Quantificazione delle densità cellulari e delle proprietà antigeniche mediante levitazione magnetica
17 maggio 2021
Questo documento descrive un metodo basato sulla levitazione magnetica in grado di rilevare specificamente la presenza di antigeni, solubili o legati alla membrana, quantificando i cambiamenti nell'altezza di levitazione delle perle di cattura con densità fisse.
Questa tecnica consente la separazione di vari tipi di cellule e cellule sottoposte a vari processi basati esclusivamente sulla densità con poca o nessuna manipolazione in un breve periodo di tempo. I principali vantaggi di questo metodo sono che è minimamente invasivo, richiede piccoli volumi, fornisce risultati rapidi, non dipende dalle classiche lettura e non è richiesto personale specializzato. Questa tecnica può essere applicata per rilevare più malattie, ad esempio anemia e sepsi.
Per iniziare utilizzare il dispositivo di lancing con un clic per pungere il dito del donatore di sangue positivo al fattore rhesus e raccogliere 10 microlitri di sangue in un millilitro di DPBS. Aggiungere un microlitro di colorante fluorescente in una sospensione millilitro delle cellule positive al fattore rhesus per colorare fluorescentemente la membrana plasmatica e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Pellet le celle ruotando a 5.600 volte G per 15 secondi e lavare il pellet tre volte usando un millilitro di DPBS.
Spese di sospensione del pellet in un millilitro di HBSS con calcio e magnesio. Utilizzare il dispositivo di lancing con un clic per pungere il dito del donatore di sangue negativo al fattore rhesus e raccogliere due microlitri di sangue. Per preparare il tubo sperimentale contenente solo perdole, aggiungere 174 microlitri di HBSS con calcio e magnesio, un microlitro di perli di controllo IgG, un microlitro di pere pesanti con una densità di 1,2 grammi per millilitro e 24 microlitri di gadolinio da 500 millimolari.
Per preparare il tubo di controllo sperimentale contenente IgG, aggiungere 172 microlitri di HBSS con calcio e magnesio, un microlitro di perli di controllo IgG, un microlitro di pere pesanti, un microlitro di sangue negativo a fattore rhesus, un microlitro di sospensione di sangue positiva al fattore rhesus colorato e 24 microlitri di gadolinio millimolare da 500 millimolari. Per preparare il tubo sperimentale del campione, aggiungere 172 microlitri di HBSS con calcio e magnesio, un microlitro di pere rivestite di anti-RhD, un microlitro di pere pesanti, un microlitro di sangue negativo al fattore rhesus, un microlitro di sospensione di sangue positivo al fattore rhesus colorato e 24 microlitri di gadolinio millimolare da 500 millimolari. Impostare il dispositivo di levitazione magnetica.
E caricare 50 microlitri del campione in un tubo capillare fino a quando il tubo non viene riempito. Sigillare le estremità del tubo capillare con un sigillante capillare assicurandosi che non ci siano bolle. Posizionare il tubo capillare nel supporto capillare tra i magneti superiore e inferiore, regolare il palco e la messa a fuoco per una visione ottimale.
Attendere circa cinque o 20 minuti affinché le cellule e le perle si depositino nella loro posizione di equilibrio magnetico. Utilizzando questo protocollo, le cellule del sangue sono state separate a seconda dell'altezza di levitazione utilizzando il dispositivo di levitazione magnetica. Sono state utilizzate perle a bassa e alta densità per fornire altezze di levitazione della densità e riferimenti dimensionali.
Le cellule polimorfonucleate levitavano sopra i globuli rossi a 21 millimolari di concentrazione di ioni gadolinio. Le vecchie cellule del sangue levitavano a 60 millimolari di concentrazione di ioni gadolinio. I globuli rossi, le cellule polimorfonucleate e i linfociti sono stati separati a 40 millimolari di concentrazione di ioni gadolinio in base alle loro densità intrinseche.
L'antigene del fattore rhesus è stato rilevato sui globuli rossi utilizzando pere rivestite di anticorpi IgG e anti-RhD. I complessi di globuli rossi di perla non sono stati generati nel campione di controllo IgG, ma sono stati rilevati i globuli rossi colorati fluorescente catturati dalle pere positive al fattore rhesus. Il legame dell'anti-RhB alle cellule positive del fattore rhesus ha creato un complesso di cellule di perla al centro a densità intermittente delle pere non legate e dei globuli rossi negativi.
Inoltre, la complessa formazione è stata confermata osservando la fluorescenza emessa. I complessi di perle B formati tra le perle ad alta e bassa densità rivestite con gli anticorpi per CR1 e CD47 indicano la presenza di vescicole extracellulari derivate dai globuli rossi. Tappare il capillare senza introdurre bolle è il passo più impegnativo e richiede pratica.
Questo metodo potrebbe fornire informazioni per l'ematologia, in particolare focalizzato sulle malattie dei globuli rossi.
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Panoramica
Questo studio presenta una tecnica basata sulla levitazione magnetica per il rilevamento specifico di antigeni nei campioni di sangue, concentrandosi sulle loro proprietà di densità. Il metodo dimostra efficienza nel separare vari tipi di cellule e nell'identificare il fattore renano nei globuli rossi con minima invasività e rapido tempo di risposta.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Tecniche diagnostiche in ematologia
- Separazione dei tipi cellulari basata sulle proprietà fisiche
- Rilevamento di antigeni sanguigni per l'identificazione delle malattie
Contesto
- Importanza della densità cellulare nell'analisi del sangue
- Sfide nel tradizionale processo dei campioni di sangue
- Applicazioni nel rilevamento di condizioni come anemia e sepsi
Metodi utilizzati
- Levitazione magnetica per il rilevamento di antigeni
- Campioni di sangue da donatori con fattore renano positivo e negativo
- Colorazione con coloranti fluorescenti e saggi basati su perline
Risultati principali
- Separazione riuscita delle cellule del sangue basata sulle loro densità utilizzando la levitazione magnetica
- Rilevamento degli antigeni del fattore renano attraverso complessi di perline
- Chiara differenziazione tra cellule polimorfonucleate, linfociti e globuli rossi
Conclusioni
- Il metodo migliora la capacità di analizzare campioni di sangue con ridotta manipolazione
- Fornisce una nuova via di ricerca nelle condizioni ematologiche
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Magnetic levitation enables rapid, label-free separation of cells based on intrinsic density, supporting early discovery workflows where target validation and phenotypic screening require minimal manipulation. The method provides quantitative readouts of antigen presence through bead-bead complex formation, offering a scalable approach for assay development in hematology-focused discovery programs. Its compatibility with standard imaging reduces dependency on specialized instrumentation, enhancing accessibility for cross-functional R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by separating cell subtypes based on density-linked metabolic and activation states.
- Operational Value: Supports functional target validation with minimal sample processing, reducing variability from manipulation steps.
- Predictive Value: Facilitates biomarker-aligned stratification of cell populations for de-risking target engagement hypotheses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative antigen measurements via bead-bead complex levitation height, enabling dose-response analysis.
- Reproducibility: Provides standardized separation based on physical properties, minimizing batch-to-batch variability in cell-based assays.
- Platform Scalability: Compatible with smartphone or tablet imaging, supporting decentralized screening and point-of-need applications.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to hematological disease models, including anemia and sickle cell disease, through density-based cell separation.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving native cell states during separation.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early detection of circulating tumor cells and extracellular vesicles, supporting go/no-go decisions in oncology pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling assay-ready systems for downstream screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating cell subpopulations with distinct density profiles linked to differentiation status.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts for compound effect evaluation without reliance on fluorescent or enzymatic reporters.
- Analytics: Provides levitation height as a measurable output for comparing conditions and assessing target modulation.
- Translational Research: Maintains phenotypic integrity of separated cells, supporting continuity into functional validation assays.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable separation platform applicable across multiple target classes and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in cell-based assays through label-free separation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput via standardized magnetic equilibrium positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing reagent dependency and specialized training needs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through early detection of rare cell populations and antigen levels.
Implementation Considerations
- Requires expertise in magnetic levitation setup and capillary handling to avoid bubble formation.
- Depends on access to tunable magnetic fields and density-calibrated bead systems.
- Necessitates standardization of bead-antigen coupling protocols for reproducible quantitative outputs.
- Adaptation to non-hematological systems may require optimization of bead density and magnetic parameters.
- Practical limitations include sensitivity to capillary sealing quality and equilibration time variability.
