In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

Questo protocollo descrive un saggio di angiogenesi germogliante in vitro che riassume molte caratteristiche della formazione dei vasi sanguigni e può essere utilizzato per testare farmaci. Questo metodo è facile da implementare in laboratorio, robusto e scalabile. Ha molte somiglianze con i saggi che utilizzano cellule endoteliali umane e microsfere.

Questo modello imita robustamente il fenotipo mostrando una selezione difettosa delle cellule della punta endoteliale e una migrazione orientata delle cellule endoteliali che porta all'angiogenesi patologica. Il lavoro può fornire approfondimenti sui meccanismi che regolano l'angiogenesi germinativa, sui geni chiave e sulle vie di segnalazione coinvolte, in particolare eseguendo lo screening genetico. La sfida principale è mantenere la qualità o la pluripotenza delle cellule staminali embrionali di topo in coltura. È importante controllare regolarmente gli stadi di pluripotenza e la morfologia delle linee cellulari.

È anche importante eseguire un cariotipo delle linee cellulari poiché tendono alla coltura per perdere o guadagnare cromosomi. Iniziare rivestendo un pozzetto della piastra di coltura cellulare a sei pozzetti con 500 microlitri di soluzione di gelatina allo 0,1% e metterlo in un incubatore di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi lavare le piastre rivestite di gelatina con PBS e aggiungere 500 microlitri di CM appena preparato più meno mezzo.

Per ottenere una popolazione pura di cellule staminali embrionali di topo o mESC, tripsinizzare la piastra di coltura cellulare con tampone TVP 10x per 30 secondi a temperatura ambiente. Quindi risospendere le cellule in un millilitro di mezzo di differenziazione del mesoderma prima di trasferirle nella piastra a sei pozzetti rivestita di gelatina per 30 minuti per consentire ai fibroblasti embrionali di topo di attaccarsi mentre le mESC rimangono in sospensione. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri prima di contare le cellule vive utilizzando un emocitometro Neubauer nel colorante blu Trypan.

Quindi centrifugare le celle a 200 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un volume appropriato di mezzo di differenziazione del mesoderma. Preparare quattro piatti in polistirolo a basso attacco da 94 millimetri aggiungendo 15 millilitri di acqua sterile sul fondo.

Dopo aver trasferito la sospensione cellulare in un serbatoio di plastica sterile, caricare quattro posizioni di una pipetta multicanale con 22 microlitri di sospensione cellulare per canale. Sollevare e posizionare il coperchio rovesciato del piatto da 94 millimetri sulla superficie pulita della camera di flusso con il lato interno rivolto verso l'alto. Depositare 40 gocce della sospensione cellulare sulla superficie interna di ciascun coperchio e capovolgere con attenzione il coperchio senza disturbi per riposizionarlo sul piatto, in modo che le gocce siano rivolte verso l'acqua.

Incubare i piatti in un incubatore di anidride carbonica per quattro giorni, considerando questo come il giorno zero della differenziazione. Dopo quattro giorni di incubazione, raccogliere le gocce appese in un tubo conico da 15 millilitri utilizzando una pipetta P1000. Lasciare sedimentare EB nel tubo prima di rimuovere il surnatante.

Risospendere gli EB in tre millilitri di mezzo di differenziazione vascolare 2x prima di trasferire e distribuire uniformemente la sospensione di EB in un piatto rivestito di agar da 60 millimetri. Incubare i piatti in un incubatore ad anidride carbonica fino al nono giorno con un aggiornamento medio ogni due giorni. Preparare un piatto di coltura da 35 millimetri aggiungendo un millilitro del mezzo di germinazione sul fondo.

Per indurre la gelificazione, incubare il piatto a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Raccogliere gli EB di nove giorni da un piatto di agar in un tubo conico da 15 millilitri e rimuovere il surnatante. Risospendere gli EB in due millilitri di terreno di germinazione a freddo per trasferirli al piatto di coltura rivestito con il primo strato di terreno di germinazione.

Distribuire gli EB su tutta la piastra, assicurandosi che siano a una distanza uguale l'uno dall'altro. La prima formazione di germogli dovrebbe essere evidente dopo l'incubazione per circa 24-48 ore. Il giorno 12, utilizzare una spatola per trasferire con cura il gel di collagene contenente EB su un vetrino.

Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta e disidratare il gel posizionando un foglio di garza di lino di nylon e schede filtranti assorbenti sopra il gel. Applicare una pressione con un peso di 250 grammi per due minuti. Quindi rimuovere le carte di nylon per consentire ai vetrini di asciugare all'aria per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'essiccazione, fissare gli EB usando la soluzione di zinco durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere il fissativo prima di lavare i vetrini cinque volte con PBS. Permeabilizzare gli EB e PBS contenenti lo 0,1% di Triton X-100.

Dopo 15 minuti, rimuovere la soluzione di permeabilizzazione per lavare i vetrini cinque volte con PBS per cinque minuti. Incubare gli EB nel tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente e lavare con PBS per cinque minuti. Quindi aggiungere l'anticorpo primario diluito nel tampone bloccante e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.

Quindi incubare i vetrini con l'anticorpo secondario Goat anti-Rat Alexa 555 in un tampone bloccante per due ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini tre volte con PBS per cinque minuti e una volta con acqua prima di montarli per la microscopia. Il test di angiogenesi 3D è stato effettuato su tre EB con due farmaci, DC101 e DAPT.

Entrambi i composti hanno progressivamente bloccato l'angiogenesi nel modello EB con concentrazioni crescenti. Le varie concentrazioni di farmaci negli EB hanno dimostrato che alte dosi di DC101 inibiscono il numero e la lunghezza dei germogli dei vasi. DAPT ha avuto effetti opposti alla dose di una micromole per litro.

Il DAPT ha aumentato fortemente il numero di cellule della punta endoteliale per germogli vaso con un fenotipo errante anche a basse dosi, rispetto a DC101. È stata osservata una germinazione dei vasi difettosa nelle EB di teleangectasia emorragica ereditaria dal controllo ACVRL1 e nei genotipi eterozigoti ACVRL1 con numerosi fenotipi errati che germogliano ad angoli casuali rispetto ai vasi genitori. Le miscele di una linea mESC wild-type con un rapporto uno-a-uno con una linea wild-type mESC non etichettata, hanno portato a un uguale contributo alle principali cellule della punta endoteliale.

L'analisi microscopica di questo EB chimerico rappresentativo è stata condotta per identificare l'origine genotipica delle principali cellule della punta endoteliale. Per quantificare la copertura cellulare murale del germoglio vasale, gli EB sono stati fissati e colorati per marcatori di cellule endoteliali, PECAM e marcatore cellulare murale, actina di muscolo liscio alfa. Un'immagine ad alto ingrandimento ha rivelato che un singolo germoglio di vaso era circondato da celle murali.

La trasformazione binaria è stata eseguita dopo la separazione dei canali di colore ed è stato quantificato il rapporto dei vasi PECAM positivi coperti da cellule murali alfa SMA positive. Il background genetico della linea di cellule staminali embrionali è anche un fattore chiave che i ricercatori devono considerare poiché alcune linee germogliano meglio di altre. Questo metodo può essere utilizzato per eseguire lo screening genetico utilizzando approcci RNAi o una banca di cellule staminali embrionali di topo che ospitano mutazioni genetiche.