Name: Modellazione dellictus nei topi: lesioni corticali focali da fototrombosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Scopri il modello di ictus fototrombotico nei topi per studiare la plasticità corticale e i meccanismi post-ictus. Questo protocollo standardizzato permette lesioni riproducibili con bassa mortalità e senza chirurgia invasiva.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo tutti i nostri partner di collaborazione dei Consorzi Immunostroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) per suggerimenti e discussioni. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nell'ambito della strategia di eccellenza della Germania nell'ambito del Cluster for Systems Neurology di Monaco (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) e nell'ambito delle sovvenzioni LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 e LL-112/1-1.

Gli esperimenti riportati in questo video sono stati condotti secondo le linee guida nazionali per l'uso di animali da esperimento e i protocolli sono stati approvati dai comitati governativi tedeschi (Regierung von Oberbayern, Monaco di Baviera, Germania). I topi utilizzati in questo studio erano topi maschi C57Bl / 6J, di 10-12 settimane, e inviati da Charles River Germany. Gli animali sono stati alloggiati a temperatura controllata (22 °C ± 2 °C), con un ciclo luce-buio di 12 ore e accesso a cibo e acqua pelletati ad libitum.
1. Preparazione del materiale e degli strumenti
<ol><li>Sciogliere Rose Bengal in soluzione salina allo 0,9% per raggiungere una concentrazione finale di 10 mg/ml. Collegare la termocoperta per mantenere calda l'area operativa e mantenere la temperatura corporea del mouse durante l'anestesia a 37 °C.</li>
	<li>Preparare forbici, pinza, pezzi di cotone, unguento per gli occhi di dexpantenolo e materiale di sutura. Preparare una siringa con soluzione salina (senza ago) per mantenere idratata l'area operatoria. Preparare il gas di anestesia (100% O2 + isoflurano).</li>
</ol>2. Preparazione dell'animale
<ol><li>Iniettare analgesia 30 minuti prima dell'intervento chirurgico (4 mg/kg di carprofene e 0,1 mg/kg di buprenorfina).</li>
	<li>Registrare il peso corporeo del topo per regolare la dose di Rose Bengal da iniettare (10 μL/g cioè 100 μg/g).</li>
	<li>Posizionare il topo nella camera di induzione con una portata isoflurano del 4% per anestetizzarlo fino a quando il movimento spontaneo del corpo e delle vibrisse si ferma.</li>
	<li>Trasferire il mouse nella cornice stereotassica e posizionarlo in posizione prona con il naso nella maschera di anestesia. Fissare l'animale e mantenere la concentrazione di isoflurano al 4% per 1 minuto. Quindi ridurre e mantenere la concentrazione di isoflurano al 2%.</li>
	<li>Inserire delicatamente la sonda rettale per monitorare la temperatura durante le procedure chirurgiche. Impostare la piastra riscaldante a feedback controllata associata per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C.</li>
	<li>Applicare l'unguento per gli occhi di dexpantenolo su entrambi gli occhi e pulire la pelle e la pelliccia circostante con un agente disinfettante.</li>
</ol>3. Modello di fototrombosi
<ol><li>Fai un'incisione longitudinale di 2,0-2,5 cm e ritrai per esporre il cranio. Eseguire l'esposizione del cranio con un singolo taglio per evitare complicazioni della ferita.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente il periosteo con il cotone e identificare le suture coronali.</li>
	<li>Indossare gli occhiali protettivi, accendere il laser a 561 nm e segnare il bregma +3 mm a sinistra.</li>
	<li>Spegnere il laser, attaccare un adesivo con un foro di 4 mm di diametro posto alle coordinate contrassegnate sopra menzionate.</li>
	<li>Iniettare il topo con Bengal Rose (10 μL/g), per via intraperitoneale. Posizionare il raggio laser a 4-5 cm dal cranio, accendere il laser a 561 nm e illuminare il cranio per 20 minuti.</li>
	<li>Applicare due gocce di soluzione salina allo 0,9% sul cranio per reidratare, suturare la ferita e posizionare l'animale in una camera di recupero a 37 °C per riprendersi dall'anestesia. Dopo 1 ora, riportare i topi alle loro gabbie in una stanza a temperatura controllata.</li>
	<li>Iniettare analgesia ogni 12 ore per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico (4 mg/kg di Carprofene e 0,1 mg/kg di Buprenorfina).</li>
</ol>4. Operazione fittizia
<ol><li>Eseguire due diverse procedure di operazioni Sham come descritto nei passaggi 4.1.1 e 4.1.2.<ol>
<li>Eseguire tutte le procedure in modo identico all'operazione sopra descritta. Iniettare Rose Bengal senza accendere il laser. Dopo 20 minuti in anestesia, lasciare che gli animali rimangano nella camera di recupero per 1 ora per recuperare, prima di essere restituiti alle loro gabbie.</li>
		<li>Eseguire tutte le procedure in modo identico all'operazione sopra descritta, accendendo il laser. Non iniettare Rose Bengal. Dopo 20 minuti di illuminazione laser, consentire agli animali di rimanere nella camera di recupero per 1 ora per riprendersi dall'anestesia, prima di essere restituiti alle loro gabbie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Macchie laser
<ol><li>Collegare la coperta riscaldata per mantenere calda l'area operativa e mantenere la temperatura corporea del mouse durante l'anestesia a 37 °C.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella camera di induzione con una portata isoflurano del 4% per anestetizzarlo fino a quando il movimento spontaneo del corpo e delle vibrisse si ferma e quindi trasferire il mouse nella cornice stereotassica.</li>
	<li>Posizionare il mouse in posizione prona con il naso nella maschera di anestesia. Fissare l'animale e mantenere la concentrazione di isoflurano al 4% per 1 min.</li>
	<li>Inserire delicatamente la sonda rettale per monitorare la temperatura durante le procedure chirurgiche. Impostare la piastra riscaldante controllata a feedback associata per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C e applicare l'unguento oculare di dexpantenolo su entrambi gli occhi. Pulire la pelle e la pelliccia circostante con un agente disinfettante.</li>
	<li>Fai un'incisione longitudinale di 2,0-2,5 cm e ritrai per esporre il cranio. Eseguire l'esposizione del cranio con un singolo taglio per evitare complicazioni della ferita.</li>
	<li>Posizionare la cornice sterotattica sotto la macchietta laser e regolare l'altezza per ottenere un'immagine nitida. Focalizzare la telecamera LSI (Laser Speckle Perfusion Imaging) sulla finestra cranica. Configurare il sistema di telecamere LSI (Laser Speckle Imaging) ad alta risoluzione come descritto in precedenza15.</li>
	<li>Acquisisci dati da un campo visivo di 1 cm x 1 cm utilizzando una lunghezza d'onda di 785 nm e laser da 80 mW con un frame rate di 21 immagini/ s a una distanza di lavoro di 1 cm per 1 minuto.</li>
	<li>Dopo l'imaging, applicare due gocce di soluzione salina allo 0,9% sul cranio per reidratare, suturare la ferita e posizionare l'animale in una camera di recupero a 37 ° C per recuperare dall'anestesia per 1 ora. Dopo 1 ora, riportare i topi alle loro gabbie in una stanza a temperatura controllata.</li>
</ol>6. Neuropunteggio
NOTA: Per l'analisi del deficit neurologico, viene utilizzata una scala neurologica modificata pubblicata da Eckenstein et al. nel1997 15.
<ol><li>Punteggio degli animali per deficit generali (Tabella 1) e focali (Tabella 2). Questa scala composita varia da 0 (nessun deficit) a 46 (gravi menomazioni).</li>
	<li>Esegui il neuroscore alla stessa ora ogni giorno e usa abiti chirurgici per mantenere un odore neutro.</li>
	<li>Abituare i topi per 30 minuti nella stanza con una gabbia aperta prima del test e consentire loro di osservare ogni elemento per 30 s.</li>
</ol>7. Perfusione
<ol><li>Preparare una siringa da 20 mL contenente PBS-eparina (2 U/mL) e posizionarla 1 m sopra il banco per facilitare/garantire la perfusione per gravità.</li>
	<li>Iniettare per via intraperitoneale 100 μL di ketamina e xilazina (rispettivamente 120/16 mg/kg di peso corporeo). Attendere 5 minuti e confermare la cessazione del movimento spontaneo del corpo e delle vibrisse.</li>
	<li>Fissare l'animale in posizione supina e disinfettare la superficie addominale del corpo con etanolo al 100%. Fai un'incisione lunga 3 cm nell'addome; tagliare il diaframma e le costole per visualizzare completamente il cuore.</li>
	<li>Fare una piccola incisione nell'atrio destro e inserire la cannula di perfusione nel ventricolo sinistro e perfondere con 20 ml di PBS-eparina.</li>
	<li>Dopo la perfusione, decapitare l'animale e rimuovere il cervello, congelarlo con ghiaccio secco e conservarlo a -80 °C fino a nuovo utilizzo.</li>
</ol>8. Volumetria dell'infarto
<ol><li>Criosezione: tagliare il cervello in serie su un criostato a sezioni spesse 20 μm ogni 120 μm e montare su diapositive. Conservare i vetrini a -80 °C fino a ulteriore lavorazione.</li>
	<li>Colorazione viola cresile (CV)<ol>
<li>Per preparare la soluzione colorante, mescolare 0,5 g di acetato CV in 500 mL di H2O. Mescolare e riscaldare (60 °C) fino a quando i cristalli non si sono sciolti. Lasciare raffreddare la soluzione e conservarla in una bottiglia scura. Riscaldare a 60 °C e filtrare (filtro di carta) prima di ogni utilizzo.</li>
		<li>Asciugare i vetrini a temperatura ambiente per 30 min. Metterli in etanolo al 95% per 15 minuti, seguiti da etanolo al 70% per 1 minuto e successivamente in etanolo al 50% per 1 minuto.</li>
		<li>Mettere i vetrini in acqua distillata per 2 minuti, rinfrescare l'acqua distillata e rimettere i vetrini in acqua per 1 minuto. Quindi, posizionare i vetrini nella soluzione colorante preriscaldata per 10 minuti a 60 °C. Lavare i vetrini due volte in acqua distillata per 1 min.</li>
		<li>Posizionare le diapositive in etanolo al 95% per 2 minuti. Quindi metterli in etanolo al 100% per 5 minuti, rinfrescare l'etanolo al 100% e posizionare nuovamente i vetrini in etanolo al 100% per 2 minuti. Successivamente, coprire le diapositive con un supporto di montaggio.</li>
		<li>Analisi: Scansiona i vetrini e analizza il volume indiretto dell'infarto con il metodo Swanson16 per correggere l'edema: area ischemica = (regione ischemica)-((emisfero ipsilaterale) - (emisfero controlaterale)).</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Colorazione Tunel (kit di rilevamento dell'apoptosiin situ)
<ol><li>Asciugare i vetrini, post-fissare in paraformaldeide al 4% in PBS (ph 7,4) per 10-20 minuti a RT. Lavare in PBS, post-fissare in etanolo preraffreddato: acido acetico 2:1 per 5 min a -20 °C.</li>
	<li>Lavare in PBS e applicare il tampone di equilibrio (da 10 s ad un massimo di 60 min a RT) e applicare la forza di lavoro dell'enzima TdT (1 h a 37 °C in camera umidificata)</li>
	<li>Applicare l'enzima stop/wash della forza di lavoro (10 min a RT), lavare in PBS e applicare il coniugato anti-digoxigenina riscaldato (RT) (30 min a RT al buio)</li>
	<li>Lavare in PBS, incubare con DAPI per 5 minuti a RT e montare i vetrini con mezzi fluoromount.</li>
</ol>

<ol><li>GBD 2016 Causes of Death Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+age-sex+specific+mortality+for+264+causes+of+death%2C+1980-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%3A+The+Journal+of+the+American+Society+for+Experimental+Neuro+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).</li>
<li>Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+in+the+cerebral+microcirculation%3A+effect+of+aspirin+and+other+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents.</a> Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li>
<li>Bergeron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+photochemical+cortical+lesions+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inducing photochemical cortical lesions in rat brain.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).</li>
<li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+ischemia+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model.</a> Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).</li>
<li>Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+infarction.+I.+Early+microvascular+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations.</a> Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).</li>
<li>Labat-gest, V., Tomasi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothrombotic+ischemia%3A+a+minimally+invasive+and+reproducible+photochemical+cortical+lesion+model+for+mouse+stroke+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370(2013).</li>
<li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journals+unite+for+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Journals unite for reproducibility.</a> Science. 346 (6210), 679(2014).</li>
<li>Llovera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+preclinical+randomized+controlled+multicenter+trial+%28pRCT%29%3A+Anti-CD49d+treatment+for+acute+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li>
<li>Dirnagl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concerted+appeal+for+international+cooperation+in+preclinical+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research.</a> Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).</li>
<li>Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulating+multicentre+clinical+stroke+trials%3A+a+new+paradigm+for+studying+novel+interventions+in+experimental+models+of+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stroke%3A+Official+Journal+of+the+INternational+Stroke+Society%22%5BJournal%5D)">Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke.</a> International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+The+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+%26+Pharmacotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).</li>
<li>Llovera, G., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+step+in+translational+research%3A+lessons+learned+from+the+first+preclinical+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial.</a> Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).</li>
<li>Gnyawali, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retooling+laser+speckle+contrast+analysis+algorithm+to+enhance+non-invasive+high+resolution+laser+speckle+functional+imaging+of+cutaneous+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation.</a> Scientific Reports. 7, 41048(2017).</li>
<li>Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+differences+in+the+early+detection+of+breast+cancer+in+metropolitan+Detroit%2C+1978+to+1987%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987.</a> Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).</li>
<li>Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monofilament+intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse.</a> Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice+-+middle+cerebral+artery+occlusion+with+the+filament+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423(2011).</li>
<li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).</li>
<li>Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+focal+ischemic+stroke+in+the+rat%3A+reproducible+extensive+cortical+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction.</a> Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).</li>
<li>Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice%3A+permanent+coagulation+of+the+distal+middle+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729(2014).</li>
<li>Cramer, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+widefield+calcium+imaging+of+the+mouse+cortex+for+analysis+of+network+connectivity+in+health+and+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease.</a> Neuroimage. 199, 570-584 (2019).</li>
<li>Heindl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+morphological+analysis+of+microglia+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Automated morphological analysis of microglia after stroke.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106(2018).</li>
<li>Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-function+injectable+angiogenic+biomaterial+for+the+repair+of+brain+tissue+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke.</a> Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).</li>
<li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nogo-A+targeted+therapy+promotes+vascular+repair+and+functional+recovery+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).</li>
<li>Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhalational+anesthetics+as+neuroprotectants+or+chemical+preconditioning+agents+in+ischemic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).</li>
<li>Farr, T. D., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impairments+in+skilled+reaching+in+the+mouse+%28Mus+musculus%29+after+a+focal+motor+cortex+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke.</a> Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).</li>
<li>Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonocclusion+and+spontaneous+recanalization+rates+in+acute+ischemic+stroke%3A+a+review+of+cerebral+angiography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies.</a> Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).</li>
<li>Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hardware+and+methodology+for+targeting+single+brain+arterioles+for+photothrombotic+stroke+on+an+upright+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope.</a> Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi concorrenti da divulgare.

Il protocollo presentato descrive il modello sperimentale di ictus della fototrombosi illuminando il cranio intatto con un laser a 561 nm, con una precedente iniezione intraperitoneale di Rose Bengal. Fino a poco tempo fa, l'uso di questo modello è stato basso ma è in costante aumento.
La mortalità durante l'induzione dell'ictus in questo modello è assente. La mortalità complessiva inferiore al 5% si manifesta durante l'operazione a causa di complicazioni anestesiologiche o sacrifici dopo aver...

L'ictus ischemico rimane una delle principali cause di morte e disabilità acquisita negli adulti nei paesi sviluppati nel 21° secolo, rappresentando circa 2,7 milioni di morti nel 2017 in tutto il mondo1. Anche con gli immensi sforzi della comunità scientifica, sono disponibili pochi trattamenti. Inoltre, con criteri di esclusione così elevati, queste opzioni già limitate non sono accessibili a molti pazienti, con conseguente urgente necessità di nuovi trattamenti per migliorare il recupero funzionale dopo l'ictus.
Considerando l'incapacità dei modelli in vitro di replicare le complesse interazioni del cervello, i modelli animali sono essenziali per la ricerca preclinica sull'ictus. I topi sono il modello animale più frequentemente utilizzato nel campo della ricerca sull'ictus. La maggior parte di questi modelli murini mira a indurre infarti bloccando il flusso sanguigno all'interno dell'arteria cerebrale media (MCA) poiché la maggior parte delle lesioni umane da ictus si trova nel territorio MCA2. Sebbene questi modelli ricapitolino meglio le lesioni umane dell'ictus, coinvolgono interventi chirurgici convulsi con elevata variabilità del volume dell'infarto.
Dalla proposta di Rosenblum e El-Sabban del modello fototrombotico nel 1977 3 , e successivamentel'applicazionedi questo modello ai ratti Watson et al.4, è diventato ampiamente utilizzato nella ricercasull'ictusischemico 5,6. Il modello di ictus fototrombotico induce un infarto corticale locale e definito a seguito della fotoattivazione di un colorante sensibile alla luce precedentemente iniettato nel flusso sanguigno. Ciò causa trombosi locale dei vasi nelle aree esposte alla luce. In breve, dopo l'esposizione alla luce del colorante fotosensibile iniettato, viene indotta una lesione ossidativa localizzata della membrana cellulare endoteliale, che porta all'aggregazione piastrinica e alla formazione di trombi, seguita da un'interruzione locale del flusso sanguigno cerebrale7.
Il vantaggio principale di questa tecnica risiede nella sua semplicità di esecuzione e nella possibilità di dirigere la lesione verso la regione desiderata. A differenza di altri modelli sperimentali di ictus, è necessaria una minore esperienza chirurgica per eseguire il modello di ictus fototrombotico poiché la lesione viene indotta attraverso l'illuminazione del cranio intatto. Inoltre, i bordi ben delimitati(Figura 2A e Figura 5B)e la flessibilità di indurre la lesione in una specifica regione del cervello possono facilitare lo studio delle risposte cellulari all'interno dell'area corticale ischemica o intatta8. Per questi motivi, questo approccio è adatto per lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari della plasticità corticale.
Negli ultimi decenni, la crescente preoccupazione per la mancanza di riproducibilità tra i gruppi di ricerca è stata coniata la cosiddetta crisi di replicazione9. Dopo il coordinamento del primo studio preclinico randomizzato controllato multicentrico nel 201510,uno strumento proposto per migliorare la ricerca preclinica11,12,13,è stato confermato che una delle cause della mancata riproducibilità tra studi preclinici di laboratori indipendenti era la mancanza di una sufficiente standardizzazione dei modelli sperimentali di ictus e dei parametri di esito14. Di conseguenza, quando è stato istituito il consorzio ImmunoStroke (https://immunostroke.de/), una collaborazione che mira a comprendere le interazioni cervello-immunità alla base dei principi meccanicistici del recupero dell'ictus, la standardizzazione di tutti i modelli sperimentali di ictus tra ciascun gruppo di ricerca era essenziale.
Qui è descritta la procedura standardizzata per l'induzione del modello fototrombotico utilizzata nel suddetto consorzio di ricerca. In breve, un animale è stato sottoposto ad anestesia, ha ricevuto un'iniezione di Rose Bengal (10 μL / g) per via intraperitonale e il cranio intatto, a 3 mm dalla bregma, è stato immediatamente illuminato da un laser a 561 nm per 20 minuti (Figura 1). Inoltre, viene riportato un metodo istologico e comportamentale correlato per analizzare l'esito dell'ictus in questo modello. Tutti i metodi si basano su procedure operative standard sviluppate e utilizzate in laboratorio.

<table><tbody><tr><td>Laser a lunghezza d'onda 561 nm</td><td>Solna</td><td>Cobolt HS-03</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma Life Science</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia per isoflurano</td><td>Dräger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApopTag Perossidasi Kit per il rilevamento dell'apoptosi in situ</td><td>Millipore</td><td>S7100</td><td></td></tr><tr><td>Pomata Bepanthen</td><td>Bayer</td><td>1578681</td><td></td></tr><tr><td>topi C57Bl/6J</td><td>Charles River</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Collimetro</td><td>Thorlabs</td><td>F240APC-A</td><td></td></tr><tr><td>Cotons</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 70%</td> <td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 96%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 99%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Macherey-Nagel</td><td>432018</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>FST</td><td>11616-15</td><td></td></tr><tr><td>Termocoperta</td><td>FHC DC Regolatore di temperatura</td><td>&nbsp; 40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Speckle</td><td>Perimed</td><td>PeriCam PSI HR</td><td></td></tr><tr><td>Mayor Forbici</td><td>FST</td><td>1410-15</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato PH: 7.4</td><td>Apotheke Innestadt Uni Munchen</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali protettivi</td><td>Laser 2000</td><td>NIR-ZS2-38</td><td></td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>198250-5G</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit supporto di montaggio</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>Braun</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Montatura</td> <td>stereotassicaStoelting</td><td>51500U</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Vetrini</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Xilacino</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modellazione dell'ictus nei topi: lesioni corticali focali da fototrombosi

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

L'ictus è una delle principali cause di morte e disabilità acquisita negli adulti nei paesi sviluppati. Nonostante un'ampia indagine per nuove strategie terapeutiche, rimangono limitate opzioni terapeutiche per i pazienti con ictus. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per i percorsi fisiopatologici come l'infiammazione post-ictus, l'angiogenesi, la plasticità neuronale e la rigenerazione. Data l'incapacità dei modelli in vitro di riprodurre la complessità del cervello, i modelli sperimentali di ictus sono essenziali per l'analisi e la successiva valutazione di nuovi bersagli farmacologici per questi meccanismi. Inoltre, sono urgentemente necessari modelli standardizzati dettagliati per tutte le procedure per superare la cosiddetta crisi della replica. Come sforzo all'interno del consorzio di ricerca ImmunoStroke, viene descritto un modello murino fototrombotico standardizzato che utilizza un'iniezione intraperitoneale di Rose Bengal e l'illuminazione del cranio intatto con un laser a 561 nm. Questo modello consente l'esecuzione di ictus nei topi con allocazione a qualsiasi regione corticale del cervello senza chirurgia invasiva; quindi, consentendo lo studio dell'ictus in varie aree del cervello. In questo video, vengono dimostrati i metodi chirurgici di induzione dell'ictus nel modello fototrombotico insieme all'analisi istologica.

Il modello qui descritto è un modello di corsa fototrombotica mediante iniezione rose bengala e illuminazione del cranio intatta per 20 minuti, a una lunghezza d'onda costante di 561 nm e una potenza di uscita di 25 mW alla fibra. Sebbene la chirurgia fototrombotica completa duri 30 minuti, l'animale è tenuto in anestesia bassa e il danno cerebrale è moderato. Circa 10 minuti dopo il trasferimento nelle loro gabbie, tutti gli animali erano svegli, si muovevano liberamente nella gabbia e interagivano con i compagni di cuc...

Qui è descritto il modello di ictus fototrombotico, in cui un ictus viene prodotto attraverso il cranio intatto inducendo l'occlusione microvascolare permanente utilizzando l'illuminazione laser dopo la somministrazione di un colorante fotosensibile.

Modellazione dell'ictus nei topi: lesioni corticali focali da fototrombosi

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...

L'approccio del modello di ictus della fototrombosi può essere adatto per studi cellulari e molecolari della plasticità corticale a causa dei bordi limitati e della flessibilità per indurre lesioni in diverse aree della corteccia. Tre vantaggi principali distinguono il modello di fototrombosi da altri modelli di ictus, la possibilità di dirigere la lesione verso la regione desiderata, la sua elevata riproducibilità e la bassa mortalità. Un corretto dosaggio del rose bengal è fondamentale per il successo e per la stabilità del modello.I risultati dipendono dalle specifiche tecniche come la potenza del laser, la temporizzazione dell'applicazione incrociata e lo scellino ottico della corteccia non interessata. Iniziare sciogliendo il rose bengala in soluzione salina allo 0,9% per una concentrazione finale di 10 milligrammi per millilitro. Sterilizzare meticolosamente tutti gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore al piombo caldo e disinfettare tutte le superfici prima e dopo l'intervento chirurgico con uno spray disinfettante microbico.Preparare una siringa riempita con soluzione salina per mantenere idratata l'area operativa e preparare il gas di anestesia. Misurare il peso corpo

modeling-stroke-in-mice-focal-cortical-lesions-by-photothrombosis

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video dimostra la procedura per generare ictus fototrombotico in un modello murino mediante illuminazione laser di un cranio intatto dopo la somministrazione di colorante fotosensibile.

Modellazione dell'ictus fototrombotico in un modello murino: una tecnica di illuminazione laser attraverso il cranio del topo dopo la somministrazione di colorante fotosensibile per indurre la fototrombosi

Photothrombosis è una tecnica rapida, mini-invasiva per indurre le piccole e ben delimitate del miocardio in aree di interesse in modo altamente riproducibile. È particolarmente adatto per studiare risposte cellulari e molecolari alla base della plasticità cerebrale in topi transgenici.

Ischemia Photothrombotic: un modello fotochimico lesione corticale minimamente invasiva e riproducibile per mouse Studi Stroke

Vari modelli murini di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) sono ampiamente utilizzati nella ricerca sul cervello sperimentale. Qui, dimostriamo il modello di transcranica permanente distale MCAO che produce coerente infarto corticale di misura corrispondente al danno imposto dalla maggioranza degli ictus ischemici umani.

Corsa di modellazione in Mouse: Coagulazione permanente dell&#39;arteria cerebrale media distale

Qui, descriviamo un approccio di microscopia ottica semi-invasiva per l'induzione di un coagulo fototrombotico di Rose Bengal nella corteccia somatosensoriale di un topo in vivo.  Vengono descritti gli aspetti tecnici della procedura di imaging, dall'induzione di un evento fototrombotico all'applicazione e alla raccolta dei dati.

Rosa Bengala Photothrombosis da confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di singolo vaso Stroke

La fototrombosi è una procedura minimamente invasiva e altamente riproducibile per indurre ischemia focale nel midollo spinale e funge da modello di lesione del midollo spinale nei topi.

Photothrombosis-indotta ischemia focale come un modello di lesioni del midollo spinale nei topi

Questo manoscritto descrive una tecnica di modellazione di capsulare infarto. Qui abbiamo utilizzato una tecnica photothrombotic modificato con bassa intensità della luce dopo la mappatura di destinazione pre-intervento chirurgico. Utilizzando questa tecnica, abbiamo creato un modello circoscritto infarto capsulare con disabilità motoria persistente.

Circoscritto capsulare Infarct Modeling usando una tecnica Photothrombotic

I modelli tradizionali di ictus fototrombotico (PTS) inducono principalmente aggregati piastrinici densi con un'elevata resistenza al trattamento litico con attivatore tissutale del plasminogeno (tPA). Qui viene introdotto un modello PTS murino modificato co-iniettando trombina e colorante fotosensibile per la fotoattivazione. Il modello PTS potenziato con trombina produce coaguli misti piastrina:fibrina ed è altamente sensibile alla trombolisi tPA.

Un modello di ictus fototrombotico arricchito di fibrina e sensibile al tPA

Diversi modelli di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo) sono utilizzati nella ricerca sperimentale sull'ictus. Qui, viene descritto un modello sperimentale di ictus di MCAo transitorio attraverso l'arteria carotide esterna (ECA), che mira a imitare l'ictus umano, in cui il trombo cerebrovascolare viene rimosso a causa della lisi spontanea del coagulo o della terapia.

Modellazione dell'ictus nei topi: occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media attraverso l'arteria carotide esterna

Utilizzando un approccio completamente ottico, l'ictus ischemico viene indotto registrando contemporaneamente l'attività neuronale del Ca2+ utilizzando un biosensore fluorescente nel nucleo emergente dell'ictus di un topo sveglio e in comportamento.

Fototrombosi simultanea e fotometria delle fibre per indurre e monitorare l'ictus ischemico nei topi comportanti

Questo protocollo fornisce un metodo integrato che include la somministrazione virale, l'impianto di optrodi, l'induzione fototrombotica, la registrazione simultanea dell'attività degli astrociti e dei neuroni, e la stimolazione optogenetica degli astrociti. Questo metodo integrato mira a fornire un'indagine parallela della relazione astrocito-neurone nelle fasi acute a croniche dell'ictus ischemico.

Un metodo integrato per la modellazione fototrombotica dell'ictus e la registrazione in vivo dell'attività neuronale e astrocita in topi in comportamento

Scopri il modello di ictus fototrombotico nei topi per studiare la plasticità corticale e i meccanismi post-ictus. Questo protocollo standardizzato permette lesioni riproducibili con bassa mortalità e senza chirurgia invasiva.

Modellazione dell'ictus nei topi: lesioni corticali focali da fototrombosi

Esplora altri video