Attivazione e coniugazione di polisaccaridi solubili utilizzando 1-ciano-4-dimetilamminopiridina tetrafluoroborato (CDAP)

I polisaccaridi sono scarsamente immunogenici a meno che non siano legati alle proteine e devono essere attivati per la derivatizzazione o la coniugazione alle proteine. In questo metodo, CDAP viene utilizzato come reagente per il vano sabbia. Il CDAP attiva idrossili polisaccaridi per derivatizzazione o per essere collegato a proteine per l'uso in vaccini o reagenti diagnostici.

CDAP ha in gran parte sostituito il bromuro di cianogeno come reagente di polisaccaride per il polisaccaride. CDAP è più semplice da usare, più efficiente e può essere utilizzato a un pH inferiore rispetto al bromuro di cianogeno. È un reagente attivante molto migliore.

CDAP può essere utilizzato con la maggior parte dei polisaccaridi, a differenza di dire aminazione riduttiva, che richiede idrossili vicinali. La chimica può essere utilizzata sia per coniugare direttamente che indirettamente alle proteine e può essere utilizzata per produrre reagenti diagnostici. La reazione di attivazione del CDAP, come originariamente descritta, è stata molto rapida e difficile da controllare.

Il protocollo fornito qui rende la chimica molto più facile da eseguire e molto più riproducibile. Prima di iniziare l'esperimento, regolare il pH della soluzione di polisaccaride a 9 aggiungendo 200 microlitri di soluzione stock di dimetilamminopiridina in modo goccioso mentre si mescola. Mantenere la reazione refrigerata a bagnomaria per l'intero processo di attivazione.

Procedere con l'attivazione di ciano-dimetilamminopiridina-tetrafluoroborato o CDAP trasferendo 100 microlitri di CDAP alla soluzione di polisaccaride durante l'agitazione. Avviare il timer e monitorare la variazione di pH durante l'intera attivazione per 15 minuti. Mantenere la reazione al pH target aggiungendo prontamente incrementi di 10 microlitri di 0,1 idrossido di sodio molare.

Quando viene raggiunto il tempo di attivazione ottimale, aggiungere due millilitri di 0,5 molari adipico diidrazide tutto in una volta al polisaccaride attivato. Verificare che il pH sia nell'intervallo richiesto per la funzionalizzazione dell'idrossido. Dopo aver mescolato continuamente la miscela di reazione per almeno un'ora, trasferire la miscela di reazione a quattro gradi Celsius.

Per ridurre la concentrazione di ADH dal prodotto, dializzare la soluzione di polisaccaride derivato grezzo utilizzando il dispositivo di dialisi. Recuperare il polisaccaride derivato dalla dialisi e determinare la concentrazione dei polisaccaridi e dell'idrazide per calcolare il rapporto idrazide/polisaccaride. Preparare un milligrammo per millilitro soluzione di polisaccaride non modificato da utilizzare come standard.

Preriscaldare il blocco riscaldante a 140 gradi Celsius per un minimo di un'ora per ottenere una temperatura uniforme stabile. Utilizzare un cuscinetto protettivo sotto e intorno al blocco riscaldante in caso di fuoriuscite di acido. Aggiungere volumi variabili di un milligrammo per millilitro di carboidrati standard alle provette di borosilicato etichettate 13 per 100 in triplicati e portare il volume a 100 microlitri con acqua per raggiungere le concentrazioni standard desiderate.

Allo stesso modo, impostare i saggi del campione aggiungendo un volume contenente cinque microgrammi del polisaccaride derivato a tre provette campione. Aggiungere 100 microlitri di sei milligrammi per millilitro di resorcinolo appena preparati a ciascun tubo. Usando un pipetter ripetuto, aggiungere 300 microlitri dell'acido solforico al 75% preparato a ciascun tubo, vorticare vigorosamente i tubi, puntando via il tubo, quindi posizionare tutti i tubi in un blocco riscaldatore a un ritmo costante in ordine sequenziale e impostare immediatamente il timer per tre minuti.

A tre minuti, rimuovere i tubi nello stesso ordine e metterli direttamente in un rack in un bagno di acqua ghiacciata. Rimuovere i tubi ghiacciati per consentire loro di equilibrarsi a temperatura ambiente per cinque minuti. Leggi l'assorbanza di tutti i tubi su uno spettrofotometro UV-Vis a 430 nanometri usando una cuvetta di lunghezza del percorso di 10 millimetri.

Per impostare le reazioni di analisi, ordinare e disporre i tubi standard etichettati nel rack del tubo in ordine di concentrazione crescente. Utilizzando una micropipetta calibrata, aggiungere 100 microlitri degli standard a ciascun tubo corrispondente. Per lo standard zero, utilizzare 100 microlitri del buffer del campione.

Allo stesso modo, preparare e disporre le provette campione. Quindi, utilizzando una micropipetta calibrata da 1.000 microlitri, aggiungere 875 microlitri di tampone di dosaggio a tutti i tubi di analisi. Per avviare la reazione di dosaggio, aggiungere 25 microlitri di acido solfonico trinitrobenzene all'1% di ciascun tubo di dosaggio nell'ordine predeterminato entro cinque minuti.

Ruotare i tubi di analisi per due secondi ad alta velocità, assicurandosi che il liquido rotti ad un'altezza di mezzo pollice dall'apertura del tubo. Registrare l'ora di inizio del test e impostare il timer su due ore. Quindi posizionare il rack del tubo di analisi al buio a temperatura ambiente per due ore.

Quando il tempo è finito, vortice i tubi e procedere alla raccolta dei dati. Il destro di ADH è stato studiato per il destrorsano utilizzando il test dell'acido solforico resorcinolo. È stato tracciato un tipico tubo standard che utilizza il glucosio come standard di zucchero.

Il contenuto di idrazide in polisaccaride o destrano derivatizzato è stato determinato utilizzando il test TNBS. Il livello di derivatizzazione è stato calcolato come idruri per 100 kilodalton di destrano per facilitare il confronto tra polimeri di diversi pesi molecolari medi. Potrebbe essere necessario adattare il protocollo qui descritto per un polisaccaride specifico.

La chimica CDAP può essere utilizzata per funzionalizzare i polisaccaridi per l'uso con un'ampia varietà di reagenti di coniugazione. Può essere utilizzato, ad esempio, per biotinilato polisaccaridi per l'uso in ELISA. Le proteine possono essere direttamente collegate ai polisaccaridi attivati da CDAP, ma questo di solito richiede una certa ottimizzazione per uno specifico polisaccaride.

La resa di coniugazione può essere superiore al 75% L'uso della chimica CDAP ha permesso vaccini coniugati a basso costo, come quelli realizzati, ad esempio, dal Serum Institute of India.