Marcatura immunofluorescente di virus vegetali e proteine di insetti vettori nell'intestino degli emitteri

Questo protocollo può essere utilizzato per studiare vari movimenti negli insetti, funzioni delle proteine degli insetti e interazioni tra virus e insetto vettore in vivo. Questo metodo è efficiente e informativo. Le strutture dell'intestino degli insetti e delle cellule ausiliarie sono chiaramente visualizzate quando vengono visualizzate con la microscopia confocale a scansione laser.

A dimostrare la procedura sarà Lu Zhang, PhD del nostro laboratorio. Per iniziare, trasferisci insetti non viruliferi dai bicchieri di vetro al virus nano striato nero del riso meridionale fresco, SRBSDV, piante di riso infette coperte da una rete a prova di insetto per un periodo di accesso all'acquisizione del virus di due giorni. Quindi raccogliere gli insetti in bicchieri di vetro contenenti piantine di riso fresco.

Dopo due giorni, raccogliere gli insetti dai bicchieri di vetro usando un aspiratore manuale per la dissezione e l'escissione dell'intestino. Preparare 0,01 molari PBS, 4% paraformaldeide e 2% Triton X-100 come descritto nel manoscritto di testo. Utilizzare un pipetter per posizionare 100 microlitri di PBS su un vetrino e posizionare il vetrino sul palco di un microscopio ottico.

Utilizzare l'aspiratore manuale per raccogliere gli adulti infetti da SRBSDV dai bicchieri di vetro e metterli in un tubo da 1,5 millilitri sul ghiaccio per paralizzare gli insetti. Trasferire un adulto paralizzato nei 100 microlitri di PBS sul vetrino con l'addome verso l'alto. Utilizzare una pinzetta per bloccare il corpo e rimuovere la testa con un altro set di pinzette.

Con una serie di pinzette, bloccare i lati dell'addome e bloccare l'ovopositore o l'organo copulatore della coda con l'altro set, quindi tirare con attenzione la membrana intersegmentale di un segmento addominale per esporre lentamente l'intestino nell'addome. Continuare a strappare via la membrana e gradualmente estrarre l'intestino completo dall'addome. Tirare delicatamente la coda che è collegata alla fine dell'intestino per rimuovere l'intestino completo.

Mettere le budella asportate in una provetta da centrifuga da 200 microlitri. Aggiungere 200 microlitri di PBS al tubo e utilizzare una pipetta per lavare accuratamente le budella. Utilizzare un pipetter per posizionare 100 microlitri di PBS su un vetrino e posizionare il vetrino sul palco di un microscopio ottico.

Utilizzare l'aspiratore manuale per raccogliere le ninfe infette SRBSDV dai bicchieri di vetro e posizionarle in un tubo da 1,5 millilitri posto sul ghiaccio per paralizzare gli insetti. Trasferire una ninfa paralizzata nei 100 microlitri di tampone sul vetrino con l'addome rivolto verso l'alto. Stacca la coda della ninfa, quindi blocca il corpo dell'insetto per fissarlo delicatamente e usa l'altra coppia per bloccare la testa.

Tirare delicatamente la testa lontano dal corpo pur mantenendo il suo attaccamento all'intestino in modo che la testa sia staccata dal corpo, ma l'intestino è ancora attaccato al torace e all'addome. Con le pinzette che ancora bloccano il corpo, usa l'altra coppia per muovere la testa con attenzione e estrarre gradualmente l'intestino. Staccare l'intestino dalla testa per ottenere un intestino intatto senza danneggiare il corpo.

Mettere le budella asportate in un tubo. Aggiungere PBS al tubo e succhiare delicatamente rilasciare la soluzione con una pipetta per lavare accuratamente le budella. Preparare gli anticorpi e il supporto di montaggio come descritto nel manoscritto testuale.

Posizionare le budella WBPH appena asportate e lavate con PBS in 100 microlitri di paraformaldeide al 4% in una provetta da centrifuga da 200 microlitri a temperatura ambiente. Dopo due ore, sostituire la soluzione di paraformaldeide con 200 microlitri di PBS. Dopo 10 minuti, rimuovere il PBS per eliminare qualsiasi paraformaldeide e ripetere il passaggio di lavaggio PBS due volte.

Dopo due lavaggi PBS, aggiungere 200 microlitri di detergente non ionico Triton X-100 per permeabilizzare i campioni a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, rimuovere Triton X-100 e lavare via il detersivo rimanente con tre lavaggi di 10 minuti con PBS. Diluire gli anticorpi marcati da uno a 50 con 50 microlitri di albumina sierica di toro.

Aggiungere gli anticorpi diluiti alla provetta e incubare i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina dopo aver rimosso l'anticorpo, lavare via il diluente anticorpale rimanente con tre lavaggi di 10 minuti con PBS. Diluire un microlitro di DyLight 633-Phalloidin con 50 microlitri di PBS e aggiungere 50 microlitri di falloidina diluita al tubo per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente.

Dopo aver rimosso la falloidina, lavare accuratamente la falloidina rimanente con tre lavaggi di 10 minuti con PBS. Posizionare una goccia di supporto di montaggio contenente DAPI su un vetrino da microscopio. Trasferire le budella sul mezzo e posizionare delicatamente il vetro di copertura sul campione senza creare bolle.

La micrografia confocale a scansione laser rappresentativa delle budella WBPH asportate dagli adulti dopo l'etichettatura con falloidina ha mostrato tre sezioni: l'intestino anteriore, l'intestino medio e l'intestino posteriore. Tra questi, il midgut è il sito di infezione iniziale di SRBSDV. La struttura cellulare epiteliale monostrato dell'intestino facilita lo studio della localizzazione cellulare delle proteine degli insetti e la colocalizzazione delle proteine virali e degli insetti.

Qui sono mostrati gli inbuconi WBPH asportati con virioni anti-VAMP-7 marcati DyLight 488 e SRBSDV con anticorpi anti-SRBSDV marcati con DyLight 549. I virioni VAMP-7 e SRBSDV hanno dimostrato di co-localizzarsi nel citoplasma, suggerendo che VAMP-7 può svolgere un ruolo nella trasmissione del virus in vivo. Le budella permeabilizzate devono essere pulite accuratamente dopo l'incubazione con anticorpi coniugati luciferina per ridurre lo sfondo e il legame non specifico.

Questo è un metodo affidabile per visualizzare la localizzazione di virus, altri agenti patogeni e proteine degli insetti negli insetti. Fornisce le basi per ulteriori studi sulla relazione tra agenti patogeni e insetti.