Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

La degenerazione del disco intervertebrale porta ad un alto grado di compromissione e dolore. Il nostro protocollo ci permette di indagare morfologicamente lo sviluppo del disco e i suoi cambiamenti nella degenerazione. La densa rete di collagene di tipo uno rende solitamente difficile analizzare il disco intervertebrale al microscopio.

Con il sezionamento ottico, possiamo studiare la disposizione 3D dei condrociti all'interno dei diversi tessuti. Iniziare posizionando campioni di disco intervertebrale o IVD ottenuti per via intraoperatoria in DMEM integrati con 2% volume per volume Penicillina-Streptomicina e 1,2% volume per volume Amfotericina B, immediatamente dopo la raccolta, conservare campioni IVD a quattro gradi Celsius fino a un'ulteriore elaborazione. Se congelato, scongelare i campioni IVD umani a temperatura ambiente e identificare l'origine del tessuto IVD umano in base a proprietà microscopiche come la densità e l'orientamento del college.

Per raccogliere il tessuto del disco bovino, prendere il segmento di movimento costituito dall'IVD con le sue due vertebre adiacenti e utilizzando una lama chirurgica numero 15, sezionare l'intero disco bovino dall'osso subcondrale, capovolgere il disco per raggiungere le aree centrate. Dopo aver identificato le diverse aree della cartilagine, utilizzare una lama chirurgica numero 20 o 22 per ritagliare l'area di interesse dall'intero disco. Gli IVD di embrioni bovini con una lunghezza della groppa della corona inferiore a 20 centimetri devono essere elaborati senza dissezione.

Decalcificazione eseguita del tessuto come descritto nel manoscritto. Confermare la decalcificazione riuscita, se un ago calibro 20 penetra nel tessuto del disco o, se applicabile, le vertebre senza una notevole resistenza. Esattezza i campioni di tessuto nel volume dieci volte della soluzione di formaldeide al 4% in PBS durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, posizionare il tessuto in un mezzo incorporante solubile in acqua sulla manopola cryotome, in modo tale che venga generato normalmente un piano assiale o un piano che taglia perpendicolarmente il collagene di tipo uno. Utilizzare il criotomo standard per sezionare il tessuto incorporato ad uno spessore di 70 micrometri nei campioni umani e 40 micrometri nei campioni bovini. Raccogliere le sezioni su un vetrino prima di risciacquare le sezioni tre volte con PBS, aggiungere un colorante fluorescente adatto seguito dal mezzo di montaggio e coprire le sezioni con uno slip di copertura.

Posizionare un vetrino con una sezione di tessuto macchiato sul portacampioni del microscopio a florescenza avviando il dispositivo di illuminazione della struttura per eseguire l'imaging a campo visivo singolo con filtri fluorescenti e illuminazione adeguata. Utilizzando un software di ottimizzazione delle immagini compatibile con il microscopio a florescenza, elaborare le immagini ottimizzando l'intensità e la luminosità. Per visualizzare la sezione nel suo complesso, utilizzare la tecnica di imaging a mosaico aprendo le 60 impostazioni di acquisizione dal pannello della barra degli strumenti e regolando le impostazioni del mosaico nel registro dei mosaici.

Per fare ciò, definire il numero di colonne e righe di immagini del campo visivo che devono essere successivamente unite in un'unica immagine di panoramica, premere imposta e regolare la correzione dello stato attivo delle singole tessere. Post-elaborare le immagini ottimizzando l'intensità e la luminosità. Per analizzare l'organizzazione spaziale dei condrociti utilizzare la funzione 3d incorporata nel software regolando le impostazioni Z-stack con il pulsante start/stop, definire i parametri di scansione come le posizioni di avvio e arresto nell'asse Z e la distanza slice.

Identificare i singoli modelli cellulari e utilizzare un plug-in di conteggio delle cellule per l'analisi quantitativa dei modelli cellulari, calcolare la densità cellulare dividendo le cellule contate per la dimensione della regione di interesse scelta. L'architettura dell'IVD con la sua fitta rete di fibre di collagene nell'anulus e il nucleo più morbido può essere riconosciuta nelle immagini a mosaico scattate nel piano assiale e sagittale. Nelle aree ingrandite delle immagini del mosaico, sono stati notati diversi modelli organizzativi spaziali di condrociti come singole cellule, coppie e stringhe.

Lo studio delle diverse fasi di sviluppo e maturazione della fibrosi dell'anulus bovino ha mostrato una continua diminuzione della densità cellulare durante lo sviluppo del disco embrionale. D'altra parte è stato osservato un aumento della densità cellulare e della formazione di cluster nel disco umano adulto durante la degenerazione. La densità cellulare nelle prime fasi dello sviluppo dell'IVD nella fibrosi dell'anulus bovino e nel nucleo polposo bovino è diminuita rapidamente fino alla nascita.

Per canale l'imaging dell'IVD con l'Epitome ha permesso la visualizzazione dell'architettura 3D dei modelli spaziali come il citoplasma e il nucleo, nel singolo IVD intatto e sono state individuate coppie di condrociti. Mentre nell'anulus degenerato sono stati trovati cluster di cellule. La parte più impegnativa è allocare il tessuto alla sua origine e correggere l'incorporato per il sezionamento.

Questo è essenziale per ottenere risultati affidabili. Aver correttamente sezionato e selezionato tessuto IVD da diversi stadi e origini ci permette di approfondire l'analisi mediante ulteriori analisi biochimiche e biomeccaniche, come l'ELISA o la microscopia a forza atomica.