Name: Valutazione multifattoriale del comportamento motorio nei ratti dopo la lesione unilaterale da schiacciamento del nervo sciatico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: Impara a valutare il comportamento motorio nei ratti dopo lesione del nervo sciatico utilizzando test comportamentali standardizzati. Questo metodo permette di analizzare deficit motori e coordinazione.

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Questo lavoro è stato supportato dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF DysTract to C.W.I.) e dal Centro interdisciplinare per la ricerca clinica (IZKF) dell'Università di Würzburg (da N-362 a C.W.I.; da Z2-CSP3 a L.R.). Inoltre, questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito del COFUND-EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover to J.V.) dell'Unione europea e dalla Fondazione VERUM. Inoltre C.W.I. è finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca reseach) Project-ID 424778381-TRR 295, dalla Deutsche Stiftung Neurologie e dal ParkinsonFonds. L.R. è inoltre supportato dalla Dystonia Medical Reseach Foundation.
Gli autori ringraziano Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel e Louisa Frieß per la loro assistenza tecnica, nonché Helga Brünner per la cura degli animali.

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<li>Kline, D. G., Kim, D., Midha, R., Harsh, C., Tiel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+and+results+of+sciatic+nerve+injuries%3A+a+24-year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Management and results of sciatic nerve injuries: a 24-year experience.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (1), 13-23 (1998).</li>
<li>Kaplan, H. M., Mishra, P., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+overwhelming+use+of+rat+models+in+nerve+regeneration+research+may+compromise+designs+of+nerve+guidance+conduits+for+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The overwhelming use of rat models in nerve regeneration research may compromise designs of nerve guidance conduits for humans.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 26 (8), 226(2015).</li>
<li>Bauder, A. R., Ferguson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+mouse+sciatic+nerve+crush+and+subsequent+assessment+of+regeneration+by+whole+mount+muscle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3606(2012).</li>
<li>Savastano, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciatic+nerve+injury%3A+a+simple+and+subtle+model+for+investigating+many+aspects+of+nervous+system+damage+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery.</a> Journal of Neuroscience Methods. 227, 166-180 (2014).</li>
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<li>Metz, G. A., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ladder+rung+walking+task%3A+a+scoring+system+and+its+practical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application.</a> Journal of Visualized Experiments. (28), e1204(2009).</li>
<li>Metz, G. A., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+subcortical+lesions+impair+skilled+walking+in+the+ladder+rung+walking+test%3A+a+new+task+to+evaluate+fore-+and+hindlimb+stepping%2C+placing%2C+and+co-ordination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination.</a> Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).</li>
<li>Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment%2C+social+interaction%2C+and+physical+activity+as+determinants+of+functional+outcome+after+cerebral+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat.</a> Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).</li>
<li>Ohwatashi, A., Ikeda, S., Harada, K., Kamikawa, Y., Yoshida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+enhanced+functional+recovery+and+expression+of+GDNF+after+photochemically+induced+cerebral+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22EXCLI+Journal%22%5BJournal%5D)">Exercise enhanced functional recovery and expression of GDNF after photochemically induced cerebral infarction in the rat.</a> EXCLI Journal. 12, 693-700 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo di valutazione comportamentale fornisce una panoramica di vantaggi e svantaggi, nonché possibili letture della batteria di prova comportamentale selezionata in un modello di roditore dopo una lesione da schiacciamento del nervo sciatico. 
Per ottenere un risultato comparativo della lesione da schiacciamento del nervo sciatico, è obbligatoria una tecnica di schiacciamento coerente. L'uso di un morsetto non seghettato (Ultra Fine Hemostat) al posto delle pinze può migliorare la consistenza della frantumazione. Utilizzare lo stesso morsetto e la stessa posizione di schiacciamento per garantire la stessa compressione nervosa. L'uso esclusivo del morsetto per la lesione da schiacciamento e la movimentazione del morsetto con cura migliora la consistenza. Inoltre, eseguire la procedura della lesione da schiacciamento con cura. Ulteriori danni al nervo durante l'intervento chirurgico come la trazione indesiderata del nervo possono portare a effetti collaterali indesiderati come l'automutilazione. Pertanto, si raccomanda un'attenta preparazione nervosa e la somministrazione di un antidolorifico per un minimo di due giorni. 
La valutazione multifattoriale del comportamento motorio può caratterizzare il fenotipo dopo la lesione da schiacciamento nervoso nei ratti a vari livelli. Abbiamo utilizzato l'analisi dell'andatura OFT, CatWalk XT, il compito di beam walking e il compito di camminare con gradini a scala. Per questi esperimenti è essenziale una procedura sperimentale cieca e un'analisi dei dati per i gruppi sperimentali. Prima della valutazione del comportamento, gli animali sono stati acclimatati nella sala prove in condizioni di test per almeno 30 minuti. Tutti i test comportamentali applicati nel presente documento hanno il vantaggio che la privazione di cibo o acqua non è richiesta. Lo stesso gruppo di animali è stato utilizzato in tutti i test comportamentali descritti. Per ogni animale sono stati eseguiti al massimo due diversi test comportamentali al giorno. Se i test comportamentali vengono eseguiti a intervalli regolari, prestare attenzione a una procedura comparabile, come eseguire il test nello stesso ordine animale e allo stesso momento della giornata. Un altro aspetto importante per l'analisi comportamentale è il ciclo giorno-notte dei ratti. Si consideri un ciclo giorno-notte invertito per ottenere livelli di attività più naturali e più elevati durante il ciclo diurno (ciclo scuro). Questo deve essere considerato soprattutto per la misurazione del comportamento spontaneo, come l'OFT. In questo esperimento non è stato possibile attuare un ciclo invertito giorno-notte, ma è stata garantita un'adeguata acclimatazione alle condizioni di prova. Un'illuminazione perfetta è essenziale per i video ad alta risoluzione per il compito di camminare con il fascio e il compito di camminare con gradini a scala. Questa alta qualità video non può essere raggiunta quando si eseguono esperimenti al buio. 
La valutazione dell'andatura richiede una prestazione di attività continua. Il primo aspetto importante di una continua prestazione di attività è convincere gli animali ad attraversare la configurazione. Per aumentare la motivazione, posizionare piccoli pellet alimentari (45 mg) alla fine della configurazione. Affinché gli animali conoscano i pellet alimentari, i pellet devono essere alimentati prima del test. Inoltre, una casella di obiettivo alla fine della configurazione può essere utile. La configurazione della Passerella include già una casella di porta, ma i ratti a volte esitano a entrare nella casella di porta. In alternativa, puoi aggiungere una piccola gabbia nella scatola degli obiettivi, ma la gabbia di casa dei ratti non si adatta alla scatola degli obiettivi. Lascia che il topo si assueti nella gabbia per alcuni minuti prima dell'acquisizione. Inoltre, un altro topo della stessa gabbia di casa può essere inserito nella scatola dei gol o nella gabbia all'interno della scatola porta. Assicurarsi che il secondo topo rimanga nella scatola e non blocchi l'ingresso alla scatola degli obiettivi. Inoltre, è anche possibile rimuovere la scatola degli obiettivi dal sistema CatWalk e posizionare la gabbia domestica del topo alla fine della passerella, che consente al topo di entrare nel proprio "territorio di casa" dopo ogni corsa. Per la configurazione del compito di camminata del fascio e del compito di camminata a gradini della scala, si consiglia di aggiungere una scatola porta o la gabbia di casa alla fine della configurazione. Per garantire la coerenza, la passerella, il compito di camminare con la trave e il compito di camminare con gradini a scala devono essere eseguiti almeno una volta alla settimana con da sei a dieci corse.
Sebbene non tutte le analisi producano differenze significative in questo studio, considera che l'inclusione di animali o gruppi di trattamento geneticamente modificati potrebbe produrre dati preziosi in grado di distinguere tra gruppi dagli stessi test comportamentali. 
La lesione da schiacciamento nervoso non ha avuto alcun effetto sull'attività locomotoria del ratto, che è stata misurata in cinque minuti di OFT. L'analisi dell'andatura Catwalk XT è uno strumento più oggettivo e sensibile per analizzare il posizionamento di andature, zampe e dita dei dita dei dita dei dati. Dopo un intenso allenamento, i ratti imparano ad attraversare la passerella dell'apparato CatWalk XT fino alle impostazioni predefinite. La lesione nervosa non riduce la capacità dei ratti di attraversare la passerella. Il calcolo automatico di vari parametri presenta i dati in modo oggettivo. Ulteriori informazioni possono essere ottenute utilizzando il modulo "Misurazioni interattive dell'impronta" e, in effetti, queste analisi hanno prodotto differenze significative in vari parametri di diffusione delle dita dei dita dei dati, lunghezza di stampa e angolo della zampa rispetto all'asse del corpo confrontando i ratti con e senza lesioni nervose.
I ratti possono essere addestrati facilmente per il compito di camminare con il raggio. Le differenze nel tempo di latenza per attraversare la trave e nel numero di scivolamenti del piede per passo dell'arto posteriore nevralgico sono state rilevate confrontando ingenuamente con ratti feriti dalla schiacciamento. Uno svantaggio dell'analisi dei ratti feriti dai nervi con il compito di camminare con il fascio è la dimensione del fascio. Entro le prime due settimane dopo la lesione da schiacciamento del nervo sciatico, i ratti hanno bisogno di assistenza per attraversare la trave poiché il loro equilibrio è compromesso. Sebbene alcuni ratti possano essere in grado di attraversare la trave, il rischio di lesioni causate da una caduta è elevato. Gli animali schiacciati dai nervi dovrebbero quindi essere assistiti ad attraversare il raggio per le prime due settimane dopo la lesione da schiacciamento del nervo sciatico o più a lungo, se necessario. Tuttavia, è difficile confrontare le corse con e senza assistenza. Inoltre, il bilanciamento del motore è un parametro importante valutato dal compito di camminata del fascio. Abbiamo ritenuto che questo parametro non fosse rilevante per il nostro modello di ratto di schiacciamento nervoso. Pertanto, i punteggi descritti da Ohwatashi e altri e Johansson & Ohlsson non hanno potuto essere utilizzati e le corse con un traverso di travi incompleto sono state escluse perl'analisi dei dati 18,19.
La scala a 7 categorie di Metz et al. Analizzando gli errori più importanti, che includono le categorie da 0 a 2, non è stato possibile rilevare differenze di errori per passo nell'ostacolo quando si confrontano ratti wt feriti dai nervi con ratti wt ingenui. Inoltre, il tempo di latenza di attraversamento dell'apparato a pioli non differiva tra ratti wt feriti dai nervi e ratti ingenui. I modelli di deep learning potrebbero migliorare e accelerare l'analisi dei dati del compito di camminata a pioli attraverso un approccio automatizzato.
È importante menzionare che la lesione da schiacciamento nervoso e tutti i test comportamentali descritti possono facilmente essere tradotti nei topi, adattando le impostazioni e le dimensioni delle configurazioni. L'uso dei topi come organismo modello ha l'effetto benefico che esistono modelli transgenici per molte malattie umane.

I roditori sono eccellenti organismi modello per approfondire la comprensione delle malattie umane1,2 testando ipotesi su più livelli biologici. Un livello biologico fondamentale per la caratterizzazione dei modelli di roditori è il livello di fenotipo, misurato da valutazioni comportamentali. A seconda del modello animale e della domanda di ricerca scientifica, la selezione di una batteria di test comportamentale potente e affidabile è essenziale per coprire una vasta gamma di aspetti comportamentali come per i modelli animali del morbo di Parkinson e della distonia3,4,5,6.
Il nervo sciatico è il nervo più grande del corpo umano con fibre motorie e sensoriali. Le lesioni del nervo sciatico possono derivare facilmente da una varietà di eventi come incidenti stradali e interventichirurgici 7,8. Pertanto, le attività di ricerca che utilizzano modelli di roditori con lesioni nervose sciatiche, hanno un valore traslazionemente rilevante. Anche se l'aspetto traslatore della rigenerazione nervosa dal ratto all'uomo deveessere considerato criticamente 9, la lesione da schiacciamento del nervo sciatico (assonotmesi) nei modelli di roditori è un metodo comunemente usato per analizzare i processi di degenerazione e rigenerazione dei nerviperiferici 10,11. In caso di infortunio alla schiacciamento il nervo non è completamente trasetto. Danneggia l'assone, risultando in blocco di conduzione subito dopo lesioni da schiacciamento seguite da processi rigenerativi 4,12,13.
Inoltre, nella ricerca sulla distonia, la lesione unilaterale della schiacciamento del nervo sciatico è un metodo stabilito per innescare movimenti simili alla distonia (DLM) nei modelli di roditori distonia geneticamente predisposti, che non mostrano DLM di persé 4,14. Si presume che il trauma nervoso periferico disturbi l'integrazione sensorimotoria influenzando le fibre nervose sciatiche, che sono responsabili delle funzioni motorie esensoriali 15.
Qui forniamo una descrizione dettagliata per una lesione di schiacciamento standardizzata del nervo sciatico e una batteria di valutazioni del comportamento motorio composta dal test sul campo aperto (OFT), analisi dell'andatura CatWalk XT, compito di camminata del fascio e compito di camminata a gradini in ingenui ratti di tipo selvaggio (wt) (n = 8-9) e ratti wt cinque settimane dopo una lesione unilaterale da schiacciamento del nervo sciatico (n = 10). L'OFT fornisce informazioni sull'attività locomotoria generale, mentre un'analisi dettagliata dell'andatura è ottenuta dal sistema di analisi automatizzata dell'andatura CatWalk XT. Il compito di camminata del fascio viene utilizzato per valutare la coordinazione del motore valutando il tempo di attraversare la trave e il numero di errori di posizionamento del piede. Per l'analisi delle prestazioni dell'andatura, il compito di camminare con gradini a scala fornisce informazioni sul posizionamento del piede o della zampa ed errori su un apparato a gradini orizzontali con un motivo a gradini costante ma irregolare.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico, &ge; 99,8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33209-1L</td><td></td></tr><tr><td>Appose ULC cucitrice cutanea 35W</td><td>Covidien</td><td>8886803712</td><td></td></tr><tr><td>Beam</td><td>auto-fatto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen crema per gli occhi</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>81552983</td><td></td></tr><tr><td>Box per OFT</td><td>auto-fatto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videocamera GC-PX100</td><td>JVC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catwalk XT</td><td>Noldus</td><td></td><td>&nbsp; configurazione e software</td></tr><tr><td>Camera per isofluran</td><td>GT-Labortechnik</td><td></td><td>su misura</td></tr><tr><td>Bisturi monouso n. 11</td><td>Piuma</td><td>20.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>Dr&auml; ger Vapor 19.3 sistema isoflurano</td><td>Dr. Wilfried M&uuml; ller GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #2 - pinza per laminectomia</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinza</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td> pellet <td>di precisione superfini</td></tr><tr><td>senza polvere 45 mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0021</td><td></td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>Noldus</td><td></td><td>&nbsp; configurazione e software</td></tr><tr><td>Pinze 160 mm</td><td>Hartenstein</td><td>PZ09</td><td></td></tr><tr><td>Maschera per anestesia gassosa, ratto</td><td>Dr. Wilfried M&uuml; ller GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scatola porta per scala piolo apparecchio per attività di camminata</td><td>autocostruito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tagliacapelli Magnum 5000</td><td>Wahl GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini temprate</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo riscaldante</td><td>MEDAX</td><td>13801</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml</td><td>cp-pharma</td><td>1214</td><td>prescrizione necessaria</td></tr><tr><td>Kinovea</td><td>www.kinovea.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per attività di camminata a pioli a scala</td><td>autocostruito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaaghi</td><td>KLS Martin</td><td>20-526-14-07</td><td></td></tr><tr><td>Octeniderm</td><td>Sch&uuml; lke</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl 50 mg/ml, iniettabile</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Carprofen, prescrizione necessaria</td></tr><tr><td>Divaricatori elastici</td><td>autocostruiti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distanziatore per trave</td><td>autocostruito</td> Distanziatore per scala pioli autocostruiti <td></td><td></td></tr> apparecchio <tr><td>per attività di deambulazione</td><td>autocostruito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture Silkam 4/0 DS 19</td><td>B. Braun</td><td>C0762202</td><td></td></tr><tr><td>Emostatici ultra fini (morsetto non seghettato)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13020-12</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione multifattoriale del comportamento motorio nei ratti dopo la lesione unilaterale da schiacciamento del nervo sciatico

Multifactorial Assessment of Motor Behavior in Rats after Unilateral Sciatic Nerve Crush Injury

L'induzione di una lesione nervosa periferica è un metodo ampiamente utilizzato nelle neuroscienze per la valutazione dei meccanismi di riparazione e dolore tra gli altri. Inoltre, nel campo della ricerca sui disturbi del movimento, è stata impiegata una lesione da schiacciamento sciatico per innescare un fenotipo simile alla distonia nei modelli di roditori DYT-TOR1A geneticamente predisposti di distonia. Per ottenere risultati coerenti, riproducibili e comparabili dopo una lesione da schiacciamento del nervo sciatico, è essenziale un metodo standardizzato per indurre la schiacciamento nervoso, oltre a una caratterizzazione fenotipica standardizzata. Occorre prestare attenzione non solo allo specifico assortimento di test comportamentali, ma anche ai requisiti tecnici, alla corretta esecuzione e all'analisi consecutiva dei dati. Questo protocollo descrive in dettaglio come eseguire una lesione da schiacciamento del nervo sciatico e fornisce una batteria di prova comportamentale per la valutazione dei deficit motori nei ratti che include il test sul campo aperto, l'analisi dell'andatura CatWalk XT, il compito di camminata del fascio e il compito di camminare a gradini della scala.

I risultati rappresentativi dell'OFT di cinque minuti mostrano che la lesione da schiacciamento nervoso cinque settimane dopo l'intervento chirurgico non ha alcun effetto sull'attività locomotoria (Figura 1).
L'analisi dell'andatura con il sistema CatWalk XT (Figura 2) genera molti parametri diversi. I parametri selettivi sono stati analizzati statisticamente confrontando i ratti ingenui con ratti wt feriti dai nervi cinque settimane dopo la schiacciamento nervoso (Figura 2D). Potrebbero essere rilevate alterazioni significative per la velocità media di corsa, la lunghezza del passo e l'area di stampa della zampa posteriore ferita dal nervo (destra). Un'analisi più dettagliata della zampa posteriore ferita dal nervo è stata eseguita con il modulo "Misurazioni interattive dell'impronta". Nei ratti wt feriti dai nervi è stata osservata una significativa riduzione dei parametri di diffusione, diffusione intermedia delle dita dei piedi e lunghezza della stampa rispetto ai ratti ingenui. Inoltre, l'asse del corpo dell'angolo della zampa e il vettore di movimento dell'angolo della zampa differiscono significativamente quando si confrontano i ratti wt feriti dal nervo con i ratti ingenui wt (Figura 2E).
La figura 3 presenta i dati della coordinazione motoria ottenuti attraverso la valutazione del compito di camminata del fascio. I ratti wt feriti dai nervi hanno mostrato un tempo di latenza significativamente aumentato per attraversare il fascio rispetto ai ratti ingenui cinque settimane dopo l'infortunio (Figura 3B). Come ulteriore lettura del compito di camminare con il fascio, sono stati conteggiati e considerati come un errore per l'analisi statistica gli scivolamenti completi e i semiscivoloni dell'arto posteriore ferito dal nervo. La percentuale di errori per passo dell'arto posteriore (destro) ferito dal nervo è stata significativamente aumentata nei ratti wt feriti dai nervi rispetto ai ratti ingenui.
I dati rappresentativi del compito di camminare a pioli(figura 4) non mostrano alterazioni significative nel tempo di latenza per attraversare la passerella dell'apparato a pioli (Figura 4C) o nella percentuale di errori per passo dell'arto posteriore leso dal nervo (adestra) (figura 4D). L'analisi della percentuale di errore per passo dell'arto posteriore ferito dal nervo ha considerato solo il punteggio da 0 a 2 della scala di 7 categorie da Metz et al. La distribuzione di tutte le categorie di punteggio per passo dalla scala a 7 categorie dell'arto posteriore nevralgico e dell'arto posteriore non nervino (sinistro) è illustrata nella figura 4E.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig01.jpg"> Figura 1: Valutazione dell'attività locomotoria durante la prova in campo aperto. (A) Immagine dell'impostazione del test a campo aperto. Immagine selezionata sottratta da un video registrato durante il test a campo aperto che mostra un topo nell'arena a campo aperto senza (B) e con tracciamento (C). (D) La velocità durante una registrazione di cinque minuti di prova in campo aperto è stata studiata nei ratti ingenui e nei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. I dati sono indicati come ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig02.jpg"> Figura 2: Analisi dell'andatura con il sistema CatWalk XT. (A) Immagine dell'apparato CatWalk XT. (B) Esempi della vista di stampa che mostra le impronte delle zampe etichettate in modalità falso colore ed esempi della vista di temporizzazione che mostrano il diagramma dell'andatura basato sul tempo dei ratti ingenui e dei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. (C) Esempi della classificazione delle dita dei dita dei dati che mostrano la diffusione delle dita dei piede (TS), la diffusione intermedia delle dita dei dita dei piede (ITS) e la lunghezza di stampa (PL), nonché esempi della vista dell'asse del corpo che mostra l'asse del corpo (linea bianca) e il vettore di movimento (linea rossa) dei ratti ingenui e dei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. (D) Dati di parametri selezionati della classificazione "standard" che confrontano ratti ingenui e ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. (E) Dati di parametri selezionati dal "modulo Misurazioni interattive dell'impronta" confrontando ratti ingenui e ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. I dati sono mostrati come media ± SEM. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test t non accoppiato dei dati normalmente distribuiti, il test t non accoppiato con la correzione di Welch di dati normalmente distribuiti con varianza disuguale e il test Mann-Whitney U dei dati distribuiti non normali. Il valore P &lt; 0,05 è stato definito come statisticamente significativo etichettato come *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig03.jpg"> Figura 3: Analisi dell'andatura con il compito di camminare con il fascio. (A) Disegni immagine e schematici della configurazione del compito di camminata del fascio. Il tempo di latenza per attraversare il fascio (B) e la percentuale di errori di scivolamento del piede per passo dell'arto posteriore nevralgico durante il compito di camminata del fascio (C) è stato analizzato nei ratti ingenui e nei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. Immagine rappresentativa per la posizione dell'ora di inizio (D) e la posizione dell'ora di fine (E) dell'attività di camminata del fascio. Sequenza di immagini rappresentativa di un errore di slittamento completo (F) e di un errore di mezzo slittamento (G) del compito di camminata del fascio. I dati sono mostrati come ± sem. Il valore P &lt; 0,05 è stato definito come statisticamente significativo etichettato come *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig04.jpg"> Figura 4: Analisi dell'andatura mediante il compito di camminata a pioli. Immagine (A) e disegni schematici (B) della scala che cammina nell'impostazione del compito. Il tempo di latenza di attraversamento dell'apparato del gradino a scala (C) e la percentuale di errori di scivolamento del piede per gradino dell'arto posteriore nevralgico durante il compito di camminare a gradini (D) sono stati valutati nei ratti ingenui e nei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. (E) La distribuzione percentuale della categoria di punteggio per passaggio in base alla scala delle 7 categorie da Metz et al. per l'arto posteriore sinistro e destro dei ratti ingenui wt e dei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. I dati sono mostrati come ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig05.jpg"> Figura 5: Rappresentazione esemplare di ciascuna categoria secondo la scala delle 7 categorie di Metz et al. durante il compito di camminare a gradini scala. Sequenza di immagini rappresentativa dall'arto posteriore destro della categoria 0 - miss totale, categoria 1 - scivolo profondo, categoria 2 - leggero slittamento, categoria 3 - sostituzione, categoria 4 - correzione, durante il compito di camminata a gradini della scala. Immagini rappresentative per la categoria 5 - posizionamento parziale e categoria 6 - posizionamento corretto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Forniamo un protocollo per la valutazione del comportamento motorio tramite una batteria di test comportamentale nei ratti dopo una lesione da schiacciamento del nervo sciatico.

Valutazione multifattoriale del comportamento motorio nei ratti dopo la lesione unilaterale da schiacciamento del nervo sciatico

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere le procedure coinvolte nell'esecuzione di una schiacciamento del nervo sciatico irriproducibile e fornire un protocollo per la valutazione del comportamento motorio dopo un trauma periferico. La selezione di una batteria di test comportamentale potente e affidabile è essenziale per coprire una vasta gamma di aspetti comportamentali e dipende dal modello animale utilizzato e dalla domanda di ricerca scientifica. Questo protocollo descrive in dettaglio come eseguire una lesione da schiacciamento del nervo sciatico e fornisce una batteria di prova comportamentale per la valutazione dei deficit motori nei ratti, che include il test sul campo aperto, l'analisi dell'andatura CatWalk, il compito di camminata del fascio e il compito di camminare con gradini a scala.Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida nazionali e istituzionali applicabili per la cura e l'uso degli animali. Mantenere un ambiente sterile durante l'intera procedura chirurgica. Impostare il tavolo dell'intervento chirurgico con l'attrezzatura necessaria.Anestetizza profondamente il topo in un armadio chiuso con isoflurane e rade una vasta area dell'arto posteriore destro. Quindi, posizionare il ratto nella maschera di anestesia e continuare l'anestesia profonda con isoflurane. Fissare il busto e entrambi gli arti posteriori del topo con del nastro adesivo.Posizionare entrambi gli arti posteriori in una posizione simmetrica e tesa e ruotare ogni zampa piatta sul tavolo dell'intervento chirurgico. Disinfettare la pelle dell'area rasata con un antisettico appropriato. Cerca la tacca sciatica dell'ileo.Fai un'incisione cutanea dalla tacca sciatica nella direzione della zampa con un bisturi. Se gli arti posteriori sono fissi e l'incisione cutanea viene eseguita correttamente, si può vedere una cavità nel piano fasciale tra il muscolo gluteo massimo e il muscolo bicipite femoris che assomiglia a una linea bianca. Inserire le forcep emostatiche super fini chiuse nella cavità e stendere le forcep.Il piano fasciale dovrebbe aprirsi senza ferire alcun tessuto muscolare. Posizionare i retrattini dell'elastico sotto i muscoli per mantenere aperta l'incisione cutanea. Rimuovere delicatamente qualsiasi tessuto e vasi sanguigni circostanti dal nervo sciatico fino a quando il nervo non è completamente esposto.È importante non allungare o tirare il nervo durante l'intera procedura. Schiacciare il nervo sciatico con un morsetto non seghettato con pressione utilizzabile costante e rapida. Per questo, aprire il morsetto, posizionare il nervo sulla mascella inferiore del morsetto e chiudere il morsetto bloccandolo nella prima posizione per 3 x 10 secondi.Dopo la lesione da schiacciamento, riaprire attentamente il morsetto. il sito di schiacciamento del nervo sciatico appare traslucido. Rimuovere i retrattiri dell'elastico.Chiudere l'incisione del piano fasciale con una sutura riassorbibile. Chiudere l'incisione cutanea con le graffette della pelle del corpo. L'attività locomotoria, così come l'attività comportamentale dei ratti possono essere analizzate da un test a campo aperto.La configurazione del campo aperto, che dovrebbe essere posizionata in un ambiente buio e silenzioso, è costituita dal sistema di tracciamento video automatizzato, EthoVision XT, e da un'arena con una superficie nera pulita e resistente ai graffi. Posizionare l'arena e la fotocamera nella posizione corretta e configurare il software EthoVision XT. Posizionare delicatamente il topo nel mezzo dell'arena di prova.Durante la registrazione, lo sperimentatore dovrebbe stare lontano dal campo aperto impostato, al fine di evitare di distrarre il topo. Per l'analisi dei dati del test a campo aperto, passare alla sezione analisi nella barra laterale sinistra e scegliere Visualizzazione traccia"sotto la scheda Risultati". Quindi, esportare i parametri necessari in XL.All'interno del software, scegliere una serie di variabili di diverse categorie per l'analisi dei dati.Un'analisi dell'andatura da parte del sistema CatWalk XT può aiutare a valutare molti parametri diversi riguardanti le impronte, la posizione e l'andatura dei modelli animali. Una passerella di vetro è illuminata con luce verde e la luce diffusa dalle impronte degli animali viene catturata con una videocamera ad alta velocità, che si trova sotto la passerella. I segnali possono essere analizzati con il software CatWalk XT.L'esperimento deve essere eseguito in condizioni di buio. Inizia impostando il sistema CatWalk XT. Scegliere le impostazioni sperimentali.Posizionare la fotocamera in posizione e regolare la messa a fuoco. Impostare le impostazioni di rilevamento. Impostare le pareti del corridoio del sistema CatWalk e assicurarsi che le pareti rimangano parallele alla passerella.Definire la lunghezza della passerella e calibrare la passerella. Quindi, ancora un'immagine di sfondo. Per l'immagine di sfondo è necessaria una passerella pulita e vuota.Il topo dovrebbe attraversare la passerella senza alcuna interruzione. Secondo i criteri di esecuzione definiti, sono necessarie tre esecuzioni conformi per ratto per l'analisi dei dati. Addestrare gli animali per almeno otto giorni prima di iniziare con l'esperimento vero e proprio.La passerella deve essere eseguita almeno una volta alla settimana, con da 6 a 10 esecuzioni per garantire prestazioni di attività continue. Per l'analisi dei dati, valutare solo le esecuzioni conformi. Classificare automaticamente le impronte dei pegni con il software CatWalk XT.Rivedere manualmente le etichette di stampa della zampa. Correggere le etichette di stampa errate delle zampe, aggiungere etichette di impronte di zampe non rilevate ed eliminare qualsiasi rumore ed etichetta errata. I risultati numerici visualizzati in un foglio XL, che mostrano una serie di parametri di base.Per informazioni più dettagliate su ogni impronta, classificare le dita dei piedi delle zampe posteriori. Questa analisi richiede il modulo di misurazione interattiva dell'impronta. Impostare manualmente i marcatori per l'analisi dell'impronta.Analizza ogni stampa della zampa posteriore in tutte e tre le corse conformi. Disegnare una linea dal centro del primo dito del giorno per misurare la diffusione. Disegnare una linea dal centro del secondo dito del dito del secondo al centro del quarto dito del dito per misurare lo spread intermedio delle dita dei dita dei dita dei dati.Disegnare una linea dal centro del terzo dito del piede al tallone della zampa posteriore per misurare la lunghezza di stampa manuale. Esaminare i risultati numerici delle misurazioni interattive dell'impronta visualizzate in un foglio separato. I deficit di andatura possono essere determinati dal compito di camminare con il raggio.Il compito di beam walking in questo specifico argomento di ricerca sarà l'analisi della coordinazione motoria e non la valutazione dell'equilibrio motorio. Per il compito di camminare con il fascio, sono necessari un fascio, un distanziale, un tavolo, uno sfondo uniforme e una videocamera. Usa un fascio di legno di 90 centimetri di lunghezza, 1,7 centimetri di larghezza e 2 centimetri di altezza.Addestrare gli animali per sette giorni. Posizionare il topo sulla piattaforma iniziale della trave. Il topo dovrebbe attraversare la trave tre volte senza alcuna interruzione.Anche se il ratto raggiunge tre corse conformi entro le prime tre esecuzioni, è necessario effettuare almeno 6-10 esecuzioni per prestazioni continue delle attività. Selezionare le sequenze video di tre esecuzioni conformi dalla registrazione. Definire il punto di ora di inizio e il punto di fine delle tre esecuzioni conformi selezionate.Qui, il punto di ora di inizio è etichettato da una linea nera sulla trave, e il posizionamento del primo arto posteriore dietro la linea nera è definito come il punto di inizio della corsa. Il posizionamento del primo arto posteriore sulla piattaforma alla fine della trave definisce il punto di fine del tempo. Quindi, calcola il tempo necessario affinché il topo attraversi il fascio.Ottieni il numero di passaggi ed errori da tre esecuzioni conformi per entrambi gli arti posteriori separatamente, utilizzando la funzione zoom e slow motion del software. Gli errori includono scivolamenti totali del piede e scivolamenti di mezzo piede. Uno slittamento totale del piede è definito come un posizionamento del piede seguito da uno slittamento profondo, causando una perdita di contatto della zampa interessata con la trave.Un mezzo scivolo è definito come la zampa che scivola dalla parete laterale della trave senza perdere il contatto completo. Calcolare la percentuale di scivolamenti del piede in relazione al numero di passaggi per attraversare la trave. Il compito di camminare in scala può valutare la funzione motoria, il posizionamento sia degli arti anteriori che degli arti posteriori e la coordinazione tra gli arti.Per questo test comportamentale sono necessari un apparato a pioli, un distanziale, un tavolo, uno sfondo uniforme e una videocamera. L'apparato orizzontale a gradini a lettere è costituito da gradini metallici e pareti laterali in policarbonato chiaro. Addestrare gli animali per otto giorni.Posizionare il topo nella zona iniziale degli operatori del gradino della scala. Il topo deve attraversare la passerella di 100 centimetri dell'apparato a pioli tre volte senza interruzione, per qualificarsi come una corsa conforme. Selezionare le sequenze video di tre esecuzioni conformi dalla registrazione.Definire il punto di ora di inizio e il punto di fine delle tre esecuzioni conformi selezionate. Il posizionamento dell'arto posteriore dietro la prima linea nera sulla parete laterale dell'apparato definisce il punto di inizio della corsa. Il posizionamento del primo arto anteriore dietro la seconda linea nera sulla parete laterale dell'apparato definisce il punto di fine della corsa.Quindi, calcola la durata della corsa attraverso la passerella. Ottieni il punteggio delle tre esecuzioni conformi con la scala delle 7 categorie di Mets e colleghi utilizzando il rallentatore o la funzione frame-by-frame del software. Determinare separatamente il numero di passaggi e il numero di errori in base alle categorie della scala per ogni arto.La scala distingue tra le seguenti categorie. Totale mancanza. Scivolo profondo.Leggero scivolone. Replacement.Correction. Posizionamento parziale. E il posizionamento corretto.Quindi, calcolare gli errori per passaggio. I risultati rappresentativi del test a campo aperto di cinque minuti mostrano che la lesione da schiacciamento nervoso, cinque settimane dopo l'intervento chirurgico, non ha alcun effetto sull'attività locomotoria. L'analisi dell'andatura con il sistema CatWalk XT genera molti parametri diversi.Potrebbero essere rilevate alterazioni significative per la velocità media di corsa, la lunghezza del passo e l'area di stampa della zampa posteriore destra ferita dal nervo. I ratti selvatici feriti dai nervi hanno mostrato un tempo di latenza significativamente aumentato per attraversare il fascio, rispetto ai ratti ingenui di tipo selvaggio cinque settimane dopo la lesione. Come ulteriore lettura del compito di camminare con il fascio, sono stati conteggiati e considerati come un errore per l'analisi statistica gli scivolamenti completi e i semiscivolti dell'arto posteriore ferito dal nervo.La percentuale di errori per passo dell'arto posteriore destro ferito dal nervo è stata significativamente aumentata nei ratti di tipo selvatico feriti dai nervi, rispetto ai ratti ingenui di tipo selvatico. I dati rappresentativi del compito di camminata a gradini della scala non mostrano alterazioni significative nel tempo di latenza per attraversare la passerella dell'apparato a pioli o nella percentuale di errori per passo dell'arto posteriore destro ferito dal nervo. L'analisi della percentuale di errore per passo dell'arto posteriore nevralgico ha considerato solo il punteggio da 0 a 2 della scala delle 7 categorie da Mets e colleghi.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una lesione da schiacciamento del nervo sciatico e come implementare una valutazione multifattoriale del comportamento motorio nei ratti dopo la schiacciamento unilaterale del nervo sciatico. Per ottenere risultati coerenti, riproducibili e comparabili dopo una lesione da schiacciamento del nervo sciatico, è essenziale un metodo standardizzato per indurre la schiacciata nervosa, nonché una caratterizzazione fenotipica standardizzata. Una formazione adeguata per un test di comportamento specifico offre i vantaggi di risparmiare tempo durante la valutazione dell'esperimento e ottenere risultati migliori.

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In questo rapporto si descrive un metodo per schiacciare nervo sciatico mouse. Questo metodo utilizza pinze emostatiche immediatamente disponibili e facilmente riproducibile e produce completo schiacciamento del nervo sciatico. Inoltre, si descrive un metodo per preparare supporti muscolo intero adatti per l'analisi di rigenerazione nervosa dopo schiacciamento del nervo sciatico.

Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

Fonte: Li, Q., et al. Indagine sulla rigenerazione degli assoni dei mammiferi: elettroporazione in vivo del ganglio della radice dorsale del topo adulto. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra il processo di rigenerazione assonale in un nervo sciatico di topo a seguito di una lesione da schiacciamento. Il nervo isolato viene fissato e preparato per l'imaging, con proteine fluorescenti espresse nei neuroni per visualizzare la crescita degli assoni. Utilizzando un microscopio a epifluorescenza,...

Rigenerazione assonale nel nervo sciatico di un topo a seguito di una lesione da schiacciamento

Tre nuovi test comportamentali (forelimb passo alternanza, test di instabilità posturale, test di manipolazione pasta) per la valutazione della funzione degli arti anteriori dopo la lesione del midollo spinale cervicale nei roditori sono descritti.

Valutare forelimb Funzione dopo unilaterale cervicale SCI utilizzando Compiti Novel: Arto Step-alternanza, instabilità posturale e Pasta Handling

Il tratto corticospinale, una delle principali vie sensomotori, può essere lesionato unilateralmente nel tronco cerebrale roditori per testare terapie neuroplasticità induzione per il sistema nervoso centrale. Questa procedura chirurgica ("pyramidotomy") e valutazioni postoperatorie sono descritti in questo protocollo.

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Qui descriviamo le procedure chirurgiche per produrre un'emisezione laterale del midollo spinale affidabile (HX) al 9esimo livello toracico nei ratti adulti e valutazioni neurocomportamentali progettate per rilevare deficit asimmetrici dopo tale lesione unilaterale.

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L'emisezione spinale toracica del ratto è un modello prezioso e riproducibile di lesioni unilaterali del midollo spinale per studiare i meccanismi neurali del recupero locomotorio e l'efficacia del trattamento. Questo articolo include una guida dettagliata passo-passo per eseguire la procedura di emisezione e per valutare le prestazioni locomotorie in un'arena a campo aperto.

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Introduciamo un metodo di analisi cinetica che utilizza un apparato di motion capture tridimensionale contenente quattro telecamere e software di elaborazione dati per eseguire valutazioni funzionali durante la ricerca fondamentale che coinvolge modelli di roditori.

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L'analisi automatizzata dell'andatura è uno strumento fattibile per valutare il recupero funzionale nei modelli di roditori di lesioni nervose periferiche e lesioni da contusione del midollo spinale. Mentre richiede una sola configurazione per valutare la funzione locomotoria in vari modelli sperimentali, è molto importante una meticolosa regolazione e formazione di prodotti duri e morbidi degli animali.

Analisi automatizzata dell'andatura per valutare il recupero funzionale nei roditori con lesione da contusione del nervo periferico o del midollo spinale

La valutazione del recupero motorio rimane la misura di risultato di riferimento negli studi sperimentali sui nervi periferici. La misurazione della forza tetanica isometrica del muscolo tibiale anteriore nel ratto è uno strumento inestimabile per valutare gli esiti funzionali dopo la ricostruzione dei difetti nervosi sciatici. I metodi e le sfumature sono dettagliati in questo articolo.

Misurazione massima della forza tetanica isometrica del muscolo anteriore tibiale nel ratto

Viene fornita una pipeline sperimentale per descrivere quantitativamente il modello locomotore dei topi che camminano liberamente utilizzando il toolbox MouseWalker (MW), che va dalle registrazioni video iniziali e dal tracciamento all'analisi post-quantificazione. Un modello di lesione da contusione del midollo spinale nei topi viene impiegato per dimostrare l'utilità del sistema MW.

Utilizzo di MouseWalker per quantificare la disfunzione locomotoria in un modello murino di lesione del midollo spinale

Impara a valutare il comportamento motorio nei ratti dopo lesione del nervo sciatico utilizzando test comportamentali standardizzati. Questo metodo permette di analizzare deficit motori e coordinazione.

Valutazione multifattoriale del comportamento motorio nei ratti dopo la lesione unilaterale da schiacciamento del nervo sciatico (Video) | JoVE Journal

Valutazione multifattoriale del comportamento motorio nei ratti dopo la lesione unilaterale da schiacciamento del nervo sciatico

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