Visualizzazione e quantificazione della segnalazione TGFβ/BMP/SMAD in diverse condizioni di sforzo di taglio del fluido utilizzando il test di prossimità-legatura

Questo protocollo consente agli scienziati di confrontare quantitativamente il numero di complessi di fattori di trascrizione in diverse condizioni di stress da taglio e sarà utile per la ricerca in biologia vascolare. Il vantaggio principale di questo protocollo è l'utilizzo di canali di flusso microfluidici che consentono indagini su più coppie di anticorpi, compresi i rispettivi controlli contemporaneamente. Per iniziare, rivestire il vetrino a sei canali aggiungendo lo 0,1% di gelatina per pelli suine preparata in PBS nei canali per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Svuotare i canali dalla soluzione di gelatina e seminare Huvecs nei vetrini a sei canali precodificati ad una densità di 2,5 volte 10 alla sesta cella per millilitro in 30 microlitri di M199 mezzo completo. Lasciare che le cellule aderiscano per un'ora a 37 gradi Celsius nell'incubatore umidificato. Aggiungere 60 microlitri di mezzo completo M199 pre-avvertito a ciascuno dei serbatoi.

Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius per due giorni in un incubatore umidificato con sostituzione media dopo 24 ore. Montare il tubo di silicio sulle unità fluidiche, riempire i serbatoi con un minimo di 10 millilitri di mezzo completo M199 pre-avvertito. Collegare le unità fluidiche con tubo al sistema di pompaggio ed eseguire il pre-run senza celle per equilibrare il mezzo e rimuovere l'aria rimanente.

Collegare i singoli canali sulla slitta a sei canali utilizzando il tubo di connessione seriale. Collegare il primo e l'ultimo canale della slitta ai tubi montati sull'unità fluidica. Per l'esposizione delle cellule ad alti livelli di puro stress, aumentare lo stress puro passo saggio con fasi di adattamento, impostando i passaggi in incrementi di cinque dini per centimetro quadrato per 30 minuti.

Utilizzare i ciuffi sul tubo per staccare i vetrini dalle pompe dopo l'esposizione allo stress di taglio del fluido, evitando fuoriuscite medie nell'incubatore e trasferire i vetrini di flusso sul ghiaccio. Mentre si stacca il tubo dai serbatoi, utilizzare il dito per chiudere l'altro lato del serbatoio per evitare di intrappolare le bolle d'aria nel canale. Mantenendo lo scorrimento del flusso sul ghiaccio, aspirare accuratamente il mezzo dai serbatoi ma non dal canale in cui risiedono le cellule.

Lavare i campioni con 90 microlitri di PBS sterile freddo aggiungendo PBS a un serbatoio e aspirare attentamente dall'altro serbatoio, quindi ripetere per tutti i canali. Fissare le celle aggiungendo 90 microlitri di soluzione tamponata al 4% di PFA allo stesso serbatoio in cui è stato aggiunto il PBS e aspirare il liquido dall'altro serbatoio come dimostrato. Dopo aver fissato le cellule in tutti e sei i canali, trasferire i campioni dal ghiaccio alla temperatura ambiente e incubare per 20 minuti.

Lavare le celle tre volte con PBS aggiungendo PBS ad un serbatoio e aspirandolo accuratamente dall'altro serbatoio in tutti i canali, avendo cura di non asciugare i canali. Estinguere l'accesso al PFA aggiungendo 90 microlitri di cloruro di ammonio ambientale da 15 millimolari preparato in PBS a uno dei serbatoi. Aspirare dall'altro serbatoio e incubare le cellule per 10 minuti.

Permeabilizzare le celle aggiungendo 90 microlitri dello 0,3% di Triton X 100 preparati in PBS nel serbatoio vuoto. Aspirare dall'altro serbatoio per ciascun canale e incubare per 10 minuti, quindi lavare tre volte con PBS come dimostrato in precedenza. A 90 microlitri di soluzione di blocco pla sterile a un serbatoio.

Aspirare dall'altro lato per ogni canale e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius in una camera umidificata. Aggiungere anticorpi primari nel diluente anticorpale PLA e nel vortice. Aspirare accuratamente la soluzione di blocco dai serbatoi e dai canali.

Aggiungere 30 microlitri della soluzione anticorpale primaria immediatamente nel canale vuoto inclinando il vetrino mentre si aggiunge la soluzione. Ripetere per tutti i canali e incubare a quattro gradi Celsius nella camera umidificata durante la notte o a 37 gradi Celsius per un'ora. Diluire meno coniglio e più sonda PLA di topo da uno a cinque nel diluente anticorpale PLA.

Lavare tutti i canali due volte aggiungendo 90 microlitri di tampone di lavaggio A e aspirando come dimostrato. Dopo aver aspirato il tampone di lavaggio, aggiungere 30 microlitri di soluzione di sonda PLA e incubare nella camera umidificata. Diluire il tampone di legatura da uno a cinque in acqua ionizzata D e diluire l'enzima ligo da uno a 40 nel tampone di legatura diluito.

Dopo aver lavato e aspirato completamente il tampone di lavaggio A, aggiungere 30 microlitri di soluzione di legatura ai canali vuoti mentre si inclina il vetrino e incubare nella camera umidificata. Diluire il tampone di amplificazione da uno a cinque in acqua deionizzata, quindi diluire l'enzima polimerasi da uno a 80 nel tampone di amplificazione diluito sul ghiaccio. Dopo aver lavato e aspirato completamente il tampone di lavaggio A, aggiungere 30 microlitri di soluzione di amplificazione ai canali vuoti mentre si inclina il vetrino e incubarlo nella camera umidificata.

Diluire il DAPI uno a 500 nel tampone di lavaggio B e lavare tutti i canali una volta aggiungendo 90 microlitri di DAPI contenenti tampone di lavaggio B e aspirando come dimostrato per vaporizzare i nuclei. Quindi lavare tutti i canali una volta con il tampone di lavaggio B senza DAPI. Diluire il tampone di lavaggio B da uno a 10 in acqua deionizzata e lavare tutti i canali una volta con 90 microlitri di tampone di lavaggio diluito B.Dopo aver aspirato il tampone di lavaggio B, aggiungere immediatamente da due a tre gocce del mezzo di montaggio del liquido in un serbatoio e inclinare la slitta per distribuire il mezzo di montaggio in tutti i canali.

Conservare i campioni a quattro gradi Celsius in un ambiente umidificato fino all'imaging. Gli Huvecs sono stati esposti ad alto e basso stress puro. Il basso stress da taglio ha aumentato le interazioni della proteina SMAD nel citosol e nei nuclei.

I controlli a singolo anticorpo non hanno mostrato pochissimi segnali, dimostrando il successo dell'esperimento. L'aumento della concentrazione di anticorpi ha comportato un numero maggiore di eventi PLA per cellula, ma la differenza nei segnali PLA tra cellule esposte a stress puro alto e basso è stata ridotta. I tamponi autoprodotti per il blocco e la diluizione degli anticorpi possono essere utilizzati come alternativa ai tamponi commerciali.

La quantificazione degli eventi pla per soluzioni diluenti e bloccanti commerciali e autoprodotte ha mostrato lo stesso modello di segnali PLA nelle aree citosoliche e nucleari. Tuttavia, il numero totale di eventi PLA per cella era più alto con le soluzioni commerciali. Una combinazione di anticorpi SMAD Two/Three, SMAD Four è stata utilizzata laddove l'anticorpo SMAD Four non era adatto per esperimenti di immunofluorescenza.

Non c'è stata alcuna differenza negli eventi pla nella condizione sperimentale rispetto a quella di controllo, indicando l'importanza di selezionare la corretta combinazione di anticorpi per rilevare gli eventi PLA. Il protocollo descritto può essere adattato per rilevare le interazioni di complessi di fattori di trascrizione diversi dagli SED e quindi aiutare a comprendere la regolazione genica in condizioni di athero prone e athero protettive.