Name: Rilevamento dellaggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Impara a rilevare l'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS) in lisati cellulari e cellule vive. Questo metodo analizza le proprietà di diffusione di proteine associate alla SLA come TDP25 e SOD1 mutante.

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A.K. è stato sostenuto da una sovvenzione della Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), da una sovvenzione della Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, da una sovvenzione dell'Ufficio universitario di Hokkaido per lo sviluppo dei futuri leader della ricerca (L-Station) e da una sovvenzione della Hoansha Foundation. M. K. è stato parzialmente supportato da una sovvenzione JSPS per la ricerca scientifica su aree innovative "Chimica per biosistemi multimolecolari di affollamento" (#20H04686) e da una sovvenzione JSPS per la ricerca scientifica su aree innovative "Fisica dell'informazione delle questioni viventi" (#20H05522).

1. Materiali e reagenti
<ol><li>Utilizzare soluzioni e mezzi pirogenici liberi per la coltura cellulare(tabella 1).</li>
	<li>Preparare soluzioni per l'esperimento biochimico utilizzando acqua ultrapura e utilizzare come privo di DNasi/RNasi.</li>
	<li>Selezionare un FBS appropriato per le impostazioni cultura delle celle con un processo di controllo del lotto. Poiché il lotto FBS selezionato cambia regolarmente, il catalogo e il numero di lotto per FBS non possono essere rappresentati qui.</li>
	<li>DNA plasmide<ol>
<li>Preparare pmeGFP-N15 per l'espressione monomero eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 per l'espressione GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 per l'espressione SOD1-G85R-GFP; e pCAGGS8 come vettore. NOTA: il meGFP è una variante monomerica che porta la mutazione A206K della GFP potenziata (eGFP). TDP25 è un frammento di terminale C associato alla SS del TDP-43. SOD1-G85R è un mutante associato alla SS di SOD1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ceppo cellulare<ol>
<li>Utilizzare cellule neuroblastoma neuro2a murine. NOTA: Le cellule Neuro2a hanno un'elevata efficienza di trasfezione e proteine esogene altamente esplicite. Per l'espressione di TDP25, sono necessari ceppi cellulari con elevate efficienze di espressione come le cellule Neuro2a o HEK293. Nelle cellule HeLa, TDP25 non è stato in grado di essere espresso in modo efficiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Coltura cellulare e trasfezione
<ol><li>Preparare un piatto di plastica da 100 mm che coltiva cellule Neuro2a semi-confluenti nel normale mezzo di crescita. NOTA: È necessario incubare a 37 °C per circa 48-72 ore dopo la semina precedente fino al raggiungere la semi-confluenza.</li>
	<li>Rimuovere il supporto.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di soluzione di tripside-EDTA nel piatto di coltura cellulare e incubarli a 37 °C per 1 min.</li>
	<li>Aggiungere 9,5 mL di mezzo di crescita normale nel piatto e sospendere le cellule staccate.</li>
	<li>Usando Trypan blue per macchiare le celle morte, contare il numero di celle utilizzando un contatore di celle o manualmente. Quindi diluire le cellule nel mezzo di coltura (1,0 × 105/mL).</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di sospensione cellulare in un piatto di plastica da 35 mm per la lisi cellulare o in una base di vetro per la misurazione delle cellule vive.</li>
	<li>Incubare il piatto a 37 °C per 1 giorno.</li>
	<li>Iniziare i seguenti preparativi 15 minuti prima del giorno della trasfezione.</li>
	<li>Preparare due tubi da 1,5 ml e aggiungere 100 μL di Opti-MEM I a ciascun tubo.</li>
	<li>Nel primo tubo, mescolare 1,0 μg di DNA plasmide (soluzione A). Nel secondo tubo, mescolare 2,5 μL di lipofectamina 2000 (soluzione B). NOTA: Per mantenere l'efficienza di trasfezione, mantenere la quantità totale di DNA uguale. Per ridurre il livello di espressione per la misurazione FCS nelle cellule vive, la quantità frazionata di DNA plasmide per l'espressione proteica dovrebbe diminuire (ad esempio, 0,2 μg di pmeGFP-N1-SOD1-G85R e 0,8 μg di miscela pCAGGS). Inoltre, mantenere lo stesso rapporto tra il volume di Lipofectamina 2000 e la quantità di DNA plasmide.</li>
	<li>Mescolare delicatamente la soluzione A e B aggiungendone una in entrambi i tubi, quindi incubarla per 1 minuto a temperatura ambiente (soluzione C).</li>
	<li>Aggiungere la soluzione C al supporto di coltura; e incubare le cellule per 24 ore a 37 °C.</li>
</ol>3.Lisi cellulare e scambio medio
<ol><li>Controllare l'espressione GFP utilizzando un microscopio di routine.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo nel piatto.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di PBS a 25 °C per lavare il mezzo. Rimuovere il PBS.</li>
	<li>Posizionare il piatto su una piastra di alluminio sopra il ghiaccio schiacciato. NOTA: Utilizziamo una piastra di alluminio spessa 1 mm tagliata in un negozio di utensili domenicale o disponibile in commercio come attrezzatura da laboratorio.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di tampone dilisi a 4 °C. Agitare leggermente il piatto in modo che il tampone sia distribuito uniformemente nella parte inferiore del piatto.</li>
	<li>Raschiare il piatto utilizzando un raschietto cellulare e recuperare il lisato con detriti cellulari non dissolti in un nuovo tubo da 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione a 20.400 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Recuperare il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 ml e tenerlo a 4 °C o sul ghiaccio. NOTA: Non congelare il lisato.</li>
	<li>Per le misurazioni delle cellule vive, sostituire il supporto prima della misurazione. Controllare l'attacco cellulare utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Confermare l'espressione utilizzando un microscopio a fluorescenza.</li>
</ol>4. Calibrazione della spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS)
<ol><li>Avviare il sistema ed eseguire il software operativo. Accendere il laser Argon+ (458/477/488/514 nm). Stabilizzare il sistema almeno per 30 minuti.</li>
	<li>Impostare il percorso ottico: Splitter fascio principale: HFT488; Specchio dicroico: NFT600; Filtro barriera a fluorescenza: filtro passa banda 505-540 (BP505-540); Rivelatore: fotodiodo valanghe (APD)).</li>
	<li>Impostare la dimensione del foro stenopeica inserendo direttamente il valore (66 μm; 1 unità ariosa).</li>
	<li>Aggiungere la soluzione Rhodamine 6G (Rh6G) in un pozzo della camera di vetro di copertura sul palco.</li>
	<li>Aggiungere l'acqua ultrapura ad immersione sull'obiettivo. Non utilizzare l'olio ad immersione.</li>
	<li>Impostare la camera sul palco del microscopio. Spostare il palco nella posizione appropriata.</li>
	<li>Concentrati sulla superficie superiore del vetro misurando la luce diffusa dalla superficie del vetro. Dopo aver abbassato l'obiettivo verso il basso, ruotare la manopola di messa a fuoco in senso orario per regolare. NOTA: Controllare la direzione di rotazione della manopola di messa a fuoco perché è opposta tra quelle realizzate in Giappone e Germania.</li>
	<li>Sollevare il punto focale 200 μm sopra la superficie superiore del vetro per osservare l'interno della soluzione.</li>
	<li>Fare clic sulla frequenza di conteggio e monitorare la frequenza di conteggio dei fotoni.</li>
	<li>Aumentare gradualmente il valore aotf (acousto-optic tunable filters) (ad esempio, trasmissione laser ad eccitazione) in modo che il valore della velocità di conteggio sia superiore a 10 kHz.</li>
	<li>Fate clic sulla regolazione del foro stenopeica e aprite la procedura guidata di regolazione del foro stenopeica. Trova la posizione del foro stenopeica con il numero più alto (un picco) di fotoni sia nell'asse x che in quello y.</li>
	<li>Ruotare l'anello di correzione della lente oggettiva in modo che il valore di conteggio per molecola (CPM) sia il più alto. NOTA: Poiché lo spessore del vetro di copertura della camera qui specificato è di 0,12-0,17 mm, l'anello di correzione è intorno al suo minimo o a pochi giri da esso, dove il CPM è al massimo.</li>
	<li>Diminuire gradualmente il valore AOTF in modo che il valore CPM diventi 2-3 kHz.</li>
	<li>Acquisire la funzione di autocorrelazione (ACF) di Rh6G per 90 s.</li>
	<li>Una volta completata la misurazione, fate clic su Adatta (Fit) per eseguire l'analisi del raccordo a curva.</li>
	<li>Selezionate un modello per la diffusione tridimensionale (3D) un componente con uno stato di tripletta. NOTA: Il Rh6G è monodisperso e diffuso monocomponente con uno stato di tripletta.</li>
	<li>Impostare l'ora di inizio del raccordo spostando la linea rossa. Fate clic su Adatta tutto (Fit All) e selezionate la deviazione di adattamento. Dopo aver eseguito il raccordo a curva, assicurarsi che il tempo di diffusione (DT) e il parametro di struttura (SP) siano approssimativamente nell'intervallo di 20-30 μs e 4-8, rispettivamente.</li>
	<li>Ricordare il valore del parametro strutturale. Utilizzare il valore SP per l'analisi del raccordo a curva di tutti gli ACL misurati lo stesso giorno, nelle stesse condizioni ottiche, e utilizzando lo stesso tipo di base in vetro o vetro di copertura a camera impostato sullo stadio del microscopio.</li>
</ol>5. Misurazione FCS nel llysato cellulare
<ol><li>Preparare i lire cellulari (vedi sopra).</li>
	<li>Posizionare il llysate sulla camera di vetro di copertura. Posizionare un coperchio per evitare l'asciugatura e il coperchio del palco per un'ombreggiatura leggera.</li>
	<li>Impostare le condizioni di acquisizione, la potenza del laser, il tempo di misurazione e le ripetizioni.</li>
	<li>Fare clic su Count rate e regolare il valore AOTF del laser in modo che il valore CPM diventi più di 1 kHz.</li>
	<li>Eseguire una misurazione di prova per 1 minuto. Verificare se l'ACF calcolato mostra un'ampiezza positiva e un decadimento liscio.</li>
	<li>Eseguire la misurazione principale per 5 minuti. NOTA: Il tempo totale di misurazione viene gradualmente aumentato fino a quando la forma dell'ACF non cambia anche se il tempo di misurazione è aumentato.</li>
	<li>Fate clic su Adatta (Fit) per eseguire l'analisi del raccordo curva.</li>
	<li>Selezionate un modello per la diffusione 3D a due componenti con uno stato di tripletta. Ricordarsi di immettere il valore SP e modificarne l'impostazione su "Fisso" non "Libero" prima di fare clic su Adatta tutto.</li>
	<li>Esportare la tabella adattata come file di testo delimitato da tabulazioni.</li>
	<li>Se necessario, esportare il record ACF e Count rate come file di testo delimitato da tabulazioni.</li>
</ol>6. Misurazione FCS nelle cellule vive
<ol><li>Sostituire il mezzo con uno fresco prima della misurazione.</li>
	<li>Utilizzare un incubatore di palcoscenico termico. Impostare il piatto di coltura cellulare sul palco del microscopio.</li>
	<li>Confermare la messa a fuoco e la posizione utilizzando la micropia confocale. Selezionare la cella di misura. Ingrandire e regolare la posizione della cella. Acquisire immagini a fluorescenza di una cella che esprime GFP utilizzando la modalità di velocità di scansione lenta.</li>
	<li>Selezionare una posizione di misurazione FCS utilizzando Posizione nella sezione "FCS".</li>
	<li>Selezionare almeno un punto di misurazione FCS utilizzando un mirino (Figura 1).</li>
	<li>Misurare l'ACF per 1 min. NOTA: Poiché le proteine fluorescenti tendono ad essere fotolicenza nelle cellule vive a causa del movimento lento rispetto alla soluzione, il tempo di misurazione dovrebbe essere minimo. È generalmente difficile ottenere ACF nella cellula senza intoppi come le misurazioni della soluzione perché la misurazione prolungata porterà al fotoblesaggio delle proteine fluorescenti.</li>
	<li>Fate clic su Adatta (Fit) per eseguire l'analisi del raccordo di curva utilizzando un modello per la diffusione 3D a due componenti con uno stato di tripletta. NOTA: Per le misurazioni delle cellule vive, un modello per la diffusione 3D a due componenti con uno stato di tripletta sarebbe migliore perché è empiricamente difficile ridurre il valore chi quadrato con un modello di diffusione 3D a un componente a causa dell'esistenza di vari componenti mobili nella cella viva. Ma anche utilizzando un modello per la diffusione 3D a tre componenti, i componenti di diffusione di solito non sono separati rispetto all'utilizzo del modello per due componenti.</li>
</ol>

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<li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li>
<li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li>
<li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
</ol>

Questi autori non hanno conflitti di interesse.

Per quanto riguarda la taratura del sistema prima delle misurazioni, devono essere utilizzate le stesse vetrerie utilizzate per misurare il campione (ad esempio, la camera di vetro di copertura a 8 pozzi per il lisato cellulare e la base in vetro da 35 mm per celle vive). A causa dell'adsorbimento di Rh6G sul vetro, la sua concentrazione effettiva può talvolta diminuire. In tal caso, una soluzione Rh6G altamente concentrata come 1 μM deve essere utilizzata solo per la regolazione del foro stenopeica. Le velocità di conte...

Le aggregazioni proteiche che coinvolgono disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, il morbo di Huntington ecosì via sono note per essere tossiche e disturberebbero l'omeostasi proteica (proteostasi) nelle cellule e negli organi, che potrebbe quindi portare all'invecchiamento2. La clearance dell'aggregazione proteica è prevista come strategia terapeutica; tuttavia, non sono ancora state stabilite sostanze chimiche che impediscono la formazione di aggregazione proteica e degradano aggregati proteici (ad esempio, piccole molecole o farmaci). Inoltre, il modo in cui l'aggregazione proteica esercita la tossicità rimane inafferrabile. Pertanto, per promuovere progetti di ricerca relativi all'aggregazione proteica, è importante introdurre procedure ad alta produttività per rilevare semplicemente l'aggregazione proteica. Il rilevamento dell'aggregazione proteica utilizzando anticorpi che riconoscono la conformazione dell'aggregazione proteica e del colorante fluorescente specifico dell'aggregazione è statoampiamente utilizzato 3. Tuttavia, è difficile rilevare l'aggregazione, specialmente nelle cellule vive che utilizzano tali procedure classiche. 
Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è una procedura per rilevare l'aggregazione proteica e il cambiamento strutturale. Tuttavia, fret non è in grado di analizzare la dinamica proteica (ad esempio, diffusione e oligomerizzazione delle proteine nelle cellule vive)3. Pertanto, introduciamo qui un semplice protocollo per rilevare l'aggregazione proteica in soluzione (ad esempio, lisato cellulare) e cellule vive utilizzando spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS), che misura la proprietà di diffusione e la luminosità delle molecole fluorescenti con sensibilità a singolamolecola 4. FCS è un metodo di conteggio dei fotoni utilizzando un microscopio confocale a scansione laser (LSM). Utilizzando un rivelatore di fotoni altamente sensibile e il calcolo della funzione di autocorrelazione (ACF) del tempo di arrivo del fotone, viene misurato il passare attraverso il tempo e la luminosità delle molecole fluorescenti nel volume di rilevamento. La diffusione rallenta con un aumento del peso molecolare; pertanto, l'interazione intermolecolare può essere stimata utilizzando FCS. Ancora più potentemente, un aumento della luminosità della molecola fluorescente indica l'omo-oligomerizzazione delle molecole. Pertanto, FCS è un potente strumento per rilevare tale aggregazione proteica.

<table><tbody><tr><td>0,25% (p/v) tripsina-1 mmol/L EDTA&middot; Soluzione 4Na con rosso fenolo (tripsina-EDTA)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in plastica da 100 mm</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Piastra con base in vetro da 35 mm</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td>Per la misurazione di cellule vive</td></tr><tr><td>Piastre in plastica da 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Piastra in alluminio</td><td>Bio-Bik</td><td>AB-TC1</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Obiettivo</td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Sumitomo bachelite Co., Ltd.</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Membrana filtrante in acetato di cellulosa (0,22 mm)</td><td>Advantech Toyo</td><td>25CS020AS</td><td></td></tr><tr><td>Copertura della camera di vetro a 8 pozzetti</td><td>IWAKI</td><td>5232-008</td><td>Per la misurazione</td></tr><tr><td>della soluzione Terreno dell'aquila modificato di Dulbecco (DMEM)</td><td>Terreno basale</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>biosieri</td><td></td><td>È richiesto il controllo del lotto</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 META + ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>FCS sistema</td></tr><tr><td>Neuroblastoma murino Cellule Neuro2a</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>RIKEN</td><td>RDB08938</td><td>DNA plasmidico per il vettore di trasfezione</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina (&times; 100 )</td> <td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>pmeGFP-C1-TDP25</td><td></td><td></td><td>DNA plasmidico per TDP25 marcato con eGFP monomerico</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1</td><td></td><td></td><td>DNA plasmidico per l'espressione del monomero eGFP</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td><td></td><td></td><td>DNA plasmidico per il mutante G85R legato alla SLA di SOD1 marcato con cocktail monomerico di inibitori della</td></tr><tr><td>proteasi</td><td>eGFP Sigma-Aldrich</td><td>P8304</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

L'aggregazione proteica è un segno distintivo di disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SSS), il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Huntington (MH) e così via. Per rilevare e analizzare oligomeri o aggregati proteici solubili o diffusi, è stata utilizzata la spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS), in grado di rilevare la velocità di diffusione e la luminosità di una singola particella con una singola sensibilità molecolare. Tuttavia, la procedura e il know-how adeguati per il rilevamento dell'aggregazione proteica non sono stati ampiamente condivisi. Qui, mostriamo una procedura standard di misurazione FCS per le proprietà di diffusione delle proteine soggette a aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive: frammento carbossile-terminale associato alla SLA di DNA/proteina legante l'RNA 43 kDa (TDP25) e superossido dismutasi 1 (SOD1). I risultati rappresentativi mostrano che una parte degli aggregati di TDP25 taggato da proteine fluorescenti verdi (GFP) è stata leggermente inclusa nella frazione solubile del neuroblastoma murino Neuro2a cell lysate. Inoltre, sod1 con tag GFP che trasporta mutazioni associate alla SS mostra una diffusione più lenta nelle cellule vive. Di conseguenza, qui introduciamo la procedura per rilevare l'aggregazione proteica attraverso la sua proprietà di diffusione utilizzando FCS.

Abbiamo eseguito la misurazione FCS di GFP-TDP25 in lisato cellulare e SOD1-G85R-GFP in cellule vive. In entrambi i casi, è stato possibile acquisire un'ampiezza positiva e aFS lisci. Abbiamo dimostrato che una porzione di GFP-TDP25 espressa in cellule Neuro2a è stata recuperata nella frazione solubile nella condizione indicata6. Nella frazione solubile del lisato cellulare, molecole di fluorescenza estremamente luminose sono state rilevate nel record di velocità di conteggio dei fotoni utilizzand...

Introduciamo qui una procedura per misurare gli oligomeri proteici e l'aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive utilizzando la spettroscopia di correlazione a fluorescenza.

Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Il miglior principio della spettroscopia di correlazione a fluorescenza, FCS, è stato inventato inizialmente negli anni '70. Negli anni '90, importanti e molti miglioramenti per fcs sono stati stabiliti combinando con una microscopia confocale apparato. Da allora, FCS è stato utilizzato per molte applicazioni di cura chimica e virale, come le interazioni molecolari e l'analisi dell'aggregazione proteica.L'aggregazione proteica è un segno distintivo dei disturbi neurodegenerativi. La luminosità della fluorescenza sono singole particelle in azione delle dimensioni molecolari spiegate dalle proprietà di diffusione. È molto importante nella misurazione delle aggregazioni proteiche perché può determinare i cicli di vita previsti delle molecole, ma anche distinguere l'omo o l'etero polimerizzazione.Qui, introduciamo una procedura per misurare la diffusione della sclerosi laterale amiotrofica associata a proteine a forma aggregata utilizzando FCS nei lisati cellulari e nelle cellule vive. Preparare 100 millimetri di plastica che coltiva la cellula Neuro2a seduta comodamente nel normale mezzo di crescita. Confermare la confluenza della cella.Rimuovere il supporto. Aggiungere 3,5 millilitri di soluzione trypsina-EDTA nel terzo piatto della cartuccia e incubarli a 37 gradi celsius per un minuto. Aggiungere 9,5 millilitri di mezzo di crescita normale nel piatto e sospenderli.La sospensione cellulare viene mescolata con il blu tripano per macchiare le cellule morte. Aggiungere la sospensione alla diapositiva di conteggio delle celle. Contare il numero di celle utilizzando il contatore delle celle o manualmente.Controlla il numero di cellulare vivo e la loro vitalità. Diluire la cella nel mezzo contato a 1,0 per 10 alla potenza di 5 per millilitro. Aggiungere due millilitri di sospensione cellulare nel piatto di plastica da 35 millimetri per la lisi cellulare o il piatto dello spazio di crescita per la misurazione delle cellule vive.Incubare il piatto a 37 gradi Celsius per un giorno. Il giorno dopo, preparare la miscela di DNA plasmide e reagenti di trasfezione. Aggiungere la miscela di trasfezione al mezzo contato dalle cellule e incubare le cellule per 24 ore.Un giorno dopo. Controllare l'espressione GFP utilizzando un microscopio di routine. Potete vedere i corpi degli ingredienti TDP25 molto luminosi nelle cellule.La llisi cellulare deve essere eseguita sul banco biochimico. Rimuovere il mezzo nel piatto. Aggiungere due millilitri di PBS a 25 gradi celsius da lavare come mezzo.Rimuovere il PBS. Posizionare il piatto su una piastra di alluminio sulla parte superiore del ghiaccio frantumato. Immediatamente, aggiungere il tampone di lysis da 200 microliter nel piatto.Raschiare il piatto usando un raschietto per cellulari. Recuperare il llysate con detriti cellulari non dissolti in un nuovo tubo da 1,5 millimetri. Centrifugare il lysate a quattro gradi celsius.Per le misurazioni delle cellule vive, sostituire il mezzo con uno nuovo prima della misurazione. Controllare l'attacco cellulare utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Inoltre, controllare l'espressione GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza.Utilizzare un sistema FCS combinato al microscopio confocale. Accendi il laser da 488 nanometri. Stabilizzare il sistema, almeno, per 30 minuti.Impostare il percorso ottico. Utilizzare un laser da 488 nanometri per la luce istantanea. Utilizzare uno splitter a fascio appropriato e metri dicroici.E anche, fusibili a fluorescenza. Di solito, useremo camere in vetro di copertura per la calibrazione e le misurazioni della soluzione. Con attenzione, prendi la camera di vetro di copertura.Posizionare la superficie del vetro sulla carta di screening dell'obiettivo. Versare la calibrazione FCS. Aggiungere anche la soluzione Rhodamine 6G.Aggiungere l'acqua ultrapura sull'obiettivo. Non usare l'olio. Impostare la camera sul palco del microscopio.Spostare il palco nella posizione appropriata. Create la regolazione del foro stenopeica e aprite la procedura guidata di regolazione del foro stenopeica. Monitora la velocità di conteggio dei fotoni come movimento grossolano del foro stenopeica per la direzione x.La posizione più luminosa è stata giustamente determinata. Quindi, monitora la velocità di conteggio dei fotoni come movimento fine. La posizione più luminosa è stata determinata con successo Questa è la posizione del foro stenopeica per la direzione x.Allo stesso modo, cerca la posizione più luminosa del foro stenopeica per la direzione y. Anche la posizione più luminosa per la direzione y è stata determinata con successo. Compound la posizione x e y del foro stenopeico.È meglio regolare la posizione del foro stenopeica prima della misurazione di ogni giorno. Quando il percorso live viene modificato, la posizione del foro stenopeica deve essere regolata di nuovo. Creare una frequenza di conteggio e monitorare la frequenza di conteggio del telefono.Passare alla modalità di monitoraggio CPM. Contare l'anello di correzione dell'oggetto eseguito in modo che il valore CPM sia il più alto. Chiudere la finestra della tariffa di conteggio.Inizia con la misurazione della soluzione Rhodamine 6G. Al termine della misurazione, fate clic sull'adattamento per eseguire l'analisi del raccordo curve. Selezionate un modello per il montaggio della vecchia funzione di correlazione.Per Rhodamine 6G, selezionate il modello per la diffusione tridimensionale a 1 componente con uno stato di tripletta. Impostare l'ora di inizio del raccordo spostando la linea rossa. Fate clic su Adatta tutto (Fit All), per avviare il calcolo del raccordo.Controllare la deviazione di adattamento. Assicurarsi che i lati siano registrati e negativi, intorno allo zero. Controllare i valori montati.Assicurarsi che il tempo di diffusione sia approssimativamente nell'intervallo da 20-30 microsecondi. Inoltre, il parametro strutturale va da quattro a otto. Aprite il pannello di adattamento e selezionate un modello per la misurazione.Immettete lo stesso valore del parametro strutturale nel modello per il campione nel pannello di adattamento. Assicurarsi che il tipo debba essere impostato su Fisso. Misurazione GFP-TDP25 nel llysato cellulare.Posizionare il lysate nella camera di coverglass. Posizionare il coperchio per evitare di asciugare il lisato. Posizionare il coperchio del palco per un'ombreggiatura leggera.Nel pannello di acquisizione, impostare la potenza del laser, il tempo di misurazione e le sue ripetizioni. Avviare l'acquisizione. È stato osservato un picco.Un picco è stato osservato di nuovo. Il picco indica molecole luminose passate attraverso il corpo di rilevamento. I picchi indicano oligomeri o aggregati solubili.Create un adattamento per eseguire l'analisi del raccordo a curva. Selezionate il modello per la diffusione tridimensionale a 2 componenti con stato tripletta. Impostare l'ora di inizio del raccordo.Fare clic su Adatta tutto. Controllare i valori montati. SOD1-G85R taggato con misurazione GFP in una cella viva.A differenza della misurazione della soluzione, consiglio di utilizzare l'incubatore dello stadio di calore. Impostare il piatto di 150 100 zioni sul palco del microscopio. Confermare la messa a fuoco e la posizione utilizzando l'oculare.Selezionare una cella di misura. Ingrandire e regolare la posizione della cella utilizzando una modalità di scansione rapida. Acquisire l'istantanea delle celle utilizzando la modalità di velocità di scansione lenta.Selezionate una posizione di misurazione FCS utilizzando lo strumento Posizione (Position). Il mirino indica la posizione di misura. Avviare la misurazione.La leggera diminuzione del record del tasso di conteggio dei fotoni suggerisce il fotobleaching della GFP. Eseguire il raccordo della curva. Vengono mostrati i risultati rappresentativi della GFP-TDP25 nel llysato cellulare.Il grafico superiore è un record della frequenza di conteggio dei fotoni. Dove ci sono frecce è un picco, che suggerisce oligomeri solubili e aggregati. Il grafico centrale rappresenta la vecchia funzione di correlazione.La linea grigia mostra la funzione di correlazione bassa e vecchia. La linea magenta mostra la funzione montata. Le linee tratteggiate indicano gli orari di inizio e fine per il montaggio.La tabella inferiore mostra il valore montato. Successivamente, vengono mostrati i risultati rappresentativi di SOD1-G85R-GFP in una cella viva. Il grafico superiore rappresenta un record del nostro tasso di conteggio dei fotoni.È stata osservata la graduale diminuzione del tasso di conteggio dei fotoni registrato, suggerendo il fotobleaching della crescita della FPG per diverse misurazioni. Ciò è dovuto alla lenta velocità di diffusione nelle cellule vive. Il grafico centrale rappresenta la vecchia funzione di correlazione di SOD1.La linea grigia mostra la funzione di correlazione bassa e vecchia. La linea magenta mostra la funzione montata. Le linee tratteggiate indicano gli orari di inizio e fine con il raccordo.La tabella inferiore mostra i valori montati. Qui vi mostriamo questa procedura per misurare la diffusione da ogni cellula associata TDP-25 nel lisato cellulare e tutto il mutante di SOD1 nelle cellule vive utilizzando FCS. Gli oligomeri solubili e l'aggregazione nel litolato cellulare possono essere spesso osservati come picchi o esplosioni.D'altra parte, nelle cellule vive, tali picchi sono raramente osservati, ad eccezione di strutture vive possibilmente ovvie. Una specie di SOD1 mutante che si diffonde lentamente aggiunge luminosità media per singole particelle come l'omopolimerizzazione SOD1 all'interno di noi. La procedura qui illustrata è semplice e utile.FCS non contiene radiazioni;stato direttamente dormiente. È solo la tua, e la nostra, empatia immaginativa.

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