Name: Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Scopri la sezione ottica per visualizzare l'organizzazione tridimensionale dei condrociti nel disco intervertebrale umano e bovino. Questo metodo rivela i cambiamenti morfologici durante lo sviluppo embrionale e la degenerazione.

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Ringraziamo i nostri co-autori delle pubblicazioni originali per il loro aiuto e supporto. Ringraziamo Charlotte Emma Bamberger per aver contribuito ad acquisire le immagini dell'apotoma.

Per l'analisi dello sviluppo e della maturazione embrionale sono stati utilizzati dischi bovini. Per valutare la degenerazione dell'IVD, sono stati analizzati campioni umani.
Il tessuto IVD umano è stato ottenuto da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per degenerazione del disco lombare, prolasso del disco o trauma spinale nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica, nell'Ospedale Universitario di Tubinga e nel BG Trauma Centre Tübingen. La piena approvazione del comitato etico è stata ottenuta prima dell'inizio dello studio (numero di progetto 244/2013BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazienti prima della partecipazione. I metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate.
Il tessuto bovino è stato ottenuto dall'Ufficio di Stato bavarese per la salute e la sicurezza alimentare/Oberschleißheim e da un impianto di rendering a Warthausen (Germania). L'approvazione delle autorità locali e veterinarie è stata ricevuta per i tessuti di animali morti.
1. Raccolta del campione
<ol><li>Tessuto IVD umano: posizionare immediatamente campioni ivD ottenuti per via intraoperatoria nel modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con il 2% (v/v) di penicillina-streptomicina e l'1,2% di (v/v) amfotericina B. Conservare a 4 °C fino a un'ulteriore lavorazione. Elaborare il tessuto entro 48 ore. In alternativa, conservare i tessuti a -20 °C per diverse settimane.</li>
	<li>Tessuto IVD bovino: assicurarsi di raccogliere il tessuto dagli animali entro 24 ore dalla morte. Resecare i dischi bovini con le vertebre circostanti dagli animali morti in blocco. Trasportare il tessuto congelato su ghiaccio secco e conservare a -20 °C fino a ulteriore lavorazione. NOTA: se sono previste solo analisi di fluorescenza e non sono previsti ulteriori metodi di quantificazione biochimica come ELISA o PCR, eseguire la fissazione del tessuto come spiegato di seguito. Ciò consente di mantenere il tessuto più a lungo in deposito prima che debba essere elaborato. Per prevenire il deterioramento della matrice tissutale, eseguire la fissazione entro 48 ore dalla raccolta, a meno che il tessuto non sia congelato direttamente.</li>
</ol>2. Preparazione del campione
<ol><li>Scongelare il tessuto congelato a temperatura ambiente. Elaborare il tessuto non appena non si sentono più cristalli di ghiaccio dopo una delicata compressione digitale del tessuto. NOTA: Eseguire la preparazione del tessuto in DMEM in una capsula di Petri.</li>
	<li>Identificare l'origine del tessuto IVD umano (anulus fibrosus, zona intermedia, nucleo polposo o piastra terminale cartilaginea) in base alle proprietà macroscopiche come la densità e l'orientamento del collagene.</li>
	<li>Prendi il segmento di movimento costituito dal disco IVD bovino con le sue due vertebre adiacenti e seziona il disco nel suo insieme dall'osso subcondrale usando una lama chirurgica (lama numero 15).<ol>
<li>Utilizzare due pinze anatomiche per capovolgere il disco per raggiungere le aree più centrate. Eseguire la dissezione. Assicurati di resecare il nucleo polposo per ultimo in quanto è molto più sottile dell'anulus, incline a strapparsi, e non si stacca facilmente in modo definito.</li>
		<li>Identificare le diverse aree della cartilagine.</li>
		<li>Ritagliare l'area di interesse dall'intero disco utilizzando una lama chirurgica (lama numero 20 o 22). In alternativa, utilizzare una lama criotomica. NOTA: Poiché i dischi bovini vengono inseriti in blocco come parte della colonna vertebrale, i dischi possono essere preparati in toto. Ciò rende molto più facile la corretta identificazione dei diversi tipi di cartilagine. Quando si seziona il disco nel modo sopra descritto, la piastra terminale cartilaginea rimane sulle vertebre. Se quest'area deve essere studiata, è meglio toglierla dall'osso sottostante con uno scalpello che lavora in una direzione tangenziale leggermente piegata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nel caso in cui gli embrioni abbiano una lunghezza della groppa della corona inferiore a 20 cm, assicurarsi di elaborare gli embrioni in toto per preservare l'architettura tissutale dell'IVD. Non eseguire alcuna dissezione delle vertebre in questi casi.</li>
	<li>Una volta che il disco è stato resecato in toto, identificare le diverse aree della cartilagine.<ol>
<li>Eseguire la decalcificazione in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (20% (p/v); pH = 7,4) a temperatura ambiente. Scegli il volume in base alla dimensione del campione: l'intero tessuto deve essere ben coperto con EDTA.</li>
		<li>Cambiare la soluzione di decalcificazione ogni giorno che può durare fino a 5 giorni a seconda delle dimensioni del tessuto.</li>
		<li>Verificare che la decalcificazione abbia successo con un ago calibro 20 che penetra nelle vertebre senza una notevole resistenza. NOTA: Il cambio giornaliero della soluzione di decalcificazione è importante per evitare che il legante chelato EDTA si saturi per mantenere l'effettività della reazione. Previene anche la colonizzazione batterica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Classificazione dell'età, dell'integrità e della degenerazione del campione
<ol><li>Classificare il tessuto del disco umano in una delle cinque seguenti categorie con l'aiuto di informazioni cliniche e di raggi X e risonanza magnetica18 (Figura 3). NOTA: Categoria I: Per servire come campione quasi sano utilizzare anulus senza alcun segno radiologico di degenerazione IVD derivata da trauma spinale acuto. Categoria II: Per illustrare una situazione di infiammazione acuta con degenerazione iniziale utilizzare tessuto della zona intermedia da pazienti con sintomi clinici con una durata inferiore a 4 settimane. Categoria III: Descrivere una situazione in cui la reazione infiammatoria aveva già avuto il tempo di influenzare il tessuto e le cellule prelevano tessuto da pazienti che sono stati operati per un prolasso nucleare ma con una durata dei sintomi superiore a 4 settimane. Categoria IV: Per la degenerazione del disco moderata selezionare l'anulus ottenuto dalla chirurgia con fusione intercorporea per la malattia degenerativa del disco con un punteggio pfirrmann di 3 o 4 nella risonanza magnetica19. Categoria V: Per l'anulus del processo di degenerazione allo stadio terminale ottenuto da un intervento chirurgico con fusione intercorporea per malattia degenerativa del disco con un punteggio di Pfirrmann di 5.</li>
	<li>Classificare il tessuto bovino in base allo stadio di sviluppo/età dell'animale in una delle otto categorie, come indicato nella tabella 1.<ol>
<li>Calcola l'età di gestazione sulla lunghezza della corona degli embrioni in base alla formula suggerita da Keller: Età di gestazione in mesi = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62594/62594eq1v3.jpg"> NOTA: Gli animali nelle prime 4 settimane di gestazione presentano una lunghezza corona-groppa di 0,8-2,2 cm20.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Fissazione dei tessuti
<ol><li>Fissare i campioni in 10 volte il volume del campione di soluzione di formaldeide al 4% (p/v) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) durante la notte a 4 °C. NOTA: La soluzione di formaldeide penetra nei tessuti ad una velocità di circa 1 mm/ora da ciascuna direzione. Per campioni molto piccoli o molto grandi potrebbe essere necessario un aggiustamento del tempo di esposizione.</li>
	<li>Conservare il tessuto in PBS a 4 °C fino a un'ulteriore lavorazione.</li>
</ol>5. Sezionamento istologico
<ol><li>Incorporare i campioni in un mezzo di incorporamento solubile in acqua sulla manopola del criotomo.<ol>
<li>Posizionare il tessuto sulla manopola in modo tale che venga generato un piano assiale o un piano che taglia le lamelle di collagene di tipo I perpendicolari (ad esempio, un piano di sezionamento sagittale mediano). NOTA: Il tessuto deve essere completamente coperto dal mezzo di incorporamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sezionare il tessuto incorporato ad uno spessore di 70 μm in campioni umani e 40 μm in campioni bovini utilizzando un criotomo standard. NOTA: La differenza di spessore della sezione è dovuta alla differenza di integrità del tessuto tra il disco bovino intatto e il tessuto umano altamente degenerato.</li>
	<li>Raccogli le sezioni su una diapositiva di vetro.<ol>
<li>Circondare le sezioni di tessuto con una penna idrofoba.</li>
		<li>Risciacquare le sezioni 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il mezzo incorporante solubile in acqua.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Colorazione a fluorescenza
<ol><li>Aggiungere 60 μL dell'1% (v/v) di DAPI (Exmax 358 nm, Emmax 461 nm) e l'1% (v/v) di colorazione Actin Tracking (Exmax 540 nm, Emmax 565 nm) in PBS e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Il protocollo di colorazione qui descritto è quello di visualizzare il nucleo utilizzando la colorazione nucleare DAPI (blu) e il citoplasma utilizzando Actin Tracking Stain (rosso). L'IVD ha una forte autofluorescenza dovuta alle fibre di collagene nel canale verde. La quantità di fluido aggiunto alle sezioni in questo protocollo è destinata a sezioni di dimensioni di circa 5 mm x 5 mm. Per le sezioni più grandi, questo importo deve essere aumentato di conseguenza. Eseguire tutti i lavori in ambienti senza esposizione diretta alla luce solare e con luci soffuse per evitare lo sbiancamento del colorante.</li>
	<li>Rimuovere il fluido colorante con una pipetta e lavare tre volte con 60 μL di PBS ogni volta.</li>
	<li>Aggiungere un mezzo di montaggio adatto e coprire le sezioni con uno slittamento di copertura. NOTA: assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate quando si aggiunge lo slittamento del coperchio. Questo è meglio farlo iniziando il contatto dello slip con la diapositiva su un cerchio e quindi lasciando che lo slip scenda lentamente.</li>
</ol>7. Imaging ed elaborazione microscopica
<ol><li>Posizionare un vetrino con una sezione macchiata sul portacampioni del microscopio. NOTA: A causa della fitta rete di collagene di tipo I dell'IVD, la luce diffusa rende il tessuto difficile da visualizzare utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale. Un modo per risolvere questo problema consiste nell'eseguire il sezionamento ottico utilizzando l'illuminazione strutturata. Ciò consente anche di eseguire il rendering di una proiezione tridimensionale dell'intero campione in entrambi i canali (blu e rosso). Questo viene fatto meglio utilizzando l'impostazione di illuminazione strutturata e la modalità Mosaico con un obiettivo di ingrandimento 10x per ottenere una panoramica del campione e ricostruzioni 3D di singoli modelli.</li>
	<li>Avviare il dispositivo di illuminazione strutturata.<ol>
<li>Eseguire l'imaging a campo visivo singolo con un microscopio a fluorescenza adatto, filtri a fluorescenza e un'illuminazione adeguata. NOTA: regolare il tempo di esposizione per tutti i filtri utilizzati per standardizzare l'acquisizione dell'immagine. Per ottenere una rappresentazione accurata del campione ad una risoluzione più alta, le sezioni con un ingrandimento più elevato (ad esempio, obiettivo 20x).</li>
		<li>Post-elaborare le immagini ottimizzando l'intensità e la luminosità utilizzando un software di ottimizzazione delle immagini compatibile con il microscopio a fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per visualizzare la sezione nel suo complesso utilizzare la tecnica di imaging a mosaico<ol>
<li>Apri le impostazioni di acquisizione (premi su 6D- Acquisizione)dal pannello della barra degli strumenti.</li>
		<li>Regolare le impostazioni del mosaico (in MosaiX Register) e definire il numero di colonne e righe di immagini del campo visivo che verranno successivamente unite in un'unica immagine panoramica.</li>
		<li>Premere Imposta e regolare la correzione dello stato attivo dei singoli riquadri. NOTA: è quasi impossibile per una grande sezione di tessuto avere l'intera superficie del tessuto in un unico piano di messa a fuoco. I riquadri immagine a diversi livelli focali possono essere acquisiti da "MosaiX Acquisition".</li>
		<li>Per avviare l'acquisizione dei riquadri immagine, premere Start.</li>
		<li>Cucire le tessere fotografate utilizzando la funzione di cucitura ( pulsanteStitching) con il 20% di sovrapposizione incorporata nel software.</li>
		<li>Post-elaborare le immagini ottimizzando l'intensità e la luminosità utilizzando un software di ottimizzazione delle immagini compatibile con il microscopio a fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per analizzare l'organizzazione spaziale dei condrociti, utilizzare la funzione 3D incorporata nel software.<ol>
<li>Regolare le impostazioni z-stack. Definire i parametri di scansione: definire le posizioni di avvio e arresto nell'asse z e la distanza della sezione attivando il pulsante Start/Stop. NOTA: il software calcola automaticamente il numero di sezioni.</li>
		<li>Per avviare l'acquisizione delle immagini z-stacks, premere Start.</li>
		<li>Post-elaborare le immagini ottimizzando l'intensità e la luminosità utilizzando un software di ottimizzazione delle immagini compatibile con il microscopio a fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esporta le immagini con un formato di file compatibile con il software di elaborazione delle immagini. NOTA: Esportare le ricostruzioni 3D come singole immagini e/o come modello 3D interattivo o in formato video.</li>
</ol>8. Identificazione del modello cellulare e valutazione della densità
<ol><li>Aprire le immagini del mosaico esportate dell'intera sezione del tessuto in un programma di elaborazione delle immagini appropriato.</li>
	<li>Definire le aree sottoposte alla valutazione della densità cellulare definendo le regioni di interesse di 500 μm x 500 μm nelle immagini. NOTA: tutti i riquadri che non hanno una qualità dell'immagine adeguata sono esclusi dall'analisi.</li>
	<li>Identificare i singoli modelli cellulari. NOTA: le celle singole sono definite come singole celle, completamente incapsulate all'interno della matrice adiacente. Le coppie sono definite come due celle adiacenti in prossimità (&lt;25 μm) per cui le celle sono interconnesse attraverso le loro matrici (vedi Figura 2). Le formazioni di stringhe sono almeno tre condrociti allineati in linea (dal centro dei nuclei &lt;25 μm). Queste celle sono racchiuse da una matrice intatta e le interconnessioni matriciali possono essere viste tra ogni cellula. I cluster rappresentano più celle che si trovano in prossimità diretta l'una dell'altra (&lt;25 μm) e sono incapsulate in una grande lacuna priva di matrice.</li>
	<li>Utilizzare un plug-in di conteggio delle cellule per l'analisi quantitativa dei modelli cellulari. NOTA: La colorazione del citoplasma rappresenta un metodo di verifica per identificare i diversi modelli spaziali.</li>
	<li>Calcola la densità delle celle dividendo le celle contate per la dimensione della regione di interesse scelta.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Utilizzando la microscopia a fluorescenza aumentata dall'imaging a mosaico e dal sezionamento ottico, abbiamo valutato la disposizione spaziale dei condrociti nell'anoulus dell'IVD lombare durante lo sviluppo, la maturazione e la degenerazione. Mentre il tessuto degenerativo poteva essere raccolto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale per la degenerazione del disco, l'analisi del periodo embrionale e della fase di maturazione richiedeva l'uso di un organismo modello (bovino). Alte densità cellulari ...

Il disco intervertebrale (IVD) è una struttura a base di cartilagine che biochimicamente e rispetto all'architettura cellulare, a prima vista, assomiglia per molti versi alla cartilaginearticolare 1. Infatti, sia la degenerazione IVD che l'osteoartrite (OA) della cartilagine articolare sono caratterizzate da restringimento dello spazio articolare a causa dell'usura della cartilagine, della cisti subcondrale e della formazione di osteofiti e della sclerosi subcondrale2,3. Nonostante queste apparenti somiglianze, l'architettura e il ruolo funzionale di entrambi i tessuti differiscono. Mentre la matrice della cartilagine articolare è formata principalmente da una rete di collagene di tipo II che forma arcade, l'IVD è costituito da tre diversi tipi di tessuto: il nucleo polposo ricco di collagene di tipo II al centro assorbe carichi assiali e li trasmette a un anello comprensivo di fibre circolari di collagene di tipo I densamente imballate che è chiamato anulus fibrosus. La loro funzione è quella di assorbire le pressioni assiali tradotte ricevute dal nucleo ricco di proteoglicani e acqua con la loro resistenza longitudinale a trazione delle fibre. Nella parte superiore e inferiore di ciascun nucleo e anulus una piastra terminale cartilaginea ialina forma la giunzione alle vertebre adiacenti4 (Figura 1).
Nella cartilagine articolare si possono trovare quattro distinti modelli spaziali di condrociti: coppie, stringhe, doppie corde, piccoli gruppi rispettivamente grandi5,6,7 (Figura 2). I cambiamenti in questo modello sono associati all'insorgenza e alla progressione dell'OA8,9. L'organizzazione spaziale dei condrociti è anche indicativa di una proprietà funzionale diretta della cartilagine, vale a dire la sua rigidità, sottolineando la rilevanza funzionale di questo approccio di classificazione basato su immagini10,11. Questi modelli possono inoltre essere identificati con la tecnologia clinicamente disponibile già esistente12. A causa delle somiglianze tra l'IVD e la cartilagine articolare, si può ipotizzare che nell'IVD siano presenti anche modelli caratteristici di condrociti. La formazione di cluster è un fenomeno osservato anche nella IVDdegenerata 13,14.
Quando si tenta di analizzare l'organizzazione cellulare spaziale nell'IVD, è necessario superare diverse difficoltà tecniche che non sono presenti quando si studia la cartilagine articolare:
In primo luogo, l'elaborazione del tessuto stesso è molto più impegnativa rispetto alla cartilagine ialina omogenea che è in gran parte composta da collagene di tipo II. Il principale componente della fibra dell'IVD è il collagene di tipo I, il che rende molto più difficile generare sezioni istologiche sottili. Mentre nella cartilagine articolare ialina anche le sezioni spesse possono essere facilmente analizzate a causa della natura "vetrosa" del tessuto, la rete di collagene di tipo I dell'IVD è otticamente altamente impenetrabile. Per questo motivo, un forte rumore di fondo è un problema comune nell'istologia dell'IVD. Un modo rapido ed economico per penetrare questo tessuto otticamente denso è l'uso di un dispositivo di sezionamento ottico, ad esempio per mezzo di un apotome. In un tale Apotome, una griglia viene inserita nel percorso di illuminazione di un microscopio a fluorescenza convenzionale. Di fronte alla griglia è posizionata una lastra di vetro parallela al piano. Questo si inclina avanti e indietro proiettando così la griglia nell'immagine in tre diverse posizioni. Per ogni posizione z, vengono create e sovrapposte tre immagini raw con la griglia proiettata. Tramite un software speciale, è possibile calcolare la luce fuori fuoco. Il principio di base è che, se la griglia è visibile, quell'informazione è a fuoco, se non è considerata sfocata. Con questa tecnica, immagini ben focalizzate e ad alta risoluzione possono essere acquisite in un ragionevole lasso di tempo.
In secondo luogo, il tessuto è difficile da reperire da donatori umani. Quando si esegue la sostituzione totale del ginocchio, è possibile ottenere l'intera superficie dell'articolazione per ulteriori analisi durante l'intervento chirurgico. Sebbene l'artrosi di un'articolazione diartrodiale sia anche una malattia dell'intera articolazione, ci sono tuttavia forti differenze focali nella qualità della cartilagine con di solito alcune aree dell'articolazione ancora intatte, ad esempio a causa del carico ridotto in quell'area. Questa situazione è diversa nell'IVD, dove la chirurgia viene solitamente eseguita solo quando il disco viene distrutto globalmente. Quando si ottiene tessuto da donatori umani dalla sala operatoria, il tessuto è anche altamente frammentato ed è necessario allocare correttamente il tessuto a uno dei tre tipi di cartilagine dell'IVD prima di effettuare ulteriori analisi. Per consentire analisi più dettagliate anche di sezioni tissutali più grandi e per esaminare lo sviluppo embrionale dell'IVD è quindi necessaria la scelta di un organismo modello animale.
Quando si sceglie un tale organismo modello è importante avere un sistema che sia paragonabile al disco umano per quanto riguarda la sua anatomia e le sue dimensioni, il suo carico meccanico, l'attuale popolazione cellulare e la sua composizione tissutale. Ai fini della tecnica qui presentata suggeriamo l'uso del tessuto del disco lombare bovino: Una proprietà critica del disco umano con conseguente suo basso potenziale rigenerativo è la perdita di cellule notocordali durante la maturazione nel nucleo. Tuttavia, in numerosi organismi modello le cellule notocordali possono essere rilevate per tutta la loro vita. La maggior parte dei pochi animali che perdono le loro cellule notocordali come pecore, capre o cani condrodistrofi hanno un IVD che è molto più piccolo dei dischi umani. Solo i dischi bovini lombari presentano un diametro del disco sagittale paragonabile a quelli degli IVD umani15.
Un fattore chiave che porta alla degenerazione precoce del disco è l'eccessivo carico meccanico. Le pressioni intradiscali di una mucca in piedi nella colonna lombare sono di circa 0,8 MPa con la colonna vertebrale allineata orizzontalmente. Sorprendentemente queste pressioni sono paragonabili alle pressioni intradiscali lombari riportate per la colonna vertebrale umana eretta (0,5 MPa)15,16. Anche la quantità di acqua e proteoglicani nei dischi bovini è paragonabile a quella dell'IVD dei giovaniumani 17. Pertanto, sebbene il modello di movimento effettivo dei segmenti di movimento possa differire negli animali quadrupedi dall'uomo bipede, per quanto riguarda il carico totale e le caratteristiche del disco, la mucca è molto più vicina alla biologia umana rispetto ad altri modelli animali stabiliti per l'IVD come pecore e cani.
In questo protocollo presentiamo una tecnica come analizzare i cambiamenti nell'IVD dal punto di vista dell'organizzazione spaziale dei condrociti dallo sviluppo embrionale precoce alla degenerazione dello stadio terminale.

<table><tbody><tr><td>Amfotericina B</td><td>Merck KGaA,&nbsp; Germania</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio ad adesione SuperFrost Plus</td><td>R. Langenbrinck, Germania</td><td>03-0060</td><td></td></tr><tr><td>ApoTome</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania</td><td>462000115</td><td></td></tr><tr><td>AxioVision Rel. 4.8 con Modul MosaiX</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellMask Actin Tracking Stain</td><td>Thermo Fischer Scientific, US</td><td>A57249</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica Biosystems, US</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific, US</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)</td><td>Gibco, Life Technologies, Germania</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>60004</td><td></td></tr><tr><td>Miscoscopio a fluorescenza - Axio Observer Z1 con Axio Cam MR3 e Colibri</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania</td><td>3834000604</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Merck KGaA,&nbsp; Germania</td><td>104002</td><td></td></tr><tr><td>Immagine J 1.53a, con contatore di cellule plugin</td><td>National Insittute of Health (NIH), Stati Uniti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin</td><td>Thermo Fischer Scientific, Stati Uniti</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Microscopic Cover Glasses</td><td>R. Langenbrinck, Germania</td><td>01-1818/1</td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen Liquid Blocker</td><td>Science Sevices&nbsp; GmbH, Germania</td><td>N71310</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>pf medical AG, Germania</td><td>2023-01</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek,</td><td>Paesi Bassi SA6255012</td><td></td></tr></tbody></table>

sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

La degenerazione del disco intervertebrale (IVD) è una delle principali cause di lombalgia e comporta un alto grado di compromissione per gli individui colpiti. Per decodificare la degenerazione del disco e per essere in grado di sviluppare approcci rigenerativi è essenziale una conoscenza approfondita della biologia cellulare dell'IVD. Un aspetto di questa biologia che rimane ancora senza risposta è la domanda su come le cellule sono disposte spazialmente in uno stato fisiologico e durante la degenerazione. Le proprietà biologiche dell'IVD e la sua disponibilità rendono questo tessuto difficile da analizzare. Il presente studio indaga l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibroso dallo sviluppo embrionale precoce alla degenerazione allo stadio terminale. Un metodo di sezionamento ottico (Apotome) viene applicato per eseguire analisi di colorazione ad alta risoluzione utilizzando tessuto embrionale bovino come modello animale e tessuto del disco umano ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale. Da una densità di condrociti molto elevata nel disco bovino embrionale precoce, il numero di cellule diminuisce durante la gestazione, la crescita e la maturazione. Nei dischi umani, un aumento della densità cellulare ha accompagnato la progressione della degenerazione tissutale. Come era già stato dimostrato nella cartilagine articolare, la formazione di cluster rappresenta una caratteristica della degenerazione avanzata del disco.

Utilizzando immagini a mosaico, l'architettura dell'IVD con la sua fitta rete di fibre di collagene nell'anolo e il nucleo più morbido può essere chiaramente riconosciuta (Figura 4). Una continua diminuzione della densità cellulare può essere osservata durante lo sviluppo embrionale (Figura 5). Mentre nelle prime fasi dello sviluppo dell'IVD si può trovare una densità cellulare di 11.435 cellule/mm² nell'anulus fibrosus bovino e 17.426 cellule/mm² nel nucleo pol...

Presentiamo un metodo per studiare l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibrosus del disco intervertebrale utilizzando un metodo di sezionamento ottico.

Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...

La degenerazione del disco intervertebrale porta ad un alto grado di compromissione e dolore. Il nostro protocollo ci permette di indagare morfologicamente lo sviluppo del disco e i suoi cambiamenti nella degenerazione. La densa rete di collagene di tipo uno rende solitamente difficile analizzare il disco intervertebrale al microscopio.Con il sezionamento ottico, possiamo studiare la disposizione 3D dei condrociti all'interno dei diversi tessuti. Iniziare posizionando campioni di disco intervertebrale o IVD ottenuti per via intraoperatoria in DMEM integrati con 2% volume per volume Penicillina-Streptomicina e 1,2% volume per volume Amfotericina B, immediatamente dopo la raccolta, conservare campioni IVD a quattro gradi Celsius fino a un'ulteriore elaborazione. Se congelato, scongelare i campioni IVD umani a temperatura ambiente e identificare l'origine del tessuto IVD umano in base a proprietà microscopiche come la densità e l'orientamento del college.Per raccogliere il tessuto del disco bovino, prendere il segmento di movimento costituito dall'IVD con le sue due vertebre adiacenti e utilizzando una lama chirurgica numero 15, sezionare l'intero disco bovino dall'osso subcondrale, c

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Questo protocollo illustra una tecnica di raccolta coccigeo dischi intervertebrali bovina per la cultura d'organo...

Preparazione del intatto dischi intervertebrali coda bovina per la Cultura d&#39;organo

Questo video mostra una tecnica per la coltura di dischi intervertebrali bovini in bioreattori per sviluppare un modello tridimensionale di coltura di organi. Ai dischi vengono applicati specifici terreni privi di nutrienti e condizioni di pressione degenerativa, imitando il microambiente pro-infiammatorio e degenerativo osservato durante la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale. Le altezze del disco vengono misurate dopo il trattamento per analizzare gli effetti della privazione...

Generazione di un modello di coltura d'organo pro-infiammatorio per simulare una malattia precoce del disco intervertebrale

Organizzazione delle cellule di ossa cranio-facciali è stato a lungo ipotizzato ma mai visualizzato direttamente. Marcatura delle cellule Multi-spettrale e in vivo vivo   l'imaging consente di visualizzare il comportamento delle cellule dinamica mandibola zebrafish. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo di manipolare Zebrabow pesci transgenici e osservare direttamente intercalazione cellulare e cambiamenti morfologici di condrociti nella cartilagine di Meckel.

Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

cultura organo intero del disco intervertebrale (IVD) conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi cellulari, e le interazioni cellulari-matrice. Qui si descrive un sistema di coltura IVD usando lombare mouse e IVD caudale nei loro unità spinali funzionali e diverse applicazioni che utilizzano questo sistema.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine

La degenerazione del disco intervertebrale è un importante contributo al dolore alla schiena e alla causa principale di disabilità in tutto il mondo. Esistono numerosi modelli animali della degenerazione del disco intervertebrale. Abbiamo dimostrato un modello ovino di degenerazione del disco intervertebrale, utilizzando un bit di trapano, che raggiunge una lesione consistente del disco e un livello riproducibile di degenerazione del disco.

Modello di degenerazione del disco intervertebrale lombare di ovini Utilizzando un lesione laterale retroperitoneale laterale

Viene presentato un protocollo che combina la compensazione dei tessuti con la microscopia a fluorescenza del foglio di luce (LSFM) per ottenere immagini a risoluzione tridimensionale e cellulare dei vasi linfatici e dei linfonodi (LN) che raccolgono il liquido cerebrospinale (CSF) e il fluido epidurale spinale.

Imaging tridimensionale della vascolatura e del drenaggio linfatico vertebrale utilizzandoiDISCO e microscopia a fluorescenza del foglio di luce

Qui descriviamo strumenti e metodi computazionali che consentono la visualizzazione e l'analisi di dati di immagini tridimensionali e quadridimensionali di embrioni di topo nel contesto dell'allungamento e della segmentazione assiale, ottenuti mediante tomografia a proiezione ottica in toto e mediante imaging dal vivo e colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero utilizzando la microscopia multifotonica.

Approcci di visualizzazione e analisi tridimensionali e quadridimensionali per studiare l'allungamento e la segmentazione assiale dei vertebrati

Questo protocollo presenta un nuovo modello sperimentale di coltura proinfiammatoria e degenerativa di organi bovini per simulare la degenerazione del disco intervertebrale in fase iniziale.

Un modello proinflammatorio di coltura degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale.

Presentiamo un approccio passo-passo per identificare e affrontare i problemi più comuni associati alle micro-indentazioni di microscopia a forza atomica. Esemplificamo i problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare umana nativa caratterizzati da vari gradi di degenerazione guidata dall'osteoartrite.

Affrontare i problemi pratici nella microindentazione basata sulla microscopia a forza atomica su espianti di cartilagine articolare umana

Mantenere il microscopio ottico pulita è importante per immagini di alta qualità. Polvere, impronte digitali, l'olio di immersione in eccesso, o di montaggio su supporto o in un microscopio provoca la riduzione di contrasto e risoluzione. DIC è particolarmente sensibile alla contaminazione e graffi sulle superfici lente. Questo protocollo in dettaglio la procedura per la tenuta del microscopio pulito.

Manutenzione e pulizia adeguata del microscopio

Scopri la sezione ottica per visualizzare l'organizzazione tridimensionale dei condrociti nel disco intervertebrale umano e bovino. Questo metodo rivela i cambiamenti morfologici durante lo sviluppo embrionale e la degenerazione.

Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

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