Identificazione di proteine immunitarie antibatteriche in Escherichia coli utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e analisi proteomica top-down

Il protocollo dimostra un metodo rapido per l'identificazione di proteine batteriche utilizzando l'induzione antibiotica e la spettrometria di massa. Il vantaggio principale della tecnica è la sua velocità e semplicità. La preparazione del campione è semplice.

La tecnica può essere estesa alla caratterizzazione di eventuali batteri patogeni, come fattori di virulenza o resistenza agli antibiotici per informare meglio il trattamento appropriato per un'infezione batterica. Per iniziare, utilizzare un anello sterile di un microlitro per raccogliere i batteri da singole colonie coltivate su piastra di agar LB. E trasferisci in un tubo microcentrifuga a vite a due millilitri con tappo a vite ad anello O-ring contenente 300 microlitri di acqua di grado HPLC.

Quindi vorticosamente brevemente il tubo e pellet le celle per centrifugazione, a 0,75 microliti di acqua reliquia del surnatante campione sul bersaglio MALDI in acciaio inossidabile, e lasciarlo asciugare. Sovrapporre il punto del campione essiccato con 0,75 microlitri di una soluzione satura di acido sinapinico preparata in 33% acetonitrile, 67% acqua e 0,2% acido trifluoroacetico e lasciare asciugare il punto. Una volta che il punto è asciutto, caricare il bersaglio nello spettrometro di massa.

Aprire il software di acquisizione e fare clic su MS Linear Mode Acquisition o mass-to-charge range e mass-to-charge dei limiti inferiore e superiore nei rispettivi campi. Fare clic sul punto di esempio da analizzare sul modello di destinazione MALDI. Quindi premere il pulsante sinistro del mouse e trascinare il cursore sul punto campione per specificare la regione rettangolare da campionare per un'ablazione o una ionizzazione laser.

Rilascia il pulsante del mouse per avviare l'acquisizione e raccogli 1000 colpi laser per ogni punto campione. Se gli ioni non vengono rilevati, aumentare l'intensità del laser regolando la barra della scala scorrevole sotto l'intensità del laser fino a quando non viene rilevato il segnale ionica proteico. Dopo aver completato l'acquisizione della modalità lineare MS, fare clic su MS/MS Reflectron Mode Acquisition.

Immettere la massa del precursore da analizzare nel campo Massa precursore. Quindi, immettere una larghezza di isolamento in dalton nella finestra Massa precursore per il lato di massa bassa e alta della massa precursore. Fare clic sul pulsante CID Off.

Quindi fare clic sul pulsante Soppressore metastabile acceso. Regolare l'intensità del laser ad almeno il 90% del suo valore massimo regolando la barra della scala scorrevole come dimostrato. Fare clic sul punto campione da analizzare sul modello di destinazione MALDI, quindi premere il pulsante sinistro del mouse e trascinare il cursore sul punto campione per specificare la regione rettangolare da campionare per l'ablazione o la ionizzazione laser, rilasciare il pulsante del mouse per avviare l'acquisizione e raccogliere 10.000 colpi laser per ogni punto campione come dimostrato.

Fare doppio clic sul file eseguibile del cercatore di biomarcatori proteici e verrà visualizzata la finestra dell'interfaccia utente grafica. Immettere la massa del biomarcatore proteico nel campo Massa proteica matura e l'errore di misurazione della massa nel campo Tolleranza di massa. Facoltativamente, fai clic sul pulsante Calcolatore di massa proteica a ioni b/anno gratuito per calcolare la massa proteica da una presunta coppia di ioni frammento complementare e verrà visualizzata la finestra pop-up dello strumento Calcolatore di massa proteica.

Inserisci il rapporto massa/carica della presunta coppia di ioni frammento complementare, fai clic sul pulsante Aggiungi coppia e apparirà la massa proteica calcolatrice. Copia incolla questo valore nel campo Massa proteica matura e chiudi la finestra degli strumenti Calcolatore di massa proteica. Fare clic sulla casella Imposta restrizione residui.

Selezionare la lunghezza del peptide del segnale terminale finale e il pop-up con una scala scorrevole e un cursore apparirà e sposterà il cursore sulla lunghezza del peptide del segnale desiderata. Se la lunghezza del peptide del segnale non è selezionata, il software eseguirà un troncamento di sequenza senza restrizioni. Sotto la condizione di ione del frammento, selezionare i residui per la scissione della spina dorsale polipeptidiche facendo clic sulle caselle di uno o più residui, D-E-N e / o P.E quindi fare clic sul pulsante Inserisci ioni frammento più uno da cercare e verrà visualizzata la pagina del frammento pop-up.

Quindi fare clic sul pulsante Aggiungi ione frammento e verrà visualizzato un campo a discesa per ogni ione frammento da inserire. Immettere i rapporti massa per carica degli ioni frammento e la loro massa associata mediante tolleranza di carica. Quindi fare clic sul pulsante Salva e chiudi.

Nella casella sul lato destro di Quanti ioni frammento devono essere abbinati, scorrere per selezionare il numero minimo di ioni frammento che devono essere abbinati per l'identificazione e selezionare i residui di cisteina nel loro stato ossidato. Se le proteine non vengono identificate dopo la ricerca, ripetere la ricerca con ciste nel loro stato ridotto. Sotto l'impostazione del file, fare clic sull'icona Seleziona file FASTA per sfogliare e selezionare il file FASTA contenente le sequenze proteiche in silico del ceppo batterico precedentemente costruito.

Quindi selezionare una cartella di output e creare un nome di file di output. Fare clic sull'icona Esegui ricerca su voci di file. Apparirà una finestra popup intitolata Conferma parametri di ricerca che visualizza i parametri di ricerca prima dell'avvio della ricerca.

E se i parametri di ricerca sono corretti, fai clic su Inizia ricerca. Se i parametri non sono corretti, fare clic su Annulla e immettere di riconserci i parametri corretti. Una volta avviata la ricerca, la finestra dei parametri si chiuderà e apparirà una nuova finestra pop-up con una barra di avanzamento, che mostra l'avanzamento della ricerca e un conteggio in esecuzione del numero di identificazioni trovate.

Al termine della ricerca, la barra di avanzamento verrà chiusa automaticamente e un riepilogo della ricerca verrà visualizzato nel campo di registro dell'interfaccia utente grafica insieme a una nuova finestra pop-up che mostra le identificazioni proteiche trovate. Nel presente studio, colture batteriche sono state coltivate in LB con due diverse concentrazioni di mitomicina-C. Lo spettro di massa della coltura batterica cresciuto con una concentrazione di mitomicina-C.

Sono state identificate la proteina C dello shock freddo, la proteina E dello shock freddo e una proteina trasmessa dal plasmide di funzione sconosciuta. Lo ione proteina sconosciuto a 9780 è stato analizzato da MS / MS, e lo ione precursore è stato isolato con una finestra di selezione dello ione temporale di circa 100 dalton. Lo ione frammento alla massa per caricare 9675,9 è spillover dalla dissociazione dello ione proteina metastabile a 9655.

La sequenza della proteina immunitaria per la colicina E3 contiene residui di base possibili siti di ionizzazione. Gli ioni frammento rilevati dalla scissione della spina dorsale polipeptidica, quando la forma ridotta di cisteina è stata utilizzata durante la ricerca. La metionina N-terminale viene rimossa come modifica post traduzione.

Quando la coltura batterica è stata coltivata ad un'alta concentrazione di mitomicina-C, è stata identificata la proteina immunitaria della batteriocina. Il picco sconosciuto a 9651 è stato analizzato da MS/MS e lo ione precursore è stato isolato con una finestra TIS più stretta e asimmetrica di meno 75 più 60 dalton. La sequenza della proteina immunitaria della batteriocina contiene residui di base possibili siti di ionizzazione.

Gli ioni frammento rilevati dalla scissione della spina dorsale polipeptidica, quando la forma ridotta di cisteina è stata utilizzata durante la ricerca. con le diverse concentrazioni di antibiotici, l'abbondanza relativa di proteine può variare. E questi sono stati analizzati usando la spettrometria di massa.

Quando si raccolgono le cellule batteriche, osservare la morfologia della colonia e la crescita batterica rispetto agli antibiotici e alla concentrazione. Un ciclo di cellule di un microlitro è necessario per rilevare le proteine.