Name: Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Scopri un metodo economico per identificare mutazioni durante la riparazione di rotture a doppio filamento indotte da CRISPR/Cas9 nel locus CD4. Questo protocollo utilizza linee di cheratinociti umani ed è adattabile a qualsiasi cellula transfezionabile.

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La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW e RP); National Cancer Institute del National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center presso la Kansas State University; e il Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Apprezziamo KSU-CVM Confocal Core e Joel Sanneman per la nostra microscopia a immunofluorescenza. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali di queste agenzie di finanziamento.

1. Placcatura cellulare
<ol><li>Coltiva cellule HFK LXSN e HFK 8E6 in piastre da 10 cm in terreni di coltura di cheratinociti (10 ml / piastra) con integratore di crescita dei cheratinociti umani (HKGS) e 1% di penicillina / streptomicina. Far crescere le cellule a circa l'80% di confluenza a 37 °C in un incubatore a camicia con il 5% di CO2.</li>
	<li>Sostituire i terreni di coltura con 3 ml di tripsina-EDTA (0,05%, acido tetraacetico etilendiammina). Incubare a 37 °C per 3 min. Neutralizzare la tripsina con uguale volume di siero bovino fetale (FBS) integrato nei mezzi e trasferire le cellule in un tubo centrifugo da 15 ml. Centrifuga a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Risospese le cellule con 10 mL di terreno di coltura dei cheratinociti con HKGS. Determinare la concentrazione di cellule con un emocitometro.</li>
	<li>Piastra 4 x 105 cellule/piastre da 6 cm (seminare due piastre per HFK LXSN e due piastre per HFK 8E6) in 4mL di terreno di coltura di cheratinociti con HKGS e 1% di penicillina e streptomicina. Crescere a 37 °C in un incubatore a camicia con il 5% di CO2. NOTA: L'analisi delle cellule HFK è stata scelta per questo protocollo per due motivi. Innanzitutto, HFK è una linea cellulare difficile da trasfettare. Pertanto, dimostrando che il protocollo funziona in questa linea cellulare, viene fornita la prova che probabilmente funzionerà in cellule più comunemente usate e più facilmente trasfettate. In secondo luogo, i dati pubblicati in precedenza dimostrano che una proteina virale (8E6) ostacola la riparazione delle rotture a doppio filamento nel DNA 20,21,22. Pertanto, il confronto tra HFK LXSN e HFK 8E6 ci consente di dimostrare la capacità del test di rilevare aumenti delle mutazioni associate a una riduzione della capacità di riparazione cellulare.</li>
</ol>2. Trasfezione
<ol><li>Il giorno della trasfezione (24 ore dopo la placcatura), sostituire il fluido con 3 ml di supporti integrati privi di antibiotici. Incubare per 2 ore a 37 °C in un'incubatrice a camicia.</li>
	<li>Trasfettare le cellule con reagenti di trasfezione a base lipidica appropriati secondo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Reagenti di trasfezione caldi a temperatura ambiente e pipettare delicatamente prima dell'uso.</li>
		<li>Per ogni linea cellulare (HFK LXSN e HFK 8E6), posizionare la quantità appropriata di tampone di trasfezione (come indicato dal produttore) in un tubo centrifugo sterile da 1,5 ml (tubo 1). Includere un altro tubo con la stessa quantità di tampone di trasfezione (trasfezione simulata o Tubo 2).</li>
		<li>Aggiungere 2 μg di DNA plasmidico che esprime CAS9/sgRNA mirato al CD4 umano (px330-CD4, 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT) al Tubo 1 dal passo 2.2.2. Pipettare delicatamente per mescolare completamente. Aggiungere lo stesso volume di acqua sterile al tubo 2.</li>
		<li>Includere una piastra di controllo con reagenti di trasfezione da soli (senza plasmide) per ogni linea cellulare. NOTA: La seconda piastra funge da controllo negativo nell'esperimento, consentendo all'utente di confermare che la trasfezione con CAS9/sgRNA non è responsabile di alcuna mutazione.</li>
		<li>Aggiungere la quantità appropriata del reagente di trasfezione (come indicato dal produttore) al tubo con miscela di DNA (tubo 1) dal punto 2.2.3 e la trasfezione simulata (tubo 2) dal punto 2.2.2. Pipettare delicatamente per mescolare completamente. Incubare a temperatura ambiente per 15-30 minuti per consentire il tempo sufficiente per la formazione di complessi.</li>
		<li>Aggiungere la miscela di trasfezione a goccia al piatto. Scuotere delicatamente la coltura per 1 minuto per distribuire uniformemente la miscela di trasfezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare per 48 ore dopo la trasfezione per consentire l'espressione di CAS9.</li>
	<li>Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione.<ol>
<li>Sostituire i terreni di coltura con 1 mL di tripsina-EDTA (0,05%, acido tetraacetico etilendiammina). Incubare a 37 °C per 3 min. Neutralizzare la tripsina con lo stesso volume di media integrati FBS.</li>
		<li>Per ogni piastra di cellule, trasferire la sospensione cellulare in due tubi microcentrifuga con aliquote uguali. Centrifuga a 300 x g per 5 min.</li>
		<li>Risospendare il pellet cellulare da un tubo nella fase 2.4.2 in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per il sequenziamento. Sospendere l'altro tubo dal punto 2.4.2 con PBS ghiacciato per immunoblot.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogli i lisati cellulari interi per immunoblot.<ol>
<li>Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 min. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere nel tubo un tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione da 100 μL (tampone di lisi RIPA) miscelato con inibitore della proteasi all'1 % e inibitore della fosfatasi all'1 %, mescolare accuratamente con una pipetta e incubare per 10 minuti sul ghiaccio. NOTA: il tampone di lisi RIPA contiene 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA; 0,5 mM EGTA; 1% Triton X-100; 0,1% di sodio desossicolato; 0,1% SDS; 140 mM NaCl e acqua deionizzata.</li>
		<li>Centrifuga lisati a 13.000 x g per 10 min. Raccogliere supernatanti per immunoblot.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Misurazione dell'espressione di CAS9 tramite immunoblot
<ol><li>Determinare la concentrazione proteica con un test dell'acido bicinconinico (BCA) secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Eseguire 20 μg di proteine di ciascun campione nei pozzetti di un gel tris-acetato al 3%-8% per 150 minuti e trasferire semidry (10 V per 30 minuti e poi 25 V per 12 minuti) alla membrana di polivinilidene difluoruro.</li>
	<li>Dopo aver bloccato la membrana nel 5% di latte secco non grasso in PBS con interpolazione allo 0,1% (PBST) per 1 ora a temperatura ambiente, aggiungere anticorpi anti-CAS9 (1:1000) e anti-GAPDH (1:1000). Incubare a 4 °C durante la notte.</li>
	<li>Dopo aver lavato la membrana con PBST, incubare la membrana con anticorpo secondario in latte secco non grasso al 5% in PBST per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Immagine della macchia e determina il livello CAS9 mediante densitometria23. Vedere la Figura 1 per una macchia rappresentativa. NOTA: Il rilevamento della formazione di focolai di H2AX fosforilato (S139) mediante microscopia a immunofluorescenza può essere utilizzato per convalidare l'attività di CAS914. Ci si aspetta un basso numero di focolai distinti (tipicamente 1-4 focolai) a seconda della posizione del ciclo cellulare, se le mutazioni nel sito bersaglio CAS9 impediscono ulteriori tagli e quante copie del sito di taglio CAS9 esistono nel genoma di interesse. Un'immagine rappresentativa è mostrata nella Figura 2.</li>
</ol>4. Estrazione dell'acido nucleico e generazione di amplicon
<ol><li>Estrarre il DNA dai campioni cellulari dal passaggio 2.4.3 utilizzando un kit di estrazione del DNA ad alto peso molecolare, come specificato dal produttore.</li>
	<li>Primer risospesi con solvente indicato secondo la scheda tecnica. Diluire con lo stesso reagente a 20 μM e raggruppare i primer da 20 μM nelle piscine indicate. NOTA: il pool di primer è elencato nella Tabella supplementare 1.</li>
	<li>Creare una miscela PCR Master utilizzando una lunga amplificazione Taq polimerasi per ogni pool di primer da 20 μM come specificato nella Tabella 1.<ol>
<li>Aggiungere 21 μL dei mastermix ai tubi PCR separati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 4 μL del campione target (100 ng/μL) dal punto 4.1 ai tubi di dosaggio PCR contenenti provette mastermix e cap. Garantire reazioni separate per ogni pool di primer.<ol>
<li>Vortice per miscelare tubi di analisi PCR e centrifuga (rotazione rapida) per rimuovere le goccioline dai coperchi dei tubi.</li>
		<li>Posizionare i tubi PCR su una macchina termociclatrice convenzionale.</li>
		<li>Programmare la macchina PCR come specificato nella Tabella 2.</li>
		<li>Eseguire il programma su un termociclatore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Pulizia PCR
<ol><li>Rimuovere i primer dalle reazioni PCR utilizzando un sistema di pulizia PCR basato su perline.<ol>
<li>Rimuovere le perline di pulizia dal frigorifero 30 minuti prima dell'uso.</li>
		<li>Le perle Vortex sono ben prima dell'uso e assicurano che tutte le perline siano risospese.</li>
		<li>Aggiungere 30 μL (1,2x) di perline risospese a ciascun pozzetto di una piastra profonda da 96 pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere 25 μL di reazione PCR ai pozzetti contenenti perline.</li>
		<li>Posizionare la piastra su uno shaker a piastre a 2000 giri / min per 2 minuti.</li>
		<li>Lasciare che la piastra rimanga a temperatura ambiente per 5 minuti dopo l'agitazione.</li>
		<li>Posizionare la piastra del pozzo profondo su un magnete a piastra a 96 pozzetti e incubare per 2 minuti.</li>
		<li>Rimuovere e scartare il surnatante senza le perle disturbanti.</li>
		<li>Mentre la piastra rimane sul magnete, aggiungere 180 μL di etanolo all'80% e incubare per 30 s. Rimuovere ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 5.1.9.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta da 10 μL, rimuovere ed eliminare il liquido rimanente dai pozzetti.</li>
		<li>Lasciare asciugare le perline a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 20 μL di acqua priva di nucleasi ai pozzetti contenenti perline e rimuovere la piastra dal magnete.</li>
		<li>Agitare la piastra a 2000 giri /min per 2 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Posizionare la piastra su un supporto magnetico e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante in una seconda piastra PCR etichettata. Questo contiene il DNA ripulito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurare la concentrazione di ogni reazione con un fluorometro.<ol>
<li>Assicurarsi che i reagenti del fluorometro dsDNA siano a temperatura ambiente.</li>
		<li>Impostare tubi di analisi fluorometrici più due tubi aggiuntivi per gli standard.</li>
		<li>Aggiungere 199 μL di 1x soluzione di lavoro dsDNA a tutti i tubi tranne due. Aggiungere 190 μL della soluzione di lavoro agli ultimi due tubi.</li>
		<li>Aggiungere 10 μL dei due standard (inclusi nella Tabella dei materiali) per separare i tubi di analisi.</li>
		<li>Aggiungere 1 μL di ogni reazione PCR ai tubi mastermix del fluorometro.</li>
		<li>Tubi a vortice da miscelare e incubare a temperatura ambiente per 2 min.</li>
		<li>Nella schermata iniziale del fluorometro, selezionare il pulsante con il kitin di analisi (1x dsDNA), quindi selezionare Leggi standard ed esegui campioni.</li>
		<li>Inserire 1 tubo standard, selezionare il pulsante Leggi e quindi ripetere per lo standard 2.</li>
		<li>Dopo il passaggio 5.2.6, ripetere per un campione, selezionare un volume di campione di 1 μL e verrà fornita la concentrazione risultante.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 5.2.7 per i campioni rimanenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolare la molarità proiettata di tutte le reazioni e raggruppare concentrazioni uguali di reazioni da ogni singolo campione separatamente (un pool finale per campione) utilizzando l'equazione seguente. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62583/62583eq01.jpg" style="margin: auto;"><ol>
<li>Ripetere i passaggi da 5.2.1 a 5.2.7 per ottenere la concentrazione finale del pool.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controllare il pool di amplicon su una macchina per elettroforesi capillare / gel di agarosio come specificato dal produttore.<ol>
<li>Preparare i tubi di elettroforesi capillare per il numero appropriato di campioni. Aggiungere 7 μL del tampone DNA come specificato dal produttore.</li>
		<li>Aggiungere 4 μL del pool di ampliconi al tubo contenente il tampone del DNA.</li>
		<li>Posizionare i tubi sulla macchina per elettroforesi ed eseguire la macchina come specificato dal produttore per il dsDNA.</li>
		<li>Visualizza le immagini del gel di elettroforesi assicurandoti che le bande si localizzino a ~ 5 kb (dimensione degli ampliconi).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolare la molarità proiettata di tutte le reazioni e raggruppare concentrazioni uguali di reazioni da ogni singolo campione separatamente (un pool finale per campione) utilizzando l'equazione seguente. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62583/62583eq01.jpg" style="margin: auto;">
</li>
</ol>6. Preparazione della biblioteca
<ol><li>Diluire i pool di campioni dai livelli 5.3.1 a 0,2 ng/μL per la preparazione della libreria.<ol>
<li>Utilizzando un kit di preparazione della libreria a basso input compatibile con sequenze brevi (300bp) preparare le librerie utilizzando combinazioni di indici univoche per ogni pool di campioni creato nel passaggio 5.3 seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: seguire le istruzioni del produttore per selezionare le sequenze di indice. Tutti gli indici suscettibili al kit di preparazione della libreria funzioneranno per i campioni.</li>
		<li>Dopo la preparazione della libreria, raggruppare tutti i campioni secondo le istruzioni del produttore. NOTA: prima di creare il pool di librerie, calcolare il numero di letture necessarie per una copertura 250x della sequenza di destinazione e assicurarsi che la cartuccia di sequenziamento selezionata possa fornire una copertura adeguata per ciascun campione incluso. Per un totale di 0,5 Mb, ciò equivarrà a 1 milione di letture.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il pool di librerie per la sequenziazione.<ol>
<li>Scongelare e preparare una cartuccia a 300 cicli e reagenti di sequenziamento.</li>
		<li>Denaturare e diluire il pool di sequenziamento creato nel punto 5.1.1 secondo le istruzioni del produttore del sequencer.</li>
		<li>Aggiungere il pool di librerie denaturate e diluite ai reagenti di sequenziamento ed eseguire la macchina di sequenziazione come specificato dal produttore. NOTA: vedere allegata la tabella 3 per le procedure di risoluzione dei problemi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Analisi dei dati
NOTA: tutti i passaggi dei dati vengono eseguiti nel software di analisi dei dati genomici. Le parentesi indicano l'input dell'utente. Maggiore del segno indica l'ordine dei clic del mouse per un dato passaggio (ad esempio, 1° clic del mouse&gt;2° clic del mouse)
<ol><li>Importare le letture facendo clic su Apri software &gt; Importa &gt; Illumina &gt; Seleziona file &gt; Avanti &gt; Seleziona posizione &gt; fine. Le letture appariranno ora nel software.</li>
	<li>Tagliare e filtrare le letture.<ol>
<li>Nel software di analisi dei dati di sequenza profonda, tagliare i parametri predefiniti delle letture non elaborate.</li>
		<li>Evidenziare le letture e fare clic su Casella degli strumenti &gt; Prepara i dati di sequenziazione &gt; Taglia le letture &gt; &gt; Successiva &gt; Avanti &gt; Avanti &gt; Salva &gt; &gt; successivo (Seleziona percorso da salvare) &gt; Fine
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mappare le letture tagliate al riferimento.<ol>
<li>La mappa tagliata legge la sequenza di riferimento utilizzata nel passaggio 4.1 utilizzando un punteggio di corrispondenza di 2, un costo di mancata corrispondenza di 3 e costi di inserimento/eliminazione di 2. Assicurarsi che la frazione di lunghezza sia superiore a 0,7 e che la frazione di somiglianza sia pari o superiore a 0,8.</li>
		<li>Evidenziare il file di lettura tagliato e fare clic su Casella degli strumenti &gt; Risequencing Analysis &gt; Map Reads to Reference &gt; Next &gt; (Select reference sequence) &gt; Next &gt; (Assicurarsi che i parametri siano indicati come sopra) &gt; Next &gt; Save &gt; (Select location to save) &gt; Finish.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrarre varianti e indels.<ol>
<li>Utilizzando un chiamante indel appropriato, estrarre indels utilizzando una soglia di valore p pari o inferiore a 0,005 e un numero massimo di mancate corrispondenze pari a 3.</li>
		<li>Evidenziare il file di lettura mappato e fare clic su Toolbox &gt; Analisi di risequenziamento &gt; Rilevamento varianti &gt; Varianti indels e strutturali &gt; &gt; successiva (Assicurarsi che la significatività richiesta sia immessa &gt; &gt; Successivo Salva &gt; (Selezionare la posizione da salvare) &gt; Fine.
</li>
		<li>Utilizzando un chiamante di variante appropriato, chiamare le varianti dal mapping di lettura utilizzando una significatività del 5%.</li>
		<li>Evidenziare il file di lettura mappato e fare clic su Toolbox &gt; Analisi di risequenziamento &gt; Rilevamento varianti &gt; Rilevamento varianti a bassa frequenza &gt; &gt; successiva (Assicurarsi che la significatività richiesta sia immessa &gt; &gt; &gt; Successiva &gt; Salva &gt; (Selezionare il percorso da salvare) &gt; Fine. NOTA: Assicurarsi di tenere conto della ploidia del genoma dell'ospite nei chiamanti indel e variant. Non estrarre mutanti al di sotto del 5%. Questa soglia tiene conto degli errori di PCR e sequenziamento associati al test. La normalizzazione (basata sul rilevamento immunoblot di CAS9) deve essere effettuata regolando la copertura del sequenziamento. Ad esempio, se il campione A ha il doppio dell'efficienza di trasfezione del campione B, il 50% delle letture del campione A deve essere utilizzato per l'analisi. Questo dovrebbe essere fatto con un campionamento casuale e non ridurre la copertura per qualsiasi campione inferiore a 100x.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Oltre alla profondità delle informazioni fornite, ci sono diversi vantaggi in questo metodo. In primo luogo, la riparazione DSB, in teoria, può essere valutata in qualsiasi loci genomico senza modificare il genoma della cellula di interesse. In secondo luogo, l'accesso all'analisi NGS della riparazione è aumentato dal costo ridotto e dallo sforzo computazionale offerto dalla creazione e dall'analisi di un singolo DSB mirato a un'area definita. Infine, con i genomi di altri organismi che diventano regolarmente disponibili...

Mantenere la stabilità genomica è fondamentale per tutti gli organismi viventi. Una replicazione accurata del DNA e una robusta risposta al danno del DNA (DDR) sono necessarie per propagare fedelmente il materiale genetico 1,2. I danni al DNA si verificano regolarmente nella maggior parte delle cellule 2,3. Quando questi danni vengono rilevati, la progressione del ciclo cellulare viene interrotta e vengono attivati i meccanismi di riparazione del DNA. Le rotture a doppio filamento nel DNA o nei DSB sono il tipo più tossico e mutageno di danno al DNA 3,4.
Mentre diverse vie di segnalazione DDR possono riparare queste lesioni, le vie di riparazione DSB più studiate sono la ricombinazione omologa (HR) e l'unione finale non omologa (NHEJ). HR è un percorso in gran parte privo di errori che ripara un DSB utilizzando un cromatide gemello come modello omologo. Questo tende ad accadere nella fase S e nella fase G2 di un ciclo cellulare 5,6,7. NHEJ è più soggetto a errori, ma può accadere durante il ciclo cellulare 8,9. Sono stati sviluppati vari saggi reporter per misurare l'efficienza di specifici meccanismi di riparazione 10,11,12. Questi saggi tendono a fare affidamento sulla citometria a flusso per una misurazione ad alto rendimento dell'attività del percorso di riparazione del DSB utilizzando GFP o mCherry come lettura11,13. Sebbene altamente efficienti, si basano sulla riparazione canonica che si verifica in un DSB introdotto artificialmente.
Ci sono una varietà di altri metodi utilizzati per studiare la riparazione DSB. Molti di questi si basano sulla microscopia a immunofluorescenza (IF) 1,14. La microscopia IF rileva focolai nucleari discreti rappresentativi di complessi di riparazione dopo che i DSB sono indotti dall'esposizione a sostanze chimiche genotossiche o radiazioni ionizzanti15,16. Tracciare la formazione e la risoluzione di questi fuochi fornisce un'indicazione di inizio e completamento della riparazione, rispettivamente14,17. Tuttavia, questi metodi di induzione del DSB (cioè sostanze chimiche o radiazioni ionizzanti) non causano DSB in posizioni definite nel genoma. È anche funzionalmente impossibile usarli per indurre costantemente solo un piccolo numero (ad esempio, 2-4) di DSB. Di conseguenza, i metodi più comunemente usati per indurre i DSB causano una moltitudine di lesioni distribuite casualmente in tutto il genoma18. Un piccolo numero di DSB può essere introdotto inserendo il sito di riconoscimento per un'endonucleasi rara ed esprimendo l'endonucleasi pertinente, come I-Sce119. Sfortunatamente, l'integrazione richiesta di un sito target impedisce l'esame del DSB in loci genomici endogeni.
Questo manoscritto descrive un metodo per rilevare le mutazioni associate alla riparazione di un DSB generato in un luogo definito dall'utente. Forniamo un esempio rappresentativo dell'approccio applicato per valutare la capacità di una proteina virale di aumentare il numero di mutazioni associate a un DSB. In particolare, questo manoscritto descrive l'uso di un singolo RNA guida (sgRNA) per dirigere un'endonucleasi CAS9 per indurre un DSB al frame di lettura aperto CD4 umano nei cheratinociti del prepuzio umano che esprimono il controllo vettoriale (HFK LXSN) e HFK che esprime la proteina E6 del virus del papilloma umano di tipo 8 (HFK 8E6). Il sequenziamento mirato di nuova generazione (NGS) della regione circostante la rottura consente di definire rigorosamente le mutazioni associate alla riparazione della lesione. Questi dati dimostrano che la proteina virale provoca un aumento di circa 20 volte delle mutazioni durante la riparazione del DSB. Fornisce inoltre una caratterizzazione imparziale delle conseguenze mutagene dei DSB in un singolo locus senza la necessità di sequenziamento dell'intero genoma. In linea di principio, il protocollo potrebbe essere facilmente adattato per confrontare il rischio relativo di mutazioni tra loci del genoma o linee cellulari.

<table><tbody><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td>Piastra per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Kit BCA</td><td>VWR</td><td>89167-794</td><td>Kit di analisi BCA</td></tr><tr><td>Centrifuga 5910 R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000772</td><td>Centrifuga da tavolo</td></tr><tr><td>CLC Banco di lavoro genomico</td><td>Qiagen</td><td>832001</td><td>Software di analisi dei dati a sequenza profonda/chiamante indel/chiamante di variante</td></tr><tr><td>Digital Microplate Genie pulse</td><td>Scientific industries</td><td>SI-400A</td><td>Agitatore per piastre</td></tr><tr><td>DYKDDDDK Tag Anticorpo monoclonale (FG4R)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA191878</td><td>Anticorpo anti-FLAG</td></tr><tr><td>Kit Epilife CF ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>MEPICF500</td><td>Terreni e integratori per colture cellulari</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>VWR</td><td>89510-194</td><td>Integratore per colture cellulari</td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di capra</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11012</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>HighPrep PCR Clean-up System</td><td>MagBio</td><td>AC-60005</td><td>Kit di pulizia PCR basato su perline</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2600</td><td>PCR mastermix/PCR assay</td></tr><tr><td>MagAttract HMW DNA kit</td><td>Qiagen</td><td>67563</td><td>Kit di estrazione del DNA ad alto peso molecolare</td></tr><tr><td>Magnetic Stand-96</td><td>Thermo Fisher Scientific AM10027</td><td></td> Termociclatore MiniAmp con <td>rack magnetico a 96 pozzetti</td></tr><tr><td></td><td>Applied Biosystems</td><td>A37834</td><td>Termociclatore</td></tr><tr><td>Miseq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Sequenziatore</td></tr><tr><td>Miseq v2 Kit di reagenti a 300 cicli</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>Reagenti a cartuccia/sequenziamento a 300 cicli</td></tr><tr><td>Nextera XT Kit di preparazione della libreria DNA</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Kit di preparazione della libreria</td></tr><tr><td>Nextera XT Kit v2 Set A</td><td>Illumina</td><td>20027215</td><td>Indici</td></tr><tr><td>Nunc Piastre DeepWell Stroage in polipropilene a 96 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>260251</td><td>piastre a 96 pozzetti</td></tr> Soluzione <tr><td>di penicillina-streptomicina (100X)</td><td>Calsson Labs</td><td>PSL02-6X100ML</td><td>Antibiotici per colture cellulari</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td>PBS</td></tr><tr><td>px330-CD4</td><td>Addgen</td><td>136938</td><td>plasmidi SgRNA/CAS9 che hanno come bersaglio 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT</td></tr><tr><td>QIAxcel Advanced System</td><td>Qiagen</td><td>9001941</td><td>macchina per elettrofesi capillare</td></tr><tr><td>QIAxcel Kit di screening del DNA Qiagen</td><td></td><td>929004</td><td>tampone DNA / provette per elettrofesi capillare</td></tr><tr><td>Qubit 1x ds HS Assay</td><td>Kit ThermoFisher Scientific</td><td>Q23851</td><td>Reagenti fluorimetrici/1x soluzione dsDNA</td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorimetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td>Fluorimetro</td></tr><tr><td>Qubit Provette per saggi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>Provette per saggi fluorimetrico</td></tr><tr><td>RIPA Tampone di lisi</td><td>VWR</td><td>VWRVN653-100ML</td><td>Tampone di lisi per l'estrazione di proteine</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso</td> <td>fenoloThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td>Trypsin</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific industries</td><td>SI-0236</td><td>Reagente di</td></tr><tr><td>trasfezione Vortex Xfect</td><td>Takara Bio</td><td>631318</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Software di analisi dei dati genomici</td><td>QIAGEN</td><td>CLC Workbench v21.0.</td><td>Software di analisi dati</td></tr></tbody></table>

utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da cas9 vicino al promotore cd4

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Le rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA sono il tipo più citotossico di danno al DNA. Poiché una miriade di insulti può causare queste lesioni (ad esempio, stress di replicazione, radiazioni ionizzanti, danni UV non riparati), i DSB si verificano nella maggior parte delle cellule ogni giorno. Oltre alla morte cellulare, i DSB non riparati riducono l'integrità del genoma e le mutazioni risultanti possono guidare la tumorigenesi. Questi rischi e la prevalenza di DSB motivano le indagini sui meccanismi con cui le cellule riparano queste lesioni. Il sequenziamento di nuova generazione può essere abbinato all'induzione di DSB mediante radiazioni ionizzanti per fornire un potente strumento per definire con precisione le mutazioni associate ai difetti di riparazione del DSB. Tuttavia, questo approccio richiede un sequenziamento dell'intero genoma computazionalmente impegnativo e proibitivo per rilevare la riparazione dei DSB che si verificano casualmente associati alle radiazioni ionizzanti. Rare endonucleasi da taglio, come I-Sce1, forniscono la capacità di generare un singolo DSB, ma i loro siti di riconoscimento devono essere inseriti nel genoma di interesse. Di conseguenza, il sito di riparazione è intrinsecamente artificiale. Recenti progressi consentono all'RNA guida (sgRNA) di dirigere un'endonucleasi Cas9 a qualsiasi locus del genoma di interesse. Questo potrebbe essere applicato allo studio della riparazione del DSB rendendo il sequenziamento di prossima generazione più conveniente consentendo di concentrarsi sul DNA che fiancheggia il DSB indotto da Cas9. L'obiettivo del manoscritto è dimostrare la fattibilità di questo approccio presentando un protocollo in grado di definire mutazioni che derivano dalla riparazione di un DSB a monte del gene CD4. Il protocollo può essere adattato per determinare i cambiamenti nel potenziale mutageno del DSB associati a fattori esogeni, come inibitori di riparazione, espressione proteica virale, mutazioni ed esposizioni ambientali con requisiti di calcolo relativamente limitati. Una volta che il genoma di un organismo è stato sequenziato, questo metodo può essere teoricamente impiegato in qualsiasi locus genomico e in qualsiasi modello di coltura cellulare di quell'organismo che può essere trasfettato. Adattamenti simili dell'approccio potrebbero consentire confronti di fedeltà di riparazione tra diversi loci nello stesso background genetico.

Per questo protocollo vengono presentati tre risultati rappresentativi. La Figura 1 è un immunoblot che conferma l'espressione di CAS9 nel controllo HFK (LXSN) e HFK che esprime beta-HPV 8E6 (8E6). 48 ore dopo la trasfezione, i lisati a cellule intere sono stati raccolti e successivamente sondati con un anticorpo anti-CAS9 (o GAPDH come controllo del carico). Il risultato mostra che HFK LXSN e HFK 8E6 esprimono una quantità simile di CAS9, indicando che l'eff...

Qui viene presentata l'endonucleasi sgRNA/CAS9 e il protocollo di sequenziamento di nuova generazione che può essere utilizzato per identificare le mutazioni associate alla riparazione della rottura del doppio filamento vicino al promotore CD4.

Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Questo protocollo aiuta a identificare le mutazioni che si verificano durante la riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da RNA a guida singola e CAS9. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un modo economico e robusto per rilevare mutazioni in uno specifico locus genomico. Usiamo i cheratinociti umani come esempio, ma questo protocollo può essere adattato a qualsiasi linea cellulare trasfezionabile.A dimostrare questo protocollo sarà Taylor Bugbee, un assistente universitario del nostro laboratorio. Per iniziare, coltiva le cellule HFK LXSN e HFK 8E6 in piastre da 10 centimetri a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica in un incubatore di giacca contenente terreni di coltura di cheratinociti con integratore di crescita dei cheratinociti umani e streptomicina all'1% di penicillina. Sostituire il terreno di coltura con tre millilitri di tripsina-EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti.Quindi, neutralizzare la tripsina con un volume uguale di supporti integrati da FBS. Ora, trasferire le celle in un tubo centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Sospendere nuovamente le cellule con 10 millilitri di terreni di coltura dei cheratinociti con supplemento di crescita dei cheratinociti umani e determinare la concentrazione di cellule con un emocitometro.Successivamente, seminare due piastre ciascuna per le cellule HFK LXSN e HFK 8E6 in quattro millilitri di terreni di coltura dei cheratinociti con integratore di crescita dei cheratinociti umani e 1% di penicillina streptomicina. Dopo la semina, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un incubatore di giacca. Il giorno della trasfezione, sostituire i media con tre millilitri di supporti integrati privi di antibiotici e incubare per due ore a 37 gradi Celsius in un'incubatrice di giacche.Per trasfettare le cellule, riscaldare i reagenti di trasfezione a temperatura ambiente e pipettarli delicatamente prima dell'uso. Posizionare una quantità appropriata di tampone di trasfezione in due tubi centrifughi sterili da 1,5 millilitri per ogni linea cellulare ed etichettarli come tubo uno e finta trasfezione, o tubo due. Quindi, aggiungere due microgrammi di DNA plasmidico che esprime, CAS9, CD4 umano a guida singola, mirato all'RNA al tubo uno e pipettare delicatamente per mescolare completamente.Aggiungere un volume uguale di acqua sterile al tubo due. Aggiungere una quantità appropriata del reagente di trasfezione al tubo uno con miscela di DNA e alla trasfezione simulata o al tubo due. Usando una pipetta, mescolarli delicatamente completamente e incubare a temperatura ambiente per 15-30 minuti per formare i complessi.Aggiungere la miscela di trasfezione a goccia sul piatto e agitare delicatamente la piastra di coltura per un minuto per distribuire uniformemente la miscela di trasfezione. Per raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione, sostituire i terreni di coltura con un millilitro di tripsina EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quindi, neutralizzare la tripsina con un volume uguale di supporti integrati da FBS.Per ogni piastra di cellule, trasferire la sospensione cellulare in due tubi microcentrifuga con aliquote uguali e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, sospendere nuovamente il pellet cellulare da un tubo in un millilitro di PBS per il sequenziamento e in un altro tubo, con PBS ghiacciato per immunoblot. Il test immunoblot è stato eseguito per confrontare l'espressione di CAS9 in cellule HFK non trasfettate e transettate.I risultati mostrano che le cellule HFK non trasfettate e transettate hanno espresso una quantità simile di CAS9, indicando che l'efficienza di trasfezione è simile tra due linee cellulari. Sono state ottenute immagini al microscopio a immunofluorescenza dell'istone fosforilato H2AX S139 in cellule trasfettate SgRNA/CAS9 e controllo non trasfettato. I risultati hanno indicato che due rotture a doppio filamento sono state indotte da CAS9 SgRNA.Le variazioni genomiche sono state raggruppate per tipi di eventi mutazionali in HFK LXSN e HFK 8E6, dove ogni gruppo di variazioni genomiche e il numero totale di variazioni sono stati confrontati tra HFK LXSN e HFK 8E6. I risultati hanno mostrato che 8E6 aumenta le variazioni genomiche entro 200 kilobase intorno alle rotture a doppio filamento indotte da CAS9, indicando che l'HPV 8E6 deregola la riparazione della rottura a doppio filamento e aumenta l'instabilità genomica. Lo scopo di immunoblot è misurare l'efficienza della trasfezione, che dovrebbe essere considerata durante l'analisi dei dati.Oltre all'efficienza della trasfezione, la microscopia a immunofluorescenza potrebbe essere utilizzata per confermare l'induzione della rottura a doppio filamento utilizzando il fosfo-H2AX come marcatore. Usiamo il beta HPV 8E6 come esempio. Questa tecnica può essere utilizzata per rilevare cambiamenti nella frequenza o nel tipo di mutazione causati da altri reagenti come gli inibitori di piccole molecole.

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l'arricchimento del gDNA per il sequenziamento NGS è uno strumento facile e potente per lo studio delle mutazioni costituzionali. In questo articolo, presentiamo la procedura per analizzare semplicemente la sequenza completa di 11 geni coinvolti nella riparazione del danno al DNA.

gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l'analisi della sequenza intera BRCA1, BRCA2, e 9 geni coinvolti nella riparazione del DNA Damage

La PCR bloccante di tipo selvatico seguita dal sequenziamento diretto offre un metodo di rilevamento altamente sensibile per le mutazioni somatiche a bassa frequenza in una varietà di tipi di campioni.

Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche

La tecnica qui descritta genotipizzazione, che accoppia fluorescente reazione a catena della polimerasi (PCR) per elettroforesi su gel capillare, permette high-throughput genotipizzazione di cloni knockout nucleasi-mediata. Elude limitazioni incontrate da altre tecniche di genotipizzazione ed è più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento.

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro di un gene basate su CRISPR/Cas9 modifica del sistema per la riparazione delle mutazioni puntiformi in cellule di mammifero. Qui, usiamo un approccio combinatorio di gene editing con una dettagliata strategia sperimentale proseguimento per misurare indel formazione nel sito di destinazione — in sostanza, l'analisi in loco mutagenesi.

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Genica mirata di editing con CRISPR/Cas9 ha notevolmente facilitato la comprensione delle funzioni biologiche dei geni. Qui, utilizziamo la metodologia CRISPR/Cas9 a modello calreticulina mutazioni in cellule ematopoietiche citochina-dipendente al fine di studiare la loro attività oncogena.

Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente

Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

Una libreria CRISPR/sgRNA è stata applicata a interrogare i geni di proteina-codificazione. Tuttavia, la fattibilità di una libreria di sgRNA per scoprire la funzione di un confine CTCF nella regolazione genica rimane inesplorata. Qui, descriviamo una raccolta di specifiche sgRNA loci HOX per delucidare la funzione dei confini CTCF in loci HOX .

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca Screening identificazione critico CTCF confini

L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire l'editing CRISPR/Cas9 senza soluzione di continuità del genoma di C. elegans utilizzando complessi di ribonucleoproteine assemblati e il marcatore co-CRISPR dpy-10 per lo screening. Questo protocollo può essere utilizzato per apportare una varietà di modificazioni genetiche in C. elegans tra cui inserzioni, delezioni, sostituzioni geniche e sostituzioni codone.

CRISPR/Cas9 Editing del gene C. elegans rbm-3.2 utilizzando il marcatore di screening dpy-10 Co-CRISPR e complessi di ribonucleoproteine assemblati.

Nuove strategie per modellare fedelmente le mutazioni somatiche nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) sono necessarie per studiare meglio la biologia delle cellule staminali ematopoietiche e le neoplasie ematologiche. Qui, viene descritto un protocollo per modellare mutazioni eterozigoti con guadagno di funzione nelle HSPC combinando l'uso di CRISPR / Cas9 e la doppia trasduzione del donatore rAAV.

Ingegnerizzazione di mutazioni oncogeniche eterozigoti con guadagno di funzione in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane

Presentiamo protocolli per la valutazione della competenza del percorso di riparazione a doppio filamento di rottura nelle cellule utilizzando una suite di substrati reporter extracromosomici basati sulla luminescenza.

Valutazione dell'attività di riparazione della rottura del doppio filamento del DNA utilizzando saggi reporter ad alto rendimento e quantitativi basati sulla luminescenza

Un ostacolo significativo a tecnologie come CRISPR sono gli eventi fuori bersaglio che possono interrompere i geni vitali. CIRCLE-seq ("Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing") è una tecnica progettata per identificare i siti di scissione non intenzionali. Questo metodo mappa l'attività dell'intero genoma di CRISPR-Cas9 con alta sensibilità e senza bias.

CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

Scopri un metodo economico per identificare mutazioni durante la riparazione di rotture a doppio filamento indotte da CRISPR/Cas9 nel locus CD4. Questo protocollo utilizza linee di cheratinociti umani ed è adattabile a qualsiasi cellula transfezionabile.

Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4 (Video) | JoVE Journal

Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4

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