Chirurgia ed elaborazione dei campioni per l'imaging correlativo della valvola polmonare murina
5 agosto 2021
Qui, descriviamo un flusso di lavoro correlativo per l'escissione, la pressurizzazione, la fissazione e l'imaging della valvola polmonare murina per determinare la conformazione grossolana e le strutture locali della matrice extracellulare.
Questo protocollo è significativo perché è progettato per rispondere a domande sulla struttura correlata alla funzione della valvola polmonare murina, che è generalmente complicata a causa della sua eterogeneità intrinseca. La fissazione controllata e l'imaging correlativo sono stati utilizzati per catturare la struttura su più scale di lunghezza. Le immagini locali ad alta risoluzione possono quindi essere mappate nella posizione anatomica precisa sulla valvola polmonare.
A dimostrare la procedura sarà il Dr.Tai Yi, direttore della microchirurgia presso il Centro di Medicina Rigenerativa del Nationwide Children's Hospital. Inizia con l'autoclave degli strumenti necessari per la dissezione del mouse, tra cui forbici fini, microforze, morsetti microvascolari, pinze per l'applicazione di morsetti, portaasele, forbici a molla e riavvolgitori. Dopo l'eutanasia di un topo adulto C57BL/6, metterlo in una posizione reclinata dorsale su un vassoio, fissare gli arti con del nastro adesivo ed eseguire la toracotomia.
Esporre il cuore rimuovendo il tessuto adiposo e la fascia in eccesso, quindi rimuovere l'atrio destro e perfondere il ventricolo sinistro con soluzione salina a temperatura ambiente. Rimuovere l'intero cuore tagliando la vena cava superiore, la vena cava inferiore, l'arteria polmonare e l'aorta e tagliare circa due millimetri sopra la giunzione ventricoloatriale, che fungerà da condotto per la pressurizzazione. Rimuovere i ventricoli sinistro e destro per esporre le camere alla pressione atmosferica, assicurando che la struttura del tronco polmonare non sia influenzata rimuovendo i ventricoli.
Tubo di pressurizzazione dell'anastomosi con l'arteria polmonare, lasciando circa un millimetro di distanza tra la giunzione sinotubulare e l'estremità del tubo per accogliere grandi movimenti delle foglioline e del tronco polmonare. Elevare il serbatoio a una pressione fisiologica analoga e riempirlo con la soluzione salina. Testare il sistema di flusso per assicurarsi che non vi siano blocchi o bolle d'aria.
Collegare un rubinetto alla valvola polmonare anastomosizzata e garantire un flusso adeguato attraverso il tubo commutando il tratto di deflusso. Una volta che il flusso è sufficiente, spostare il deflusso verso la valvola polmonare anastomosizzata e garantire la pressurizzazione del tronco polmonare identificato dalla distensione del tronco. Dopo aver confermato la pressurizzazione del tronco polmonare, incorporare gradualmente la soluzione fissativa primaria fino a quando il 25% della capacità del serbatoio della soluzione salina viene spurgato.
Posizionare una garza imbevuta di fissativo sul campione di tessuto per evitare l'essiccazione. Perfondere il fissativo per tre ore, riempiendo il serbatoio per mantenere una pressione costante. Dopo la perfusione, conservare la valvola cardiaca nella soluzione fissativa a quattro gradi Celsius fino all'uso per un massimo di una settimana.
Per la colorazione, lavare il campione di valvola cardiaca fissa tre volte con tampone di cacodilato molare freddo da 0,15 molari per cinque minuti e immergere completamente la valvola cardiaca in una soluzione di 1,5 ferrocianuro di potassio, 0,15 cacodilato molare, due cloruro di calcio millimolare e tetroxuro di osmio al 2% su ghiaccio per un'ora. Lavare i campioni con acqua doppia distillata a temperatura ambiente mettendoli in un tubo per cinque minuti con leggera agitazione. Dopo altri tre lavaggi, posizionare il campione in soluzione filtrata di tiocarboidrazide a temperatura ambiente.
Dopo 20 minuti, lavare il campione tre volte con acqua come dimostrato in precedenza. Quindi, posizionare il campione in teossido di osmio al 2% a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, lavarlo con acqua tre volte per cinque minuti ciascuno e incubare il campione in acetato di uranile all'1% durante la notte a quattro gradi Celsius.
Nel frattempo, preparare una soluzione di nitrato di piombo. Il giorno seguente, eseguire la fase di lavaggio tre volte come dimostrato in precedenza, quindi incubare il tessuto della valvola cardiaca in soluzione di aspartato di piombo a 60 gradi Celsius per 30 minuti. Lavare i campioni altre tre volte, quindi eseguire un trattamento di disidratazione seriale sui tessuti della valvola cardiaca con etanolo al 20, 50, 70 e 90% appena preparato su ghiaccio per cinque minuti ciascuno, seguito da due trattamenti successivi con etanolo al 100%.
Dopo la disidratazione, spostare i tessuti in acetone ghiacciato, quindi metterlo in acetone fresco a temperatura ambiente per 10 minuti. Per l'incorporamento, realizzare la miscela di resina secondo le specifiche del produttore. Posizionare i tessuti nei successivi trattamenti da 25 a 75, da 50 a 50 e da 75 a 25 resina a miscela di acetone per due ore ciascuno.
Infine, posizionare i tessuti in resina al 100% durante la notte. Il giorno seguente, mettere i tessuti in resina fresca al 100%. Dopo due ore, trasferire i tessuti in una capsula incorporante, aggiungere resina fresca al 100% e metterla in un forno a 60 gradi Celsius per 48 ore per polimerizzare.
L'arteria polmonare anastomosa asportata prima e dopo l'applicazione della pressione idrostatica è mostrata qui. Il tronco polmonare si distende radialmente indicando che i lembi della valvola polmonare sono in una configurazione chiusa. La tomografia microinciuta ha confermato la conferma della valvola polmonare.
I foglietti sono stati chiusi e l'anulus era circolare, mentre sono stati osservati vari gradi di pressurizzazione inadeguata della valvola polmonare mediante fissazione o collasso arterioso. Il volume micro CT che rende le sezioni trasversali virtuali è stato correlato con immagini ottiche per confermare la direzione e la posizione di slicing. Le immagini SBF SEM ad alta risoluzione sono state scattate in una regione locale all'interno di un volantino quando il blocco del campione si trovava nella posizione e nell'orientamento desiderati.
Le immagini correlate tra il volume micro CT che esegue il rendering di immagini virtuali slice, a bassa risoluzione e SBF SEM ad alta risoluzione sono mostrate qui. Nella rappresentazione 3D di una regione segmentata della valvola polmonare, possono essere identificati componenti extracellulari come cellule endoteliali, cellule interstiziali valvolari e fibre extracellulari. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che l'esecuzione della pressurizzazione è fondamentale e garantirà che la resa sia la più alta possibile.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo completo per la caratterizzazione strutturale della valvola polmonare murina su diverse scale di lunghezza. La metodologia integra una fissazione idrostatica controllata, una colorazione en bloc e un'analisi correlative mediante microtomografia computerizzata (μCT) e microscopia elettronica a scansione con sezione successiva del blocco (SBF-SEM). Questo approccio consente una mappatura precisa dei dati ultrastrutturali ad alta risoluzione su specifiche localizzazioni anatomiche, facilitando un'analisi dettagliata dell'organizzazione della valvola cardiaca.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cardiovascolare
- Microscopia e imaging
- Istologia
Sfondo
- I meccanismi delle malattie delle valvole cardiache (HVD) non sono ancora completamente compresi a causa della complessità strutturale e dell'eterogeneità.
- I modelli murini sono preziosi per la ricerca sulle HVD, ma richiedono tecniche avanzate per un'analisi strutturale accurata.
- La caratterizzazione della struttura valvolare su diverse scale di lunghezza è essenziale per comprendere la funzione e la patologia.
- L'imaging correlative colma il divario tra dati anatomici e ultrastrutturali.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per la dissezione, fissazione, colorazione e acquisizione di immagini delle valvole polmonari murine.
- Permettere una quantificazione strutturale accurata su più scale di lunghezza.
- Correlare i dati di micro-TC e SBF-SEM per un'analisi completa delle valvole.
Metodi Utilizzati
- Dissezione e preparazione di cuori di topi adulti C57BL/6.
- Pressurizzazione idrostatica controllata e fissazione chimica per preservare la conformazione delle valvole.
- Colorazione en bloc con tetrossido di osmio, acetato di uranile e aspartato di piombo per il contrasto in microscopia elettronica.
- Disidratazione seriale, inclusione in resina e polimerizzazione dei campioni di tessuto.
- Microtomografia computerizzata (μCT) come riferimento anatomico tridimensionale e conferma della geometria valvolare.
- Microscopia elettronica a scansione con sezione seriale del blocco (SBF-SEM) per l’imaging ad alta risoluzione della matrice extracellulare e dei componenti cellulari.
- Correlazione tra immagini μCT e SBF-SEM per mappare le caratteristiche ultrastrutturali in relazione alle localizzazioni anatomiche.
Risultati principali
- La fissazione idrostatica ha mantenuto la valvola polmonare in una configurazione chiusa fisiologicamente rilevante.
- La TC a micro-raggi X ha confermato la geometria della valvola e ha fornito un riferimento per l'elaborazione successiva.
- La microscopia elettronica a scansione con sezione a fascio di ioni (SBF-SEM) ha permesso la ricostruzione tridimensionale dell'organizzazione locale della matrice extracellulare, identificando cellule endoteliali, cellule interstiziali valvolari e fibre extracellulari.
- L'imaging correlative ha consentito una localizzazione precisa dei dati ultrastrutturali all'interno del contesto anatomico della valvola.
Conclusioni
- Il protocollo consente un'analisi strutturale dettagliata su più scale delle valvole cardiache di topo.
- L'imaging μCT e SBF-SEM correlative supera le sfide legate all'eterogeneità spaziale.
- Questa metodologia è adattabile per lo studio dell'organizzazione gerarchica in altri sistemi biologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La caratterizzazione strutturale multiscala della valvola polmonare murina consente una mappatura precisa delle caratteristiche anatomiche e ultrastrutturali, affrontando una sfida fondamentale nella validazione degli obiettivi cardiovascolari. I flussi di lavoro di imaging correlativo che integrano la tomografia computerizzata a micro-risoluzione (μCT) e la microscopia elettronica a scansione con sezione seriale del blocco (SBF-SEM) forniscono un'elevata affidabilità predittiva per le relazioni struttura-funzione nei modelli preclinici. Questa capacità supporta l'avanzamento mirato ai rischi dei programmi di scoperta cardiovascolare e orienta le strategie traslazionali dei biomarcatori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette un'analisi rigorosa delle ipotesi struttura-funzione delle valvole cardiache in modelli murini rilevanti per la patologia.
- Supporta la riduzione del rischio biologico risolvendo l'eterogeneità spaziale su molteplici scale di lunghezza.
- Facilita la validazione funzionale delle target mediante localizzazione anatomica precisa di caratteristiche ultrastrutturali.
- Migliora la fiducia predittiva per la selezione successiva del portafoglio in ricerca cardiovascolare.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce sistemi di riferimento validati per saggi quantitativi basati sull'imaging.
- Standardizza la preparazione dei campioni e i protocolli di imaging per garantire la riproducibilità tra studi.
- Permette una mappatura ad alta risoluzione della matrice extracellulare e dei componenti cellulari ai fini della predisposizione allo screening.
- Supporta flussi di lavoro di imaging scalabili per una valutazione affidabile di composti in modelli preclinici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la caratterizzazione strutturale a endpoint rilevanti per la malattia, garantendo continuità traslazionale.
- Fornisce un quadro per correlare biomarcatori ottenuti mediante imaging con esiti funzionali in studi preclinici.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica nella selezione e validazione dei modelli.
- Consente decisioni basate sulla valutazione del rischio per lo sviluppo di candidati mirati alla patologia delle valvole cardiache.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di imaging correlativo collega la fase iniziale della scoperta e la validazione preclinica, consentendo un'analisi quantitativa e multiscala della struttura delle valvole cardiache in modelli murini.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante una mappatura anatomica e ultrastrutturale precisa.
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre dati di riferimento tridimensionali e letture ad alta risoluzione per analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento degli endpoint di imaging preclinico con le strategie di biomarcatori clinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro di imaging e analisi riutilizzabile, adattabile ad altri sistemi biologici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi cardiovascolari.
- Valore operativo: Standardizza l'acquisizione di immagini e l'elaborazione dei campioni per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione/cessazione e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la promozione di programmi di scoperta cardiovascolare con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microchirurgia murina, fissazione dei tessuti e tecniche di imaging avanzate.
- Richiede accesso a strumentazione per tomografia computerizzata a micro-raggi X (μCT) e microscopia elettronica a scansione con sezione automatica (SBF-SEM) e a infrastrutture analitiche adeguate.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro delle procedure di preparazione del campione e dei protocolli di imaging.
- Adattabile ad altri sistemi organici con opportune modifiche ai protocolli.
- Dipendenza critica da una pressurizzazione e fissazione precise per garantire la qualità dei dati.
