Test di attivazione dei basofili per la diagnosi di allergia

Il test di attivazione dei basofili è un test diagnostico in vitro gratuito per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate che si sono dimostrate utili per le reazioni indotte da farmaci, cibo o inalanti, nonché in alcune forme di orticaria cronica. Questo test si basa sulla determinazione della risposta dei basofili all'attivazione di IgE cross-linking di un allergene o di un farmaco attraverso la misurazione dei marcatori di attivazione mediante citometria a flusso. Il test di attivazione dei basofili può essere uno strumento utile e complementare per evitare test di provocazione controllati per confermare la diagnosi di allergia, specialmente nei soggetti che manifestano gravi reazioni potenzialmente letali.

Inoltre, questo test ha il vantaggio di essere in grado di analizzare la risposta contro qualsiasi farmaco o allergene rispetto ad altri metodi in vitro che sono disponibili solo per pochi farmaci e allergeni. I principali limiti del test sono legati alla sensibilità non ottimale, specialmente nell'allergia ai farmaci. La necessità di eseguire il test non più di 24 ore dopo l'estrazione del campione e la mancanza di standardizzazione tra laboratori e algoritmi diagnostici.

Inizia raccogliendo il sangue periferico in tubi eparinizzati, e posiziona i campioni in un rotore per mantenerli a temperatura ambiente fino a quando non sono necessari per il protocollo sperimentale. Etichettare due tubi citometrici da cinque millilitri ciascuno per il controllo negativo e il controllo positivo. Etichettare anche un tubo ciascuno per le diverse concentrazioni di allergeni o farmaci in fase di test.

Quindi posizionare i tubi in un rack in modo che i tubi si adattino perfettamente senza scivolare. Per il primo controllo positivo, preparare una soluzione a quattro micromolari di N-formilmetionil-leucil-fenilalanina o fMLP in 0,05% PBS-T Per confermare la qualità dei basofili. Per il secondo controllo positivo, preparare una soluzione anti-IgE da 0,05 milligrammi per millilitro utilizzando PBS-T.

Preparare la miscela di colorazione aggiungendo un microlitro ciascuno di anticorpi CCR3-APC, CD203c-PE e CD63-FITC per 20 microlitri di tampone di stimolazione. Quindi aggiungere 23 microlitri di questa miscela colorante a ciascun tubo. Aggiungere 100 microlitri di PBS-T ai tubi di controllo negativi.

Aggiungere 100 microlitri di fMLP a uno dei tubi di controllo positivi e aggiungere 100 microlitri di anti-IgE E all'altro al resto dei tubi. Aggiungere 100 microlitri delle diverse concentrazioni di allergeni o farmaci e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 100 microlitri di sangue a ciascun tubo per evitare l'emolisi.

Quindi vortice delicatamente i tubi e incubarli per 25 minuti a 37 gradi Celsius nel bagno termostatico con media agitazione. Tenere i tubi a quattro gradi Celsius per almeno cinque minuti per fermare la degranulazione. Ad ogni provetta, aggiungere due millilitri di tampone lisante per lisare gli eritrociti.

Vortice ogni tubo e poi incubare i tubi per cinque minuti a temperatura ambiente. Centrifugare i tubi a 300 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi capovolgere il rack nel lavandino per decantare il surnatante mentre le celle rimangono sul fondo dei tubi.

Aggiungere tre millilitri di PBS-T a ciascun tubo per lavare le celle e vortice i tubi. Eseguire un secondo ciclo di centrifugazione utilizzando lo stesso set di parametri e decantare il surnatante rovesciando il rack nel lavandino. Quindi mantenere i campioni a quattro gradi Celsius protetti dalla luce fino alla citometria a flusso.

Collegare il citometro a flusso al software del computer e attendere che il citometro sia pronto. Caricare il modello e le impostazioni dello strumento come descritto nel testo manuscritto. Avviare il processo di acquisizione del campione.

Per selezionare i basofili attivati, in primo luogo, eliminare i linfociti dal grafico Side Scatter-Forward Scatter. Quindi eliminare i basofili dalla popolazione di linfociti come CCR3 + CD203c + cellule e acquisire almeno 500 basofili per tubo. Impostare la soglia CD63 a circa il 2,5% utilizzando i tubi di controllo negativi e analizzare i campioni.

Le reazioni di ipersensibilità IgE-dipendenti sono state studiate eseguendo un test di attivazione dei basofili, o BAT, utilizzando allergeni e farmaci. La sensibilità dei basofili è stata analizzata misurando la reattività a più concentrazioni di allergeni decrescenti che aiutano a determinare la concentrazione allergica che induce la risposta del 50% di basofili o EC50. In primo luogo, i linfociti sono stati controllati dal grafico di dispersione laterale in avanti.

Quindi i basofili sono stati prelevati dalla popolazione linfocitaria come CCR3 + CD203c + cellule. Quindi è stato utilizzato un grafico CCR3-CD63 per analizzare l'attivazione dei basofili utilizzando CD63 come marcatore di attivazione per due farmaci e diverse concentrazioni di un allergene. Il test viene eseguito con sangue intero fresco e deve essere eseguito non più di 24 ore dopo l'estrazione del sangue.

Lo stimolo utilizzato nel test non deve includere eccipienti e devono essere considerate le caratteristiche chimiche dei farmaci. Altri metodi aggiuntivi in vitro per la diagnosi delle reazioni allergiche IgE-mediate, o la determinazione delle IgE, o il test di rilascio dell'istamina.