Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi
9 giugno 2021
Qui descriviamo un metodo per visualizzare la sinaptogenesi dei neuroni granuli nel cervelletto del topo nel corso dello sviluppo postnatale del cervello quando queste cellule perfezionano le loro strutture sinaptiche e formano sinapsi per integrarsi nel circuito cerebrale generale.
Il protocollo studia i neuroni dei granuli cerebellari attraverso diverse fasi di sviluppo al fine di visualizzare la crescita morfologica chiave. I vantaggi della tecnica includono il targeting specifico delle cellule, la rapida espressione dei costrutti trasfettati e l'etichettatura sparsa delle cellule che consente lo studio degli effetti autonomi delle cellule. Iniziare tagliando un segmento di 11,2 millimetri dalla punta di una pipetta di carico e posizionare la parte tagliata sulla punta della siringa Hamilton come distanziatore per limitare la profondità di iniezione a 1,5 millimetri.
Fissare il distanziatore sulla punta della siringa con adesivo o parafilm. Per studiare la morfologia di singoli CGN elettroporati da sezioni cerebrali sagittali del cucciolo sperimentale, prendere immagini Z-stack a 0,5 micrometri per pila su un microscopio confocale. Immagine di una cella per finestra dell'immagine per consentire una facile analisi delle immagini e la ricostruzione 3D.
Analizza la lunghezza dei neuriti e la formazione dell'artiglio dendritico in cieco usando un semplice tracciante di neuriti. Carica immagini Z-stack a canale singolo di CGN elettroporate nelle Fiji e fai clic su Plugins"Segmentation" e Simple Neurite Tracer"Select Create New 3D Viewer" dal menu a discesa. Scorrere fino alla base di un dendrite che si collega al soma cellulare e iniziare un percorso facendo clic sulla giunzione.
Tracciare manualmente il percorso facendo clic sulle sezioni in cui il segnale di riempimento della cella è più luminoso e premendo Y per mantenere la traccia. Traccia fino alla fine del dendrite e conferma il percorso premendo F.In alternativa, traccia fino alla base dell'artiglio. Quindi, traccia l'artiglio dalla base della struttura fino alla fine del neurite più lungo.
Traccia i rami secondari e terziari tenendo premuto CTRL su Windows o ALT su macOS e facendo clic sul percorso. Confermare il percorso premendo F.Osservare che le misurazioni per le tracce sono visibili in una finestra separata. Sommare tutte le dimensioni dei rami dell'artiglio per ottenere la lunghezza totale per ciascun artiglio.
Nell'analisi rappresentativa, le immagini di proiezione di CGN elettroporate da 3 a 14 giorni dopo l'iniezione hanno mostrato una progressiva diminuzione del numero di dendriti. I CGN hanno subito una fase di crescita dendritica seguita da un affinamento da 3 DPI a 7 DPI che ha portato alla potatura di oltre il 50% dei dendriti in eccesso. Questo evento coincide con il graduale allungamento delle pergole rimanenti nella formazione di strutture simili ad artigli alla fine di ogni dendrito, indicando che questi processi di sviluppo stanno avvenendo contemporaneamente.
Con 7 DPI, gli artigli sono stati trovati su circa il 75% dei dendriti. Ogni CGN marcato è stato ricostruito in NMRS per quantificare l'area superficiale somato-dendritica totale e il volume. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nelle dimensioni della CGN durante lo sviluppo.
Sebbene a 7 DPI, i CGN hanno mostrato una significativa diminuzione del 20% del volume rispetto a 3, 5 e 10 DPI. La cosa più importante nella procedura è individuare con precisione il cervelletto prima dell'iniezione. Il metodo può essere adattato per manipolare geneticamente i geni in vivo per studiare il loro ruolo nello sviluppo dei neuroni granuli mediante trasfezione di shRNA, siRNA o Cre Recombinasi.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per lo studio dello sviluppo morfologico dei neuroni granulari cerebellari (CGNs) nel cervelletto del topo in via di sviluppo, mediante elettroporazione in vivo. La tecnica consente un'etichettatura sparsa e la manipolazione genetica dei CGNs, permettendo un'analisi dettagliata della crescita dendritica, della formazione degli uncini e della sinaptogenesi durante le fasi chiave dello sviluppo. Il metodo combina iniezione precisa, imaging confocale e analisi morfometrica quantitativa per monitorare la maturazione dei CGNs nel tempo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Biologia cellulare
Sfondo
- I neuroni subiscono cambiamenti strutturali e funzionali significativi durante lo sviluppo del cervello.
- Il cervelletto dei roditori è un sistema modello per lo studio della morfogenesi a livello cellulare, in particolare dei neuroni granulari del cervelletto (CGNs).
- I CGNs formano artigli dendritici specializzati che sono fondamentali per l'input sinaptico.
- I metodi tradizionali di marcatura spesso mancano di specificità cellulare o di risoluzione temporale.
Scopo dello studio
- Visualizzare e quantificare lo sviluppo morfologico di singoli neuroni granulari del cervelletto (CGNs) in vivo.
- Monitorare la crescita dendritica, la potatura e la formazione delle espansioni terminali in diversi punti temporali dello sviluppo.
- Fornire una piattaforma per la manipolazione genetica cellulo-autonoma dei CGNs.
Metodi Utilizzati
- Elettroporazione in vivo di progenitori di neuroni granulari nel cervelletto in sviluppo del topo.
- Etichettatura sparsa dei neuroni granulari cerebellari per un'analisi morfologica chiara.
- Microscopia confocale con acquisizione di Z-stack per la ricostruzione tridimensionale.
- Tracciamento manuale e quantificazione della lunghezza dei neuriti e delle strutture a uncino dendritiche mediante Fiji e Simple Neurite Tracer.
Risultati principali
- Le immagini di proiezione da 3 a 14 giorni dopo l'iniezione (DPI) hanno rivelato una diminuzione progressiva del numero di dendriti per CGN.
- Tra 3 e 7 DPI, i CGN hanno subito un potatura dendritica, eliminando oltre il 50% dei dendriti in eccesso.
- Strutture a forma di artiglio si sono formate alle estremità dei dendriti rimanenti, con artigli presenti su circa il 75% dei dendriti entro 7 DPI.
- La dimensione dei CGN è rimasta sostanzialmente costante, sebbene sia stata osservata una significativa riduzione del 20% del volume a 7 DPI rispetto agli altri punti temporali.
Conclusioni
- Il protocollo consente un'analisi dettagliata e specifica per cellula dello sviluppo morfologico dei neuroni granulari cerebellari in vivo.
- Il rimodellamento dendritico e la formazione degli uncini avvengono contemporaneamente durante la maturazione dei neuroni granulari cerebellari.
- Il metodo è adattabile per manipolazioni genetiche allo studio della funzione genica nello sviluppo dei neuroni granulari cerebellari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'analisi quantitativa in vivo della morfologia dei neuroni granulari cerebellari (CGN) e dello sviluppo delle sinapsi risponde a un'esigenza fondamentale di affidabilità predittiva nella validazione di bersagli nello sviluppo neurobiologico. L'etichettatura sparsa e le capacità di manipolazione genetica permettono una riduzione del rischio meccanicistica nelle fasi iniziali della scoperta del sistema nervoso centrale. Questo approccio favorisce una continuità traslazionale collegando la morfogenesi cellulare all'integrazione sinaptica, fornendo indicazioni per le decisioni strategiche nei programmi di ricerca e sviluppo incentrati sulla neurobiologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi diretta della funzione genica nella morfogenesi e nella sinaptogenesi dei CGN.
- Consente la riduzione del rischio meccanicistico isolando gli effetti cellula-autonomi in vivo.
- Fornisce letture quantitative per la validazione di bersagli guidata da ipotesi.
- Semplifica il triage dei bersagli nello sviluppo neurologico in base a fenotipi morfologici e sinaptici.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce flussi di lavoro validati e riproducibili per l'acquisizione di immagini e l'analisi della morfologia neuronale.
- Fornisce metriche quantitative come numero di dendriti, formazione di espansioni terminali e lunghezza dei neuriti per analisi successive.
- Permette la standardizzazione dei saggi mediante analisi morfometrica assistita da software e in cieco.
- Prepara sistemi biologici robusti per lo screening di composti o di modificazioni genetiche in percorsi del sistema nervoso centrale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Correla i fenotipi morfologici con lo sviluppo sinaptico rilevante per le malattie nei modelli roditore.
- Permette una transizione continua dalla fase iniziale di scoperta alla validazione preclinica di interventi sullo sviluppo neurologico.
- Fornisce una piattaforma per la valutazione di biomarcatori traslazionali della maturazione sinaptica.
- Riduce i rischi del progresso collegando i cambiamenti cellulari agli esiti funzionali delle sinapsi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo integra le fasi iniziali della scoperta fino all'identificazione dei composti guida nella ricerca sul sistema nervoso centrale, consentendo test iterativi delle ipotesi e fenotipizzazione quantitativa di interventi genetici o farmacologici.
- Biologia della Scoperta: Supporta il test dell'ipotesi nulla per la funzione genica nella morfogenesi neuronale e nella formazione delle sinapsi.
- Screening: Fornisce output riproducibili e quantitativi per l'analisi della struttura dendritica e sinaptica.
- Analisi: Offre misurazioni assistite da software e in cieco della lunghezza dei neuriti, degli artigli dendritici e del volume cellulare.
- Ricerca Translazionale: Collega i fenotipi cellulari allo sviluppo sinaptico rilevante per le malattie in vivo.
- Riutilizzo Aziendale: Adattabile a diverse manipolazioni genetiche e sistemi modello del sistema nervoso centrale in vari programmi di scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dei bersagli neurosviluppali e nella riduzione del rischio meccanicistico.
- Valore operativo: Standardizza l'imaging in vivo e l'analisi morfometrica per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione collegando la perturbazione genica a fenotipi neuronali quantificabili.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli del sistema nervoso centrale aggiustata in base al rischio, sulla base di dati solidi ottenuti in vivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in neuroanatomia dei roditori e tecniche precise di iniezione stereotassica.
- Necessita di accesso alla microscopia confocale e a software avanzati per l'analisi delle immagini (ad esempio, Fiji, Simple Neurite Tracer).
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per l'analisi in cieco e l'interpretazione dei dati.
- È adattabile a diverse costruzioni genetiche (shRNA, siRNA, ricombinasi Cre) per studi cellula-autonomi.
- L'accuratezza dell'iniezione e l'efficienza di marcatura cellulare sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Preparing the Injection Syringe for Electroporation
2:34
Results: Analysis of Granule Neuron Morphology and Size During Cerebellar Development
3:45
Conclusion
1:00
Morphological Analyses of Cerebellar Granule Neurons (CGNs): 3D Reconstruction
