li>Somministrare una singola dose pre-operatoria di Buprenorfina (0,1 mg/kg p.p.).</li>
	<li>Disinfettare l'area chirurgica con tre salviette alternate di iodio al 2% e alcol al 75%.</li>
	<li>Eseguire una laparotomia con micro forbici per generare un'incisione di 1-1,5 cm.</li>
	<li>Aprire la cavità peritoneale con un riavvolgitore. Seguire con il metodo A o il metodo B come descritto di seguito.</li>
</ol>4. Metodo A: (smettere di sanguinare con schiuma gel, Figura 1A)14,15,16
<ol><li>Preparazione del mouse<ol>
<li>Posizionare una garza sterile intorno all'incisione.</li>
		<li>Estrarre delicatamente l'intestino usando una pinza e tenerlo sulla garza.</li>
		<li>Identificare la vena porta dalla sua posizione ed esporla bene.</li>
		<li>Coprire l'intestino con una garza calda umido salino durante l'intero intervento chirurgico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inserire l'ago della siringa per insulina precaricato sull'isolotto attraverso la vena porta vicino al duodeno (Figura 1B). Per fare ciò, tenere l'ago con il foro (smussatura) rivolto verso il basso e posizionare l'angolo della superficie di apertura parallelo alla parete della vena porta prima di penetrare attraverso la parete.<ol>
<li>Tirare lo stantuffo per prelevare un po ' di sangue (20-50 μL) nella siringa per mescolare prima le isole.</li>
		<li>Infondere lentamente gli isolotti nella vena porta mentre si tira e si spinge ripetutamente il tuffo.</li>
		<li>Posizionare un pezzo di schiuma gel (circa 0,5 cm x 0,5 cm di dimensione) per coprire il sito di iniezione.</li>
		<li>Premere la schiuma di gel verso il basso con una punta di cotone mentre si estrae l'ago dalla vena porta.</li>
		<li>Continuare a premere sul gel per circa 2 minuti per confermare che non vi è alcun sanguinamento attivo.</li>
		<li>Capovolgere la punta di cotone sopra e lontano dalla schiuma di gel per assicurarsi che la schiuma di gel copra bene la vena porta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Metodo B: (smettere di sanguinare con cuscinetto di grasso, Figura 1C)17
<ol><li>Esporre accuratamente la vena porta.<ol>
<li>Utilizzare due punte di cotone per tenere la vena porta esposta sia dal lato sinistro che da quello destro.</li>
		<li>Identificare il cuscinetto di tessuto adiposo tra il duodeno e la vena porta.</li>
		<li>Penetrare attraverso il cuscinetto di grasso prima di inserire l'ago nella vena porta (Figura 1D).</li>
		<li>Infondere gli isolotti, seguendo la procedura simile sopra descritta nelle parti 4.2.1 e 4.2.2 del metodo A.</li>
		<li>Estrarre l'ago mentre si preme sul grasso con una punta di cotone.</li>
		<li>Continuare a premere sul cuscinetto grasso per 1 minuto dopo aver rimosso l'ago.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo aver confermato che non vi è alcun sanguinamento dalla vena porta, riportare delicatamente l'intestino nella cavità peritoneale nella sua posizione originale.</li>
	<li>Lasciare 0,5 ml di soluzione salina calda (36-37 °C) nella cavità addominale prima della chiusura. NOTA: La soluzione salina calda facilita il movimento e il recupero dell'intestino post-operatorio e previene la necrosi intestinale.</li>
	<li>Chiudere lo strato muscolare con una sutura 5-0.</li>
	<li>Chiudere lo strato di pelle con una sutura 4-0.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una gabbia pulita su una piastra riscaldante fino a completo recupero dall'anestesia.</li>
	<li>Continuare a fornire un analgesico (ad esempio, buprenorfina 0,1 mg / kg i.p.) ogni 12 ore e calore supplementare per 48 ore dopo l'intervento chirurgico. NOTA: La procedura di trapianto di isole richiede circa 15-20 minuti per essere completata.</li>
</ol>6. Colorazione H & E e fotografia dell'intera sezione epatica
<ol><li>Perfusione epatica<ol>
<li>Mettere il mouse in anestesia come descritto sopra nella parte 3.1.</li>
		<li>Esporre con attenzione la vena porta e tagliare la vena cava inferiore.</li>
		<li>Perfondere manualmente il fegato utilizzando 20 ml di paraformaldeide al 10% attraverso la vena porta per circa 5 minuti, utilizzando una siringa da 20 ml con ago da 25 G18. NOTA: La perfusione epatica può rimuovere il sangue dal tessuto epatico e migliorare la fissazione del fegato senza disturbare gli innesti di isole.</li>
		<li>Sezionare l'intero fegato perfuso da altri organi.</li>
		<li>Fissare il tessuto epatico perfuso in paraformaldeide al 10% per 24 ore.</li>
		<li>Incorporare il tessuto nella paraffina.</li>
		<li>Tagliare sezioni di tessuto di 5 μm di spessore ciascuna e metterle su un vetrino per la colorazione.</li>
		<li>Eseguire la colorazione di H&E, insulina, fibrina e neutrofili polimorfonucleati (PMN) utilizzando metodi standard15,16.</li>
		<li>Scansiona l'intera sezione epatica al microscopio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+the+art+of+islet+transplantation+and+cell+therapy+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetology%22%5BJournal%5D)">The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes.</a> Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).</li>
<li>Ballinger, W. F., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+intact+pancreatic+islets+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of intact pancreatic islets in rats.</a> Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).</li>
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<li>Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+to+islet+xenografts+in+a+concordant+rat-to-mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model.</a> Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).</li>
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<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+enhances+islet+engraftment+by+suppression+of+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction.</a> Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).</li>
<li>Gou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+suppresses+macrophage+activation+and+promotes+islet+graft+survival+after+intrahepatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. , (2020).</li>
<li>Contreras, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+protein+C+preserves+functional+islet+mass+after+intraportal+transplantation%3A+A+novel+link+between+endothelial+cell+activation%2C+thrombosis%2C+inflammation%2C+and+islet+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death.</a> Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).</li>
<li>Moberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue+factor+by+pancreatic+islet+cells+as+a+trigger+of+detrimental+thrombotic+reactions+in+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation.</a> Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).</li>
<li>Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+islet+transplant+in+the+mouse%3A+functional+and+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization.</a> Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+treatment+with+carbon+monoxide+can+yield+islet+allograft+survival+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance.</a> Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).</li>
<li>Desai, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liver+histopathology+on+islet+cell+engraftment+in+the+model+mimicking+autologous+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation.</a> Islets. 9 (6), 140-149 (2017).</li>
<li>Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+formulations+of+thrombomodulin+increase+engraftment+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).</li>
<li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin+improves+early+outcomes+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).</li>
<li>Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatoparenchymal+clearance+of+indocyanine+green+in+infectious+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Giornale+di+Malattie+Infettive+e+Parassitarie%22%5BJournal%5D)">Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis.</a> Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).</li>
<li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+transplantation+of+pancreatic+islets+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stem+cell+and+islet+cotransplantation%3A+Safety+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).</li>
</ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

In questo studio, sono state dimostrate due procedure migliorate che possono prevenire il sanguinamento e possono ridurre la mortalità del topo durante l'IIT del topo. Questo studio consente ai ricercatori di visualizzare il modello di trapianto di isole che è unico nello studio della risposta infiammatoria istantanea mediata dal sangue dopo il trapianto. Il modello IIT è un modello distintivo per lo studio della sopravvivenza delle cellule insulari e delle lesioni ischemiche epatiche in risposta al trapianto di <sup cla...

Il trapianto intraportale di isole (IIT) attraverso la vena porta è il metodo più comunemente usato per il trapianto di isole umane in contesti clinici. Il modello IIT murino offre una grande opportunità per studiare il trapianto di isole e testare approcci interventistici promettenti che possono migliorare l'efficacia del trapianto di isole1. IIT è stato descritto per la prima volta nel 1970 e utilizzato da diversi gruppi1,2,3,4,5. Ha riacquistato popolarità dopo la svolta nel trapianto di isole umane nell'anno 20006,7. Tuttavia, la maggior parte degli studi sul trapianto di isole ha utilizzato la capsula renale come sito preferito per il trapianto sperimentale di isole grazie al suo facile successo. Al contrario, l'IIT è più tecnicamente impegnativo e meno frequentemente utilizzato per gli studi sui trapianti di isole8,9. A differenza dell'IIT, tuttavia, le isole trapiantate sotto la capsula renale non soffrono della reazione infiammatoria immediata mediata dal sangue caratterizzata da trombosi, infiammazione e ischemia del tessuto epatico, e quindi hanno una funzione migliore rispetto alle isole trapiantate nel fegato. Il modello di capsula renale, quindi, potrebbe non imitare completamente gli stress incontrati dalle isole nel trapianto di isole umane10,11,12.
Una delle principali complicanze dell'IIT nei topi è il sanguinamento dal sito di iniezione dopo il trapianto, che potrebbe causare il 10-30% della mortalità tra diversi ceppi di topo12. In questo articolo, sono stati sviluppati due approcci raffinati per fermare il sanguinamento in modo più rapido e sicuro e per ridurre la mortalità dei topi dopo un IIT. La dimostrazione visiva di questi dettagli raffinati aiuterà i ricercatori a identificare i passaggi chiave di questa procedura tecnicamente impegnativa. Inoltre, la posizione degli innesti di isole nel fegato del ricevente è stata determinata dall'esame istologico del tessuto epatico colorato di ematossilina ed eosina (H & E) (intera sezione) recante isole trapiantate.

<table><tbody><tr><td>10% Formalina neutra tamponata v/v</td><td>Fisher Scientific 23426796</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL con ago</td><td>AHS</td><td>AH01T</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 20 mL</td><td>BD</td><td>301031</td><td></td></tr><tr><td>25G x 5/8" Aghi ipodermici</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol, sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia animale sistema</td><td>VetEquip, Inc.</td><td></td><td></td>901806</tr><tr><td>Buprenorfina cloridrato, iniezione</td><td>Par Sterile Products, LLC</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Corning</td><td>15110CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, assoluto (200 proof), grado di biologia molecolare</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BP2818500</tr><tr><td>Forbici da micro dissezione extra fini 4" dritte e affilate</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle&nbsp; Glucometro</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle Strisce reattive per la glicemia</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam (spugna di gelatina assorbibile, USP)</td><td>Pharmacia & Upjohn Company</td><td>34201</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Graefe 4" punta extra delicata</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>Pad riscaldato</td><td>Amazon</td><td>B07HMKMBKM</td><td></td></tr><tr><td>Hegar-Baumgartner Porta aghi 5.25"</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>Siringa da insulina RS-7850</td><td></td></tr><tr><td>con ago calibro 27</td><td>BD</td><td>879588</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetti per la preparazione dello iodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina (P/S)</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Sutura in polipropilene 4-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8683</td><td></td></tr><tr><td>Sutura in polipropilene 5-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8661</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, soluzione endovenosa allo 0,9%</td><td>VWR</td><td>2B1322Q</td><td></td></tr><tr><td>Streptozocina (STZ)</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Telo chirurgico, sterile</td><td>Med-Vet International</td><td>DR1826</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta per tessuti</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr></tbody></table>

ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Sebbene il fegato sia attualmente accettato come sito di trapianto primario per le isole umane in contesti clinici, le isole vengono trapiantate sotto la capsula renale nella maggior parte degli studi di trapianto di isole precliniche di roditori. Questo modello è comunemente usato perché il trapianto di isole intraepatiche murine è tecnicamente impegnativo e un'alta percentuale di topi potrebbe morire per complicazioni chirurgiche, in particolare sanguinamento dal sito di iniezione post-trapianto. In questo studio, vengono dimostrate due procedure che possono ridurre al minimo l'incidenza di sanguinamento della vena porta post-infusione. Il primo metodo applica una spugna di gelatina emostatica assorbibile al sito di iniezione, e il secondo metodo prevede la penetrazione dell'ago per iniezione dell'isolotto attraverso il tessuto adiposo prima e poi nella vena porta utilizzando il tessuto adiposo come barriera fisica per fermare il sanguinamento. Entrambi i metodi potrebbero prevenire efficacemente la morte del topo indotta dal sanguinamento. Sono state presentate l'intera sezione epatica che mostra la distribuzione delle isole e l'evidenza di trombosi delle isole post-trapianto, una caratteristica tipica per il trapianto di isole intraepatiche. Questi protocolli migliorati perfezionano le procedure di trapianto intraepatico di isole e possono aiutare i laboratori a impostare la procedura per studiare la sopravvivenza e la funzione delle isole in contesti pre-clinici.

Abbiamo eseguito trapianti di isole singeniche e xenogeniche attraverso la vena porta. La funzione dell'innesto di isole è stata osservata in modo dose-dipendente in entrambi i modelli di trapianto di isole. Nel modello di trapianto di isole singeniche utilizzando topi C57BL/6, il trapianto di 250 isole ha portato a normoglicemia transitoria prima che i topi tornassero all'iperglicemia. I topi che ricevevano 500 isole hanno raggiunto e mantenuto la normoglicemia oltre i 30 giorni dopo il trapianto (F...

Qui presentiamo procedure chirurgiche raffinate sull'esecuzione con successo del trapianto intraportale di isole, una procedura chirurgica clinicamente rilevante ma tecnicamente impegnativa, nei topi.

Ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

Il fegato è un sito primario per il trapianto nel contesto clinico delle isole umane. Il trapianto di isole intraepatiche di topo è tecnicamente impegnativo e un'alta percentuale di topi potrebbe morire per complicazioni chirurgiche, in particolare sanguinamento. In questo studio, i due metodi che abbiamo mostrato entrambi potrebbero prevenire efficacemente la morte del topo indotta dal sanguinamento.Il nostro metodo può essere applicato alla ricerca sul cancro al fegato e altre malattie del fegato consentendo l'iniezione di cellule tumorali, cellule staminali mesenchimali ed epatociti direttamente al fegato. Per iniziare, stacca una cultura di isole umane con delicati graffi. Utilizzare una siringa da 1 centimetro cubo per raccogliere da 300 a 350 isole in tubi sterili da 1,5 millilitri microcentrifuga sul ghiaccio.Quando tutte le isole sono state raccolte, centrifugare i tubi per 10 secondi per sedimentare le cellule. Scartare tutti tranne un piccolo volume di surnatante per prevenire la perdita di pellet e risospesciare le isole in 200 microlitri HBSS contenenti il 5% di BSA. Caricare le isole risospese in una siringa da insulina da 5 millilitri e ruotare l'ago della siringa per 1 minuto per lasciare che le isole si depositino allo stantuffo.Premere lo stantuffo per rimuovere eventuali bolle, mantenendo circa 100-150 microlitri di soluzione nella siringa e invertire la siringa con un tocco delicato per distribuire uniformemente le isole. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, applicare un unguento agli occhi per evitare l'essiccazione. Rasare l'addome del topo anestetizzato per rimuovere la pelliccia e disinfettare l'area chirurgica con tre salviette alternate di 2% di iodio e 75% di alcol.Quindi, fare un'incisione da 1 a 1,5 centimetri nell'addome e aprire la cavità peritoneale. Posizionare un pezzo sterile di garza intorno all'incisione e utilizzare pinze o punte di cotone per trasferire delicatamente l'intestino sulla garza. Coprire quindi l'intestino con un pezzo di garza imbevuta di soluzione salina ed esporre la vena porta.Per fermare il sanguinamento indotto dal trasferimento di isole utilizzando schiuma gel, tenere l'ago con la smussatura rivolta verso il basso e posizionare la punta dell'ago con l'apertura parallela alla parete della vena porta prima di inserire l'ago nella vena porta. Ritrarre lo stantuffo per aspirare da 20 a 50 microlitri di sangue nella siringa per mescolarli con le isole prima di infondere le isole nella vena porta mentre si deprime e si ritrae ripetutamente lo stantuffo. Quando tutte le isole sono state consegnate, posizionare un pezzo di schiuma gel di circa 5 per 5 centimetri sul sito di iniezione.Utilizzare una punta di cotone per premere la schiuma di gel verso il basso mentre si rimuove l'ago dalla vena porta. Tenere il gel in posizione per circa 2 minuti, arrotolando la schiuma gel per assicurarsi che copra la vena porta. Una volta fermato il sanguinamento, riportare delicatamente l'intestino nella cavità peritoneale nella posizione originale e iniettare 500 microlitri di soluzione salina calda nella cavità addominale.Utilizzare suture per chiudere gli strati muscolari e cutanei. Quindi posizionare il mouse in una gabbia pulita su una piastra riscaldante con monitoraggio fino al completo recupero dall'anestesia, somministrando analgesia ogni 12 ore e riscaldare per 48 ore. Per fermare il sanguinamento indotto dal trasferimento di isole usando un cuscinetto di grasso, dopo aver esposto la vena porta come dimostrato, utilizzare due punte di cotone per tenere la vena esposta sui lati sinistro e destro e individuare il cuscinetto di tessuto adiposo tra il duodeno e la vena porta.Penetrare il cuscinetto di grasso con la punta dell'ago prima dell'inserimento nella vena porta. Infondere gli isolotti nella vena porta come dimostrato. Quando tutte le isole sono state consegnate, premere il tessuto adiposo con una punta di cotone per circa 1 minuto mentre si rimuove l'ago dalla vena.Quindi riportare l'intestino nella cavità addominale ed eseguire il resto delle procedure di cura postchirurgica come dimostrato. Gli effetti del trapianto di isole sono dose-dipendenti, poiché la glicemia normale si osserva 30 giorni dopo il trapianto di isole sinergiche quando vengono trasferite 500 isole, ma si osserva solo normoglicemia transitoria quando vengono consegnate 250 isole, con i topi che ritornano all'iperglicemia entro 10 giorni dopo il trapianto. Un aumento del peso corporeo è osservato in entrambi i gruppi e risposte identiche osservate quando le isole umane vengono trapiantate in topi diabetici NOD-SCID, con normoglicemia osservata quando viene trapiantato un numero maggiore di equivalenti di isole ma non numeri più piccoli.La maggior parte dei topi che hanno sanguinamento dopo il trasferimento muoiono dopo l'intervento chirurgico, mentre i topi senza sanguinamento sopravvivono. A 28 giorni dopo il trapianto, la colorazione dell'insulina rivela una distribuzione uniforme dell'isolotto umano in tutto il fegato, per lo più vicino ai vasi sanguigni. Oltre all'insulina, la fibrina e la filtrazione delle cellule polimorfonucleate sono osservate anche all'interno delle isole umane trapiantate.Il trapianto di isole intraepatiche genererà un grande foro nella vena porta che può causare sanguinamento. L'utilizzo delle nostre due procedure migliorate può prevenire il sanguinamento e ridurre la mortalità dopo il trapianto di isole. Il modello di trapianto intraportale di isole può imitare il trapianto clinico di isole umane.Le nostre procedure raffinate possono portare a tassi di sopravvivenza più elevati per i riceventi, che consentono ulteriori studi sulla funzione delle isole dopo il trapianto.

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Gli strumenti utilizzati per visualizzare la rigenerazione vascolare richiedono metodi per contrastare gli alberi vascolari. Questo film ha dimostrato una delicata tecnica di iniezione utilizzata per ottenere un contrasto ottimale degli alberi vascolari e illustra i potenziali benefici derivanti da un'analisi dettagliata del campione risultante utilizzando μCT e sezioni istologiche seriali.

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Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

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Un metodo per il trapianto dell'isolotto al omento in Mouse

Trapianto di isole pancreatiche è un modo per raggiungere normoglycemia in diabete di tipo 1. Questo articolo si concentra sulla tecnica di trapianto attraverso il percorso intraportal per mantenere i livelli normali del glucosio nei topi diabetici.

Intraportal trapianto di isole pancreatiche nel modello del topo

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Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)

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Longitudinale in Vivo Imaging e quantificazione dell'isolotto pancreatico umano Innesto e contribuendo cellule ospitanti nella camera occhio anteriore

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Ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi

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