Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4

Questo protocollo aiuta a identificare le mutazioni che si verificano durante la riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da RNA a guida singola e CAS9. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un modo economico e robusto per rilevare mutazioni in uno specifico locus genomico. Usiamo i cheratinociti umani come esempio, ma questo protocollo può essere adattato a qualsiasi linea cellulare trasfezionabile.

A dimostrare questo protocollo sarà Taylor Bugbee, un assistente universitario del nostro laboratorio. Per iniziare, coltiva le cellule HFK LXSN e HFK 8E6 in piastre da 10 centimetri a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica in un incubatore di giacca contenente terreni di coltura di cheratinociti con integratore di crescita dei cheratinociti umani e streptomicina all'1% di penicillina. Sostituire il terreno di coltura con tre millilitri di tripsina-EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti.

Quindi, neutralizzare la tripsina con un volume uguale di supporti integrati da FBS. Ora, trasferire le celle in un tubo centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Sospendere nuovamente le cellule con 10 millilitri di terreni di coltura dei cheratinociti con supplemento di crescita dei cheratinociti umani e determinare la concentrazione di cellule con un emocitometro.

Successivamente, seminare due piastre ciascuna per le cellule HFK LXSN e HFK 8E6 in quattro millilitri di terreni di coltura dei cheratinociti con integratore di crescita dei cheratinociti umani e 1% di penicillina streptomicina. Dopo la semina, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un incubatore di giacca. Il giorno della trasfezione, sostituire i media con tre millilitri di supporti integrati privi di antibiotici e incubare per due ore a 37 gradi Celsius in un'incubatrice di giacche.

Per trasfettare le cellule, riscaldare i reagenti di trasfezione a temperatura ambiente e pipettarli delicatamente prima dell'uso. Posizionare una quantità appropriata di tampone di trasfezione in due tubi centrifughi sterili da 1,5 millilitri per ogni linea cellulare ed etichettarli come tubo uno e finta trasfezione, o tubo due. Quindi, aggiungere due microgrammi di DNA plasmidico che esprime, CAS9, CD4 umano a guida singola, mirato all'RNA al tubo uno e pipettare delicatamente per mescolare completamente.

Aggiungere un volume uguale di acqua sterile al tubo due. Aggiungere una quantità appropriata del reagente di trasfezione al tubo uno con miscela di DNA e alla trasfezione simulata o al tubo due. Usando una pipetta, mescolarli delicatamente completamente e incubare a temperatura ambiente per 15-30 minuti per formare i complessi.

Aggiungere la miscela di trasfezione a goccia sul piatto e agitare delicatamente la piastra di coltura per un minuto per distribuire uniformemente la miscela di trasfezione. Per raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione, sostituire i terreni di coltura con un millilitro di tripsina EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quindi, neutralizzare la tripsina con un volume uguale di supporti integrati da FBS.

Per ogni piastra di cellule, trasferire la sospensione cellulare in due tubi microcentrifuga con aliquote uguali e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, sospendere nuovamente il pellet cellulare da un tubo in un millilitro di PBS per il sequenziamento e in un altro tubo, con PBS ghiacciato per immunoblot. Il test immunoblot è stato eseguito per confrontare l'espressione di CAS9 in cellule HFK non trasfettate e transettate.

I risultati mostrano che le cellule HFK non trasfettate e transettate hanno espresso una quantità simile di CAS9, indicando che l'efficienza di trasfezione è simile tra due linee cellulari. Sono state ottenute immagini al microscopio a immunofluorescenza dell'istone fosforilato H2AX S139 in cellule trasfettate SgRNA/CAS9 e controllo non trasfettato. I risultati hanno indicato che due rotture a doppio filamento sono state indotte da CAS9 SgRNA.

Le variazioni genomiche sono state raggruppate per tipi di eventi mutazionali in HFK LXSN e HFK 8E6, dove ogni gruppo di variazioni genomiche e il numero totale di variazioni sono stati confrontati tra HFK LXSN e HFK 8E6. I risultati hanno mostrato che 8E6 aumenta le variazioni genomiche entro 200 kilobase intorno alle rotture a doppio filamento indotte da CAS9, indicando che l'HPV 8E6 deregola la riparazione della rottura a doppio filamento e aumenta l'instabilità genomica. Lo scopo di immunoblot è misurare l'efficienza della trasfezione, che dovrebbe essere considerata durante l'analisi dei dati.

Oltre all'efficienza della trasfezione, la microscopia a immunofluorescenza potrebbe essere utilizzata per confermare l'induzione della rottura a doppio filamento utilizzando il fosfo-H2AX come marcatore. Usiamo il beta HPV 8E6 come esempio. Questa tecnica può essere utilizzata per rilevare cambiamenti nella frequenza o nel tipo di mutazione causati da altri reagenti come gli inibitori di piccole molecole.