Iniezioni di vettori AAV per l'optogenetica in cervello di primati non umani anestetizzati e svegli
4 agosto 2021
Come attualmente implementato, l'optogenetica nei primati non umani richiede l'iniezione di vettori virali nel cervello. Un metodo di iniezione ottimale dovrebbe essere affidabile e, per molte applicazioni, in grado di colpire singoli siti di profondità arbitraria che sono prontamente e inequivocabilmente identificati nell'istologia postmortem. Viene presentato un metodo di iniezione con queste proprietà.
Molti studi genetici terapeutici e neuroscientifici prevedono iniezioni di vettori AAV nel cervello di primati non umani. Affinché questi studi abbiano successo, la tecnica di iniezione deve essere affidabile. La nostra tecnica di iniezione è istantanea e precisa.
Questa procedura funziona bene per l'iniezione in animali anestetizzati o svegli. La nostra cannula fatta in casa è facile da maneggiare e a basso costo. A dimostrare la procedura sarà Kevin Mai, un tecnico di ingegneria del mio laboratorio.
Per iniziare, smussare una punta dell'ago ipodermica calibro 30 da 13 millimetri con una smerigliatrice a disco. Quindi, tagliare un pezzo di tubo di acciaio inossidabile a una lunghezza a seconda della profondità dell'area cerebrale target. Con una smerigliatrice a disco, smussare un'estremità del tubo tagliato e lisciare l'altra.
Sbavare l'interno del tubo con una spilla. Quindi, tagliare un pezzo di tubo in PTFE a una lunghezza appropriata per il volume della soluzione vettoriale da caricare. Flare entrambe le estremità del tubo inserendo l'ago ipodermico smussato.
Inserire l'ago ipodermico smussato di circa cinque millimetri in un'estremità del tubo di PTFE. Quindi inserire l'estremità non smussata del tubo in acciaio inossidabile di circa cinque millimetri nell'altra estremità. Testare la cannula iniettando acqua filtrata attraverso il mozzo dell'ago ipodermico.
Verificare che l'acqua esca uniformemente dalla punta del tubo in acciaio inossidabile smussato e che l'acqua non fuoriesca da nessuna delle giunzioni. Dopo aver testato la cannula, metterla in un sacchetto per autoclave e sterilizzarla in autoclave. Trasferire delicatamente la soluzione vettoriale in un tubo PCR sterilizzato con un pipetter P-20, evitando la formazione di bolle.
Quindi, attaccare la cannula con la punta smussata rivolta verso il basso a un supporto stereotassico orientato verticalmente. Quindi collegare una siringa luer lock da un millilitro al mozzo dell'ago ipodermico della cannula. Immergere la punta smussata nella soluzione vettoriale.
Quindi, applicare una leggera pressione negativa con la siringa da un millilitro per caricare la soluzione nella cannula mentre si segue visivamente il menisco tra la soluzione e l'aria. Una volta caricata la soluzione vettoriale, continuare la leggera pressione negativa fino a quando la soluzione raggiunge il mozzo dell'ago. Quindi, rimuovere la siringa da un millilitro e iniettare lentamente olio minerale colorato lungo la parete interna del mozzo dell'ago ipodermico, avendo cura di evitare bolle d'aria.
Collegare il mozzo dell'ago ipodermico a una delle due porte aperte di un rubinetto di arresto luer a tre vie. Quindi, chiudere la porta. Riempire una siringa da un millilitro con aria e collegarla a una delle altre due porte.
Infine, chiudere la porta rimanente del rubinetto di arresto per collegare la siringa alla cannula. Il collegamento della siringa forza l'aria nel rubinetto di arresto e lo spostamento di quest'aria verso la porta non occupata impedisce di spingere la soluzione vettoriale lungo la cannula. Spingere lentamente l'aria dalla siringa nella cannula.
Una volta che l'olio colorato appare sulla punta dell'ago smussato nel tubo in PTFE, controllare l'aria tra la soluzione e l'olio colorato. Continuare ad applicare una pressione positiva fino a quando una goccia di soluzione vettoriale è visibile sulla punta della cannula smussata. Quindi, chiudere il rubinetto di arresto per evitare che il vettore esca dalla cannula per gravità.
Una volta caricata la soluzione vettoriale, fissare la cannula al manipolatore stereotassico. Quindi, per collegare il rubinetto alla pompa dell'aria elettrica, prendere il tubo della pompa dall'assistente non sterile. Afferrare il connettore luer lock attraverso la parete di un manicotto sterile.
Rilasciare il colletto della manica, permettendogli di estendersi lungo il tubo per gravità. Quindi, fissare il rubinetto e fissare saldamente il manicotto attorno al connettore luer lock. Quindi, testare la pompa dell'aria e la cannula impostando la pompa dell'aria a bassa pressione, prima di accenderla e aumentare la pressione fino a quando l'olio avanza attraverso la cannula e una goccia di soluzione vettoriale è visibile sulla punta della cannula.
Fissare un righello di plastica al tubo in PTFE per misurare il movimento del menisco durante l'iniezione. Quindi, guidare la cannula verso il basso con il manipolatore stereotassico fino a quando la punta raggiunge la superficie e registrare la profondità. Guidare la cannula nel punto più profondo da iniettare lungo la pista.
La superficie si increspa al contatto. Per ridurre al minimo l'errore di targeting dovuto alla compressione tissutale, spingere la cannula verso il basso e superare il sito di iniezione più profondo di 500 micrometri. Quindi, ritrarre lentamente.
Altre alternative sono guidare la cannula lentamente verso il basso o guidarla rapidamente e aspettare sul fondo da uno a cinque minuti. Una volta posizionata la cannula nel sito di iniezione più profondo, utilizzare la pompa dell'aria elettrica per iniettare 0,5 microlitri della soluzione vettoriale in 10-30 secondi. Confermare il flusso di iniezione tracciando il menisco tra l'olio colorato e la soluzione vettoriale nel tubo di PTFE.
Dopo aver atteso un minuto, ritrarre la cannula nel sito di iniezione successivo lungo il binario. Dopo l'iniezione finale, lasciare la cannula in posizione per 10 minuti per evitare efflussi vettoriali. Quindi, ritrarre la cannula e gettarla in un contenitore per taglienti a rischio biologico.
L'iniezione di vettori AAV che trasportano il transgene canale della rodopsina II nel collicolo superiore sinistro, seguita da stimolazione con luce blu continua a 40 milliwatt, ha prodotto una serie di potenziali d'azione consecutivi. Gli impulsi di luce di un millisecondo non sono riusciti a evocare potenziali d'azione a 40 milliwatt, ma li hanno evocati in modo affidabile a 160 milliwatt. La stimolazione ottica del collicolo superiore innescata da saccadi guidate visivamente ha ridotto gradualmente il guadagno di saccade.
La lentezza di questo cambiamento è coerente con la plasticità indotta optogeneticamente. La consegna di luce laser gialla al verme oculomotore dopo iniezioni di AAV nel nucleo reticularis tegmentae pontis ha soppresso l'attività delle fibre muschiose, che è un input per il cervelletto. Questa soppressione ha ridotto l'attività delle cellule di Purkinje, che è un output del cervelletto.
Durante la soppressione optogenetica, la velocità di accensione è diminuita e cambiata in un modello di pori di scoppio, suggerendo che l'input inibito di fibre muschiose alle cellule di Purkinje influenza la fase di decelerazione della saccade guidando la seconda raffica. La rodopsina canale era espressa esclusivamente nelle cellule di Purkinje del verme oculomotore. La somministrazione di brevi impulsi luminosi ha aumentato la semplice attività di picco di una cellula di Purkinje isolata.
Un singolo impulso luminoso di 1,5 millisecondi evocava frequentemente più di un semplice picco. L'attivazione del picco semplice optogenetico temporizzata per verificarsi durante la saccade ha aumentato l'ampiezza della saccade, confermando il ruolo disinibitorio delle cellule di Purkinje sul generatore di burst oculomotorio. Le bolle d'aria nella cannula possono interrompere il menisco del vettore dell'olio, complicare la determinazione dei volumi di iniezione e impedire un controllo fine della portata.
Per questi motivi, il caricamento delle soluzioni vettoriali senza bolle d'aria è fondamentale per questa procedura. Da sei a otto settimane dopo l'iniezione, possono essere eseguite manipolazioni optogenetiche e il tessuto cerebrale può essere elaborato per l'analisi istologica. Questa tecnica consente ai ricercatori di testare molti vettori in pochi animali, il che, a sua volta, facilita lo sviluppo e la convalida di nuovi vettori.
Una particolare area di interesse attuale è lo sviluppo di vettori che colpiranno specifici tipi neuronali.
Panoramica
Questo studio presenta una tecnica di iniezione affidabile e istantanea per somministrare vettori AAV nei cervelli di primati non umani, fondamentale per applicazioni optogenetiche. Il metodo consente il targeting di aree cerebrali specifiche, con una stimolazione riuscita del collicolo superiore che porta a significative variazioni elettrofisiologiche e a nuove intuizioni sulla plasticità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Optogenetica
- Terapia genica
Sfondo
- La optogenetica richiede una somministrazione precisa e affidabile di vettori virali.
- La tecnica di iniezione deve permettere un targeting accurato e l'identificazione delle aree cerebrali.
- I metodi precedenti potrebbero mancare di efficacia o precisione, rendendo necessarie tecniche migliorate.
Scopo dello studio
- Sviluppare una procedura di iniezione affidabile per vettori AAV in primati non umani.
- Esplorare gli effetti della stimolazione optogenetica sulle risposte neuronali.
- Stabilire un metodo applicabile sia a soggetti svegli che anestetizzati.
Metodi Utilizzati
- Lo studio ha impiegato una cannula artigianale per somministrare le soluzioni vettoriali.
- Un ago ipodermico da 30 gauge e un tubo di acciaio inossidibile sono stati utilizzati nella costruzione.
- Il metodo ha previsto passaggi meticolosi per la preparazione, il caricamento e l'iniezione della soluzione.
- Le iniezioni della soluzione vettoriale sono state eseguite con controllo preciso mediante una pompa d'aria elettrica.
- Le risposte elettrofisiologiche sono state monitorate durante e dopo le iniezioni.
Risultati principali
- L'iniezione di vettori AAV ha portato a una significativa generazione di potenziali d'azione in risposta alla stimolazione ottica.
- I cambiamenti elettrofisiologici suggeriscono una plasticità indotta da optogenetica nelle risposte saccadiche.
- L'infusione del vettore ha determinato un'osservata soppressione dell'output cerebellare indicativa di alterati schemi di attività neuronale.
Conclusioni
- La tecnica di iniezione proposta consente un targeting preciso per studi optogenetici in modelli primati.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi neuronali e della plasticità associati all'elaborazione visiva.
- Una maggiore accuratezza delle iniezioni ha implicazioni significative per future applicazioni della terapia genica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La somministrazione affidabile e spazialmente precisa di vettori AAV nei cervelli di primati non umani (NHP) rappresenta un fattore abilitante fondamentale per lo sviluppo dell'optogenetica traslazionale e delle terapie geniche neurologiche. Questo metodo affronta la sfida della somministrazione riproducibile di vettori nei NHP, sostenendo una valida conferma degli obiettivi e una riduzione dei rischi meccanicistici prima della traduzione clinica. La sua capacità di facilitare la sperimentazione multiplex di vettori in coorti animali limitate incide direttamente sull'efficienza del portafoglio e sul livello di previsione affidabile nei percorsi terapeutici per il sistema nervoso centrale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi rigorosa di costrutti optogenetici e del tropismo vettoriale in un sistema di primati non umani rilevante per la malattia.
- Consente la validazione funzionale di bersagli neuronali mediante modulazione ottica controllata e registrazioni elettrofisiologiche.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico permettendo un rilascio preciso dal punto di vista spaziale e volumetrico dei vettori candidati.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara regioni cerebrali di primati non umani validate per saggi successivi di optogenetica ed elettrofisiologia.
- Standardizza i volumi e le velocità di iniezione, migliorando la riproducibilità tra diverse prove sperimentali.
- Consente una valutazione quantitativa dell'espressione del vettore e degli esiti funzionali per la selezione di candidati vettoriali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie traslazionali dei biomarcatori modellando circuiti neurali rilevanti per l'uomo in primati non umani (NHP).
- Garantisce continuità dalla scoperta del vettore fino alla validazione preclinica in un sistema ad alta fedeltà.
- Riduce il rischio biologico consentendo una somministrazione e un'espressione robuste e istologicamente verificabili di costrutti terapeutici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa tecnica di iniezione si integra all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta, la validazione del bersaglio e lo sviluppo di modelli preclinici per programmi di terapia genica e optogenetica del sistema nervoso centrale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la manipolazione precisa dei circuiti neurali nelle scimmie non umane (NHP).
- Screening: Permette un'amministrazione riproducibile e quantitativa di vettori per la valutazione comparativa di costrutti candidati.
- Analisi: Fornisce output misurabili come volume di iniezione, velocità e conferma istologica post-mortem.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica modellando risposte neurali simili a quelle umane nelle scimmie non umane (NHP).
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo standardizzato e scalabile, adattabile a diverse combinazioni di vettori e bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi del sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità, la standardizzazione e la capacità di elaborazione dei test dei vettori nelle scimmie primati non umane (NHP).
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e l'allocazione del capitale consentendo la generazione di dati preclinici robusti.
- Impatto sul portafoglio: Sostiene la priorizzazione e lo sviluppo di asset per la terapia genica del sistema nervoso centrale basate su un adeguato livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chirurgia stereotassica e neuroanatomia delle scimmie non umane per un targeting accurato.
- Richiede l'accesso a infrastrutture specializzate per la fabbricazione di cannule, strumentazione per iniezioni e analisi istologiche.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire riproducibilità e confrontabilità dei dati.
- Adattabile a diverse regioni cerebrali e tipi di vettore, con modifiche al protocollo secondo necessità.
- L'accurata esclusione di bolle d'aria è fondamentale per mantenere la precisione dell'iniezione ed evitare interruzioni del flusso.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Making a Cannula
2:09
Loading the Vector Solution for Injection
4:14
Cannula Insertion into the Target Brain Area and Injection
6:33
Results: Optogenetic Manipulations by Adeno-Associated Viral (AAV) Vector Injections in Awake Monkeys
8:39
Conclusion
