Name: Assorbimento di piccole vescicole extracellulari etichettate fluorescenti in vitro e nel midollo spinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Scopri come etichettare e tracciare l'assorbimento di piccole vescicole extracellulari nel midollo spinale utilizzando coloranti PKH e microscopia confocale. Questo protocollo facilita studi meccanistici e terapeutici sui disturbi spinali.

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Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del NIH NINDS R01NS102836 e del Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) assegnato a Seena K. Ajit. Ringraziamo il Dr. Bradley Nash per la lettura critica del manoscritto.

NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Drexel University College of Medicine. I topi CD-1 gravidi a tempo sono stati utilizzati per la coltura astrocitica e tutte le dighe sono state ricevute 15 giorni dopo l'impregnazione. I topi C57BL/6 di dieci-dodici settimane sono stati utilizzati per esperimenti di assorbimento in vivo.
1. Isolamento di sEV da cellule macrofagiche RAW 264.7
<ol><li>Coltura RAW 264,7 cellule in palloni da 75 cm2 in mezzo impoverito di esosomi DMEM contenenti il 10% di siero bovino fetale impoverito di esosomi (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina (pen-streptococco) per 24-48 ore.</li>
	<li>Raccogliere 300 ml di mezzo condizionato e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante e la centrifuga a 2.000 × g per 20 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in tubi centrifughi, centrifugare per 35 minuti a 12.000 × g a 4 °C.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante e filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm.</li>
	<li>Trasferire in tubi ultracentrifughi e centrifuga per 80 minuti a 110.000 × g a 4 °C.</li>
	<li>Conservare il surnatante (mezzo impoverito di esosomi), riesemere il pellet in 2 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e centrifugare per 1 ora a 110.000 × g a 4 °C.</li>
	<li>Rinsociemere il pellet in 100 μL di PBS per un'ulteriore caratterizzazione utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) o nel tampone del saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) per il western blotting.</li>
</ol>2. Caratterizzazione dei sEV
<ol><li>Analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) NOTA: La distribuzione dimensionale e il numero/concentrazione di particelle dei sEV purificati dalle celle RAW 264.7 sono stati misurati da NTA.<ol>
<li>Diluire i sEV in PBS filtrati per ottenere 20-60 vescicole per campo visivo per un tracciamento ottimale.</li>
		<li>Introdurre il campione diluito in una cella di flusso utilizzando una pompa a siringa con una portata costante.</li>
		<li>Prendi 3-5 video di 30 s ciascuno. Impostare la velocità e il guadagno dell'otturatore e mettere a fuoco manualmente le impostazioni della fotocamera affinché il numero massimo di vescicole sia visibile e in grado di essere monitorato e analizzato.</li>
		<li>Avanza i campioni tra ogni registrazione per eseguire misurazioni di replica. Ottimizza le impostazioni di post-acquisizione NTA e mantieni costanti le impostazioni tra i campioni.</li>
		<li>Analizza ogni video utilizzando il software NTA per ottenere la dimensione media e la concentrazione delle vescicole.</li>
		<li>Eseguire tutte le misurazioni NTA con impostazioni di sistema identiche per coerenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Macchia occidentale<ol>
<li>Quantificare le quantità totali di proteine in sEV, lisati cellulari e mezzi impoveriti di esosomi utilizzando un kit di analisi proteica seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Per la preparazione del lisato cellulare, colturare le cellule RAW 264,7 in palloni da 75 cm2 fino all'80-90% di confluenti. Staccare le cellule con lo 0,25% di tripsina per 10-15 minuti, neutralizzare la tripsina con mezzi di coltura e pellettizzare le cellule ruotando a 400 × g per 5 minuti. Risuspendare le cellule in un terreno di crescita fresco.</li>
		<li>Contare le cellule usando un emocitometro e trasferire 1 × 106 cellule in un altro tubo. Lavare le cellule con PBS due volte utilizzando le stesse condizioni di centrifugazione di cui sopra e aggiungere 50 μL di tampone di lisi (tampone RIPA con cocktail inibitore della proteasi aggiunto) al pellet cellulare dal giro finale.</li>
		<li>Vortice le cellule e tenerle sul ghiaccio per 20 min. Sottoporre la miscela a centrifugazione a 10.000 × g per 30 minuti a 4 °C, raccogliere il surnatante (cioè il lisato) in tubi microcentrifuga freschi e conservare a -80 °C fino all'uso.</li>
		<li>Concentrare 2 mL di mezzi impoveriti di esosomi a 100 μL utilizzando filtri centrifughi a taglio di 3 kDa prima di quantificare la quantità di proteine. Mescolare i sEV con tampone di lisi in un rapporto 1: 1, vortice per 30 s e incubare sul ghiaccio per 15 minuti per quantificare la quantità di proteine.</li>
		<li>Mescolare quantità uguali di proteine (2 μg) dei sEV, del lisato cellulare RAW 264.7 e dei mezzi impoveriti di esosomi con tampone campione riducente.</li>
		<li>Denaturare i campioni a 95 °C per 5 minuti, tenerli sul ghiaccio per 5 minuti e ruotare per 2 minuti a 10.000 × g. Caricare i campioni su un gel proteico Tris-glicina al 12% ed eseguire il gel a 125 V per 45 minuti.</li>
		<li>Trasferire la proteina su una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) a 25 V per 2 ore.</li>
		<li>Dopo il trasferimento, bloccare le membrane pvDF con tampone di blocco (vedere la tabella dei materiali)per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare la macchia con anticorpi primari su uno shaker durante la notte a 4 °C. NOTA: Gli anticorpi primari utilizzati erano anti-CD81 (1:1.000), anti-alfa-1,3/1,6-mannosiltransferasi (ALG-2)-interazione proteina X (Alix) (1:1.000), anti-Calnexin (1:1.000) e anti-gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) (1:1.000).</li>
		<li>Lavare le macchie 3 x 15 minuti con 1x soluzione salina tamponata tris, 0,1% Tween 20 (TBST) e incubare a temperatura ambiente con anticorpi secondari coniugati IgG-rafano perossidasi (HRP) o anti-asino anti-coniglio IgG-HRP (1:10.000) per 1 ora sullo shaker.</li>
		<li>Lavare le macchie 3 x 15 minuti con 1x TBST e rilevare le proteine utilizzando un substrato HRP.</li>
		<li>Analizza le macchie migliorando la chemiluminescenza utilizzando un imager western blot.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)<ol>
<li>Correggere i sEV riconsostandoli in paraformaldeide al 2% (PFA) in tampone fosfato 0,1 M (PB); vortice per 2 x 15 s.</li>
		<li>Posizionare una goccia di 10 μL di sospensione sEV su parafilm pulito. Fai galleggiare la griglia del formvar rivestita in carbonio sulla goccia con il lato rivestito rivolto verso la sospensione. Lasciare assorbire le membrane per 20 minuti in ambiente asciutto.</li>
		<li>Posizionare le griglie (lato membrana verso il basso) su una goccia di PB per lavare per 3 x 2 min.</li>
		<li>Trasferire le griglie a 50 μL di glutaraldeide all'1% per 5 minuti.</li>
		<li>Lavare le griglie con 100 μL di acqua distillata per 8 x 2 min.</li>
		<li>Contrasta il campione posizionando le griglie su una goccia di acetato di uranile all'1% per 2 minuti.</li>
		<li>Incorporare il campione con 50 μL di acetato di uranile allo 0,2% con soluzione di metilcellulosa al 2% per 10 minuti su una palaccia di ghiaccio ricoperta di parafilm.</li>
		<li>Utilizzare anelli in acciaio inossidabile per tenere le griglie e rimuovere il fluido in eccesso con carta da filtro.</li>
		<li>Asciugare all'aria la griglia per 10 minuti mentre si è ancora sul loop.</li>
		<li>Osservare al microscopio elettronico a trasmissione a 80 kV.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Etichettatura dei sEV
<ol><li>Diluire 20 μg di sEV in 1 mL di tampone diluente o lo stesso volume di PBS in 1 mL di tampone diluente per il controllo del colorante.</li>
	<li>Diluire 3 μL di colorante PKH67 o PKH26 in 1 mL di tampone diluente e miscelare mediante pipettaggio.</li>
	<li>Aggiungere il colorante PKH diluito ai sEV diluiti e mescolare mediante pipettaggio. Incubare per 5 minuti al buio a temperatura ambiente. Per un controllo del colorante, mescolare il colorante diluito con PBS diluito dal passaggio 3.1.</li>
	<li>Aggiungere 2 ml di albumina sierica bovina all'1% (BSA) in PBS al tubo con il colorante e la miscela sEV e al tubo di controllo del colorante per assorbire il colorante in eccesso.</li>
	<li>Centrifuga per 1 ora a 110.000 × g a 4 °C. Scartare il surnatante, risuscivare il pellet in 2 ml di PBS e centrifugare per 1 ora a 110.000 × g a 4 °C. Ripetere il lavaggio con PBS e risusediare i sEV etichettati o il controllo del colorante in un volume uguale di PBS.</li>
	<li>Quantificare la quantità di proteine totali con il metodo Bradford.</li>
</ol>4. Assorbimento di sEV da parte delle cellule Neuro-2a
<ol><li>Posizionare le coperture da 18 mm in una piastra a 12 pozzetti e la piastra 10 × 104 cellule Neuro-2a in ciascun pozzetti in un totale di 1 mL di mezzo DMEM completo contenente il 10% di FBS e l'1% di pen-strep.</li>
	<li>Cambiare il mezzo in mezzo impoverito di esosomi DMEM quando la confluenza cellulare è dell'80-90%. Aggiungere 1, 5 o 10 μg di sEV etichettati in ciascun pozzetto per 1, 4 e 24 ore per l'assorbimento dose-dipendente e tempo, oppure aggiungere un volume uguale di controllo del colorante.</li>
</ol>5. Culture astrocitiche primarie
<ol><li>Anestetizzare 4 cuccioli postnatali 4 giorni dopo la nascita inducendo ipotermia.</li>
	<li>Raccogli il cervello in una capsula di Petri da 60 mm contenente hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ghiacciata integrata con acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineanesofonico (HEPES) da 10 mM.</li>
	<li>Sezionare entrambi i lobi corticali e rimuovere le meningi. Tritare i tessuti con una lama sterilizzata.</li>
	<li>Trasferire i tessuti in un tubo conico da 15 mL contenente tampone di dissociazione papaina/desossiribonucleasi I e incubare per 20 minuti a 37 °C. Vortice ogni 5 min. NOTA: Per 4 cortecce di topo, 9 mL di 7,5 U/mL di papaina in HBSS vengono attivati a 37 °C per almeno 30 minuti, filtrati attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm e miscelati con desossiribonucleasi I ad una concentrazione finale di 0,1 mg/mL.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e aggiungere 5 ml di DMEM completo per inattivare l'attività enzimatica. Triturare accuratamente per dissociare i tessuti con una pipetta sierologica di vetro da 5 ml e una pipetta Pasteur lucidata a fiamma.</li>
	<li>Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm e centrifugare le cellule a 250 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il mezzo e seminare le cellule in 10 ml di DMEM completo in un pallone da 75 cm2. Sostituire il mezzo surnatante con 15 ml di DMEM medio fresco 4 ore dopo la placcatura.</li>
	<li>Dopo 14 giorni in vitro,trasferire il pallone su uno shaker orbitale per staccare la microglia e gli oligodendrociti a 320 giri/min per 6 ore.</li>
	<li>Tripsinizzare gli astrociti rimanenti utilizzando 5 mL dell'enzima di dissociazione cellulare (Table of Materials) per 10 min a 37 °C. Aggiungere 5 mL di DMEM completo per inattivare l'azione enzimatica e pellettizzare le cellule a 250 × g per 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Risuspendare le celle in DMEM completo. Seme 5 × 104 celle su 12 mm #1.5 coverslips in una piastra a 24 pozzetti.</li>
</ol>6. Assorbimento di sEV da parte degli astrociti
<ol><li>Quando gli astrociti raggiungono l'80-90% di confluenza, cambiare il mezzo in mezzo impoverito di esosomi DMEM.</li>
	<li>Aggiungere 1 μg di sEV non etichettati, un volume uguale di controllo del colorante o PBS alle cellule. Utilizzare le cellule per la colorazione 1 ora e 24 ore dopo il trattamento sEV.</li>
</ol>7. Immunofluorescenza
<ol><li>Risciacquare le cellule con PBS 3x e fissarle con il 4% di PFA in PB per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le celle fisse 3 x 5 min con PB e permeabilizzarle utilizzando 0,1% Triton X-100 in PB per 10-15 min e lavare con PB 3 x 5 min.</li>
	<li>Bloccare le cellule con il 5% di siero di capra normale (NGS) in PB per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare le cellule con anticorpi primari: proteina 2 associata a microtubuli (MAP2A, 1:500) per cellule Neuro-2a o proteina acida fibrillare gliale (GFAP, 1:500) per astrociti primari in NGS/PB fresco al 5% durante la notte a 4 °C con agitazione delicata.</li>
	<li>Lavare 3 x 10 minuti con PB e aggiungere anticorpi secondari coniugati con fluoroforo (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; o Goat Anti-Mouse IgG H & L, Alexa Fluor 488) in 5% NGS e incubare per 2 ore a temperatura ambiente su un bilanciere.</li>
	<li>Lavare 3 x 10 min con PB e incubare con 1 μg/mL di macchia nucleare 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 10 min a temperatura ambiente. Lavare nuovamente le celle 3 volte con PB.</li>
	<li>Montare i coperchi su diapositive #1 utilizzando un mezzo di montaggio antifade. Lasciarli asciugare per una notte al buio e conservare i vetrini preparati a 4 °C fino all'imaging al microscopio confocale.</li>
</ol>8. Diffusione in vivo dei sEV
<ol><li>Eseguire l'iniezione intratecale di 5 μg di sEV non etichettati o marcati sospenati in 10 μL di PBS, o di uguale volume (10 μL) di controllo del colorante (come preparato nel paragrafo 3) in topi C57BL/6.</li>
	<li>Dopo 6 e 18 ore dopo l'iniezione di sEV, anestetizzare profondamente i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di peso corporeo di ketamina e 10 mg/kg di peso corporeo di xilazina.</li>
	<li>Eseguire la perfusione intracardica di topi con soluzione salina allo 0,9% per scovare il sangue, seguita da PFA / PB al 4% ghiacciato appena fatto.</li>
	<li>Sezionare il midollo spinale e fissare in PFA/PB al 4% a 4 °C per 24 ore. Crioproteggere i tessuti in saccarosio al 30% in PB a 4 °C per 24 ore o fino a quando i tessuti affondano. Conservare i tessuti a 4 °C fino all'immunoistochimica.</li>
</ol>9. Immunoistochimica
<ol><li>Incorporare il midollo spinale L4-L5 nel composto O.C.T. Congelare su ghiaccio secco fino a completa solidificazione.</li>
	<li>Sezionare i tessuti a 30 μm (in sezione trasversale per il midollo spinale) usando un criostato e raccogliere le sezioni in una piastra a 24 pozzetti contenente PB. Lavare le sezioni 3 x 5 min con 0,3% Triton in PB.</li>
	<li>Blocca siti di legame non specifici con 5% NGS in 0,3% Triton/PB per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Anticorpi primari diluiti: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1.000), Iba1 per microglia (1:2.000) con 5% NGS in 0,3% Triton/PB, e incubare le sezioni durante la notte a 4 °C su uno shaker.</li>
	<li>Lavare le sezioni 3 x 5 min con lo 0,3% di Triton/PB e aggiungere anticorpi secondari (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500, o Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) al 5% NGS/PB per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare 3 x 5 minuti con PB e incubare le sezioni in 1 μg/mL di DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 3 x 5 min con PB.</li>
	<li>Montare le sezioni su un vetrino adesivo pulito (Table of Materials) con un pennello fine al microscopio ottico.</li>
	<li>Bagnare il coperchio con il mezzo di montaggio. Curare durante la notte al buio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Immagine al microscopio confocale con i rispettivi laser.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

In questo protocollo, abbiamo mostrato l'etichettatura dei sEV con coloranti PKH e la visualizzazione del loro assorbimento nel midollo spinale. I coloranti fluorescenti lipofili PKH sono ampiamente utilizzati per l'etichettatura delle cellule mediante citometria a flusso e microscopia fluorescente3,5,6,12,24,25. A causa dell...

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono vescicole nanodimensionate derivate dalla membrana con un intervallo di dimensioni di 50-150 nm. Hanno origine da corpi multi-vescicolari (MVB) e vengono rilasciati dalle cellule dopo la fusione degli MVB con la membrana plasmatica. Gli sEV contengono miRNA, mRNA, proteine e lipidi bioattivi e queste molecole vengono trasferite tra le cellule sotto forma di comunicazione cellula-cellula. Le sEV possono essere internalizzate dalle cellule riceventi attraverso una varietà di vie endocitiche e questa cattura di sEV da parte delle cellule riceventi è mediata dal riconoscimento delle molecole di superficie sia sugli EV che sulle cellule bersaglio1.
I sEV hanno guadagnato interesse grazie alla loro capacità di innescare cambiamenti molecolari e fenotipici nelle cellule accettori, alla loro utilità come agente terapeutico e al loro potenziale come vettori di molecole di carico o agenti farmacologici. A causa delle loro piccole dimensioni, l'imaging e il tracciamento dei sEV possono essere impegnativi, specialmente per gli studi in vivo e le impostazioni cliniche. Pertanto, sono stati sviluppati molti metodi per etichettare e immaginare i sEV per aiutare la loro biodistribuzione e tracciamento in vitro e in vivo2.
La tecnica più comune per studiare la biodistribuzione sEV e le interazioni delle cellule bersaglio prevede l'etichettatura con molecole di colorante fluorescente3,4,5,6,7. I veicoli elettrici sono stati inizialmente etichettati con coloranti a membrana cellulare che erano comunemente usati per l'immagine delle cellule. Questi coloranti fluorescenti generalmente macchiano il doppio strato lipidico o le proteine di interesse sui sEV. Diversi coloranti lipofili mostrano un forte segnale fluorescente quando incorporati nel citosol, tra cui DiR (1,1′-diottadecile-3,3,3′,3′-tetrametilinditricarbocianina ioduro), DiL (1, 1′-diottadecile-3, 3, 3′, 3′-tetrametil indocarbocianina perclorato) e DiD (1, 1′-diottadecile-3, 3, 3′,3′-tetrametil indocarbocianine 4-clorobenzensolfonato sale)8,9,10,11.
Altri coloranti lipofili, come PKH67 e PKH26, hanno un gruppo di testa polare altamente fluorescente e una lunga coda di idrocarburi alifatici che si intercala facilmente in qualsiasi struttura lipidica e porta alla ritenzione del colorante a lungo termine e alla fluorescenza stabile12. I coloranti PKH possono anche etichettare i veicoli elettrici, il che consente lo studio delle proprietà EV in vivo13. Molti altri coloranti sono stati utilizzati per osservare gli esosomi utilizzando la microscopia a fluorescenza e la citometria a flusso, compresi i coloranti per l'etichettatura lipidica14 e coloranti permeabili alle cellule come l'estere succinimidile carbossifluoresceina diacetato (CFDA-SE)15,16 e l'estere acetoximetile (AM) di calceina17.
Studi di crosstalk mediata da sEV tra diverse cellule del SNC hanno fornito importanti approfondimenti sulla patogenesi delle malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative18. Ad esempio, gli sEV dei neuroni possono diffondere peptidi beta-amiloidi e proteine tau fosforilate e aiutare nella patogenesi della malattia di Alzheimer19. Inoltre, gli EV derivati dagli eritrociti contengono grandi quantità di alfa-sinucleina e possono attraversare la barriera emato-encefalica e contribuire alla patologia del Parkinson20. La capacità dei sEV di attraversare le barriere fisiologiche21 e trasferire le loro biomolecole alle cellule bersaglio li rende strumenti convenienti per fornire farmaci terapeutici al SNC22.
La visualizzazione dell'assorbimento di sEV da parte di una miriade di cellule del SNC nel midollo spinale consentirà sia studi meccanicistici che la valutazione dei benefici terapeutici dei sEV somministrati esogenamente da varie fonti cellulari. Questo documento descrive la metodologia per etichettare i sEV derivati dai macrofagi e immaginare il loro assorbimento in vitro e in vivo nel midollo spinale lombare da parte di neuroni, microglia e astrociti per confermare qualitativamente la consegna di sEV mediante visualizzazione.

<table><tbody><tr><td>Filtri centrifughi Amicon Ultra 0,5 mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z677094</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Alix</td><td>Abcam</td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Calnexina</td><td>Abcam</td><td>Ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-CD81</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale Anti-GAPDH (14C10)</td><td>Segnalazione cellulare Tecnologia</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-proteina acida fibrillare gliale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB360</td><td>1:500 per IF; 1:1000 per IHC</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MAP2A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare, 40 &mu; m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12.000 x g</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti, 12 mm, #1.5</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti, 18 mm, #1.5</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Sciences 72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 &; g/mL</td></tr><tr><td>DC Protein Saggi</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Deossiribonucleasi I (DNAsi I)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Asino Anti-coniglio IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Asino Anti-Coniglio IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Doppio vetrino per microscopio smerigliato, #1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>DPBS senza calcio e magnesio</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino impoverito di esosomi</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>FluorChem M sistema di imaging</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>IgG anti-topo di capra H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG1 anti-topo di capra, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>substrato HRP</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di blocco dell'intercettazione, TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS Sample Buffer</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass, #1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM550</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 sistema</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 3.2 software</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare Neuro-2a</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT Composto</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>della paraformaldeide</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi Thermo</td><td>Scientific</td><td>1862209</td><td></td></tr><tr><td>Membrana di trasferimento PVDF</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 Linea cellulare</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di Sodio</td><td>AMRESCO</td><td>0241-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-188-48</td><td>vetrini adesivi</td></tr><tr><td>T-75 Flaconi</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai 12 Microscopio Elettronico a Trasmissione Digitale</td><td>FEI Azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel</td> proteico di <td>tris-glicina</td><td>FSF300-cu FSF300-cu</td><td></td></tr><tr><td>, 12%</td> <td>Invitrogen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>tampone di corsa SDS Tris-glicina</td><td>Invitrogen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>tampone di trasferimento di tris-glicina</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td></td><td>12605028 enzima</td></tr> <tr>di dissociazione cellulare<td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,25%</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td> Provette per ultracentrifuga <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>110.000 x g</td></tr></tbody></table>

assorbimento di piccole vescicole extracellulari etichettate fluorescenti in vitro e nel midollo spinale

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono vescicole da 50-150 nm secrete da tutte le cellule e presenti nei fluidi corporei. Gli sEV trasferiscono biomolecole come RNA, proteine e lipidi dalle cellule donatrici alle cellule accettori, rendendole mediatori chiave di segnalazione tra le cellule. Nel sistema nervoso centrale (SNC), i sEV possono mediare la segnalazione intercellulare, comprese le interazioni neuroimmune. Le funzioni di sEV possono essere studiate monitorando l'assorbimento di sEV etichettati nelle cellule riceventi sia in vitro che in vivo. Questo documento descrive l'etichettatura dei sEV dai mezzi condizionati delle cellule macrofagiCHE RAW 264.7 utilizzando un colorante a membrana PKH. Mostra l'assorbimento di diverse concentrazioni di sEV etichettati in più punti temporali da parte delle cellule Neuro-2a e degli astrociti primari in vitro. Viene anche mostrato l'assorbimento di sEV somministrati per via intratecale nei neuroni del midollo spinale del topo, negli astrociti e nelle microglia visualizzate mediante microscopia confocale. I risultati rappresentativi dimostrano una variazione dipendente dal tempo nell'assorbimento di sEV da parte di cellule diverse, che può aiutare a confermare il successo della consegna di sEV nel midollo spinale.

Dopo l'isolamento dei sEV dai mezzi condizionati RAW 264.7 tramite centrifugazione, nta è stato utilizzato per determinare la concentrazione e la distribuzione dimensionale dei sEV purificati. La dimensione media media delle sEV derivate da RAW 264,7 era di 140 nm e la dimensione delle particelle di picco era di 121,8 nm, confermando che la maggior parte delle particelle rilevabili nella misurazione della diffusione della luce rientrava nell'intervallo di dimensioni degli esosomi o dei sEV a 50-150 nm (<strong class="xfi...

Descriviamo un protocollo per etichettare piccole vescicole extracellulari derivate da macrofagi con coloranti PKH e osservarne l'assorbimento in vitro e nel midollo spinale dopo il parto intratecale.

Assorbimento di piccole vescicole extracellulari etichettate fluorescenti in vitro e nel midollo spinale

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

Visualizzare l'assorbimento di piccole vescicole extracellulari, note anche come sEV, da parte di diverse cellule del midollo spinale, può confermare una consegna di successo di sEV. Ciò consente studi sia meccanicistici che terapeutici di sEV somministrati per via intratecale da varie fonti in modelli di roden. Questo protocollo può essere utilizzato per visualizzare l'assorbimento di sEV da parte delle cellule in un midollo spinale lieve e può aiutare a valutare il ruolo dei sEV e delle sue molecole di carico nei disturbi spinali, nel dolore e nell'infiammazione.Questa procedura sarà dimostrata da me, insieme a Xuan Luo a nd Zhucheng Lin, i due studenti laureati nel laboratorio del dottor Seena Ajit. Inizia posizionando scivolate di copertura da 18 millimetri nella piastra del pozzo 12, quindi piastre le cellule neuro-2a in ciascun pozzetto con un totale di 1 millilitro di DMEM completo contenente il 10% FBS e l'1% di pen strep. Quando la fluidità della conta cellulare ha raggiunto l'80-90%, cambiare il mezzo in mezzo impoverito di esosomi DMEM in ciascun pozzo aggiungere uno, 5 o 10 microgrammi di sEV etichettati.Per 1, 4 e 24 ore. Per l'assorbimento dipendente dalla dose e dal tempo al resto dei pozzetto ad un volume uguale di controllo del colorante. Raccogli il cervello dei cuccioli postnatali in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente una soluzione salina bilanciata Hanks ghiacciata integrata con 10 hepes millimolari, seziona entrambi i lobi corticali e rimuovi le meningi.Quindi tritare i tessuti con una lama sterilizzata. Trasferire i tessuti in un tubo conico da 15 millilitri contenente Pepano o desossiribonucleo un tampone di dissociazione e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius, ruotando il tubo ogni 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 5 millilitri di DMEM completo al tubo. Per inattivare l'attività enzimatica, prova a valutare attentamente per dissociare i tessuti con una pipetta sierologica di vetro da 5 millilitro e una pipetta da pascolo lucidata a fiamma.Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri, quindi centrifugare le cellule a 250 volte G per 5 minuti a 4 gradi Celsius, aspirare il mezzo e vedere le celle in 10 millilitri di DMEM completo in un pallone da 75 centimetri quadrati. Dopo 4 ore di placcatura, sostituire il supernato e il mezzo con 15 millilitri di mezzo DMEM fresco. Dopo 14 giorni in vitro per staccare la microglia e gli oligodendrociti, trasferire il pallone in uno shaker orbitale a 320 RPM per 6 ore.Utilizzare 5 millilitri dell'enzima di dissociazione cellulare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Per tripinizzare, gli astrociti rimanenti, per inattivare l'azione enzimatica, aggiungere un DMEM completo di 5 millilitri e poi pellettizzare le cellule a 250 volte G per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Risuspentare le celle in DMEM completo e vedere le celle sul coperchio numero 1.5 da 12 millimetri scivolare in una piastra da 24 pozzetti.Usando PBS risciacquare le cellule 3 volte e poi fissarle con formaldeide o PFA al 4% di potenza in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle fisse 3 volte per 5 minuti con PBS e permeabilizzarle usando lo 0,1% di Triton X 100 in PBS per 10-15 minuti. Quindi ripetere i lavaggi con PBS.Utilizzare il siero di capra normale al 5% o NGS in PBS per 1 ora a temperatura ambiente per bloccare le cellule, incubare le cellule neuro-2a con anticorpi bidirezionali mappati e gli astrociti primari con anticorpi GFAP con un rapporto da 1 a 500 in NGS o PBS fresco del 5% durante la notte a 4 gradi Celsius con un leggero scuotimento. Dopo aver lavato le cellule 3 volte in PBS, aggiungere gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo in 5% NGS. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente al riparo dalla luce su un bilanciere.Ripetere il lavaggio con PBS e incubare la cella con 1 microgrammo per millilitro di DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare le celle 3 volte con PBS. Utilizzando un mezzo di montaggio anti dissolvenza, montare i coperchi scivola sui vetrini numero 1, lasciarli asciugare durante la notte al buio e conservare i vetrini preparati a 4 gradi Celsius fino all'imaging su un microscopio confocale.Sezionare il midollo spinale e fissarlo in PFA al 4% in PBS a 4 gradi Celsius per 24 ore. Prima proteggere i tessuti in saccarosio al 30% in PBS a 4 gradi Celsius per 24 ore o fino a quando i tessuti affondano e quindi conservare i tessuti a 4 gradi Celsius fino all'immunoistochimica, inmbare il midollo spinale L4 L5 nel composto OCT, quindi congelarlo su ghiaccio secco fino a quando non è completamente solidificato. Utilizzare un criostato per sezionare i tessuti a 30 micrometri e raccogliere le sezioni in una piastra a 24 pozzetti contenente PBS.Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna con lo 0,3% di tritone in PBS, bloccare i siti di legame non specifici usando il 5% mgs nello 0,3% di Triton PBS per 2 ore a temperatura ambiente. Incubare le sezioni durante la notte a 4 gradi Celsius su uno shaker. Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti con lo 0,3% di Tritone in Pbs.Quindi aggiungere la concentrazione appropriata degli anticorpi secondari. Secondo il manoscritto del testo, incubare a temperatura ambiente per due ore, lavare le sezioni usando solo PBS e incubarle in 1 microgrammo per millilitro di DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi ripetere i lavaggi PBS al microscopio ottico, montare le sezioni su un vetrino adesivo trasparente con un pennello fine.Bagnare il coperchio scivolare con il mezzo di montaggio e polimerizzare durante la notte al buio a temperatura ambiente, acquisire immagini al microscopio confocale con i rispettivi laser, La dimensione media media di RA 2 6 4 0,7 sEV derivati era di 140 nanometri e la dimensione delle particelle di picco era di 121,8 nanometri. Con le particelle più rilevabili che rientrano nella gamma di dimensioni degli esosomi o sEVS. A 50-150 nanometri, il western blotting di sEV, celllysate e media esodepletati, ha dimostrato che i campioni proteici derivati da sEV contenevano le proteine marcatori sEV Alix CD81 e GAPDH.Il lisiato cellulare è stato arricchito con reticolo endoplasmatico, proteina residente Calnexin quindi Calnexin è servito come marcatore negativo per la contaminazione cellulare in quanto era assente nei sEV. È stato osservato che l'assorbimento di sEV si è verificato a 1 ora e per i sEV da 1, 5 e 10 microgrammi, la fluorescenza post incubazione poteva essere rilevata a 4 ore, per 4, 5 e 10 microgrammi di sEV. L'assorbimento di sEV etichettati con PKH 26 da parte degli astrociti primari è stato esaminato e la massima fluorescenza dall'assorbimento di sEVS negli astrociti corticali primari si è verificata a 24 ore sono stati assorbiti sEV con marchio PKH26 e la massima fluorescenza è stata osservata a 6 ore, post-iniezione nei neuroni astrociti e cellule microgliali.L'inclusione di controlli, sEV non etichettati e controllo del colorante crea codice per un vento falsi segnali positivi recenti a causa dell'etichettatura ora specifica Opry dance of Unbound dye patch coasts. L'assorbimento di seV può essere confermato studiando il trasferimento del carico biomolecolare alla ricetta e alle cellule e ai tessuti e determinando i cambiamenti nei livelli di espressione delle biomolecole o dei geni bersaglio. Possono anche essere eseguiti studi comportamentali, per indagare l'impatto funzionale della consegna di sEV.

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