Name: Visualizzazione e quantificazione della segnalazione TGFβ/BMP/SMAD in diverse condizioni di sforzo di taglio del fluido utilizzando il test di prossimità-legatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Scopri come visualizzare e quantificare i complessi SMAD nelle cellule endoteliali sotto diverse condizioni di sforzo di taglio usando il test di prossimità-legatura. Questo metodo avanzato facilita lo studio della biologia vascolare.

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Ringraziamo la dott.ssa Maria Reichenbach e il dott. Christian Hiepen per il loro supporto sul sistema di impostazione del flusso e Eleanor Fox e Yunyun Xiao per aver letto criticamente il manoscritto. P-L.M. è stato finanziato dalla Scuola di Ricerca internazionale Max Planck IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK ha ricevuto finanziamenti dal DFG-SFB1444. La Figura 1 è stata creata utilizzando BioRender.

1. Coltura cellulare ed esposizione allo stress da taglio dei fluidi
NOTA: le EC delle vene ombelicali umane (HUVEC) sono state utilizzate come esempio per studiare l'interazione indotta da SS di SMED. Il protocollo descritto di seguito può essere applicato a ogni tipo di cella reattiva SS.
<ol><li>Rivestire il vetrino a 6 canali con gelatina cutanea suina allo 0,1% in PBS per 30 minuti a 37 °C.</li>
	<li>HUVEC di semi in vetrini preverniciati a 6 canali ad una densità di 2,5 x 106 celle per mL in 30 μL di M199 full medium. NOTA: per ulteriori informazioni su come eseguire il seeding delle celle nella diapositiva di flusso, vedere reference24.</li>
	<li>Lasciare che le cellule aderiscano per 1 ora a 37 °C in un incubatore umidificato.</li>
	<li>Aggiungere 60 μL di M199 full medium preriscaldato a ciascuno dei serbatoi.</li>
	<li>Coltura per 2 giorni, con un delicato scambio medio una volta al giorno, a 37 °C in un incubatore umidificato.<ol>
<li>Aspirare completamente i serbatoi, aggiungere 120 μL di mezzo completo M199 preriscaldato in uno dei serbatoi e aspirare dall'altro lato.</li>
		<li>Aggiungere 60 μL di M199 full medium preriscaldato a entrambi i serbatoi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assemblate e avviate la configurazione del flusso come descritto nel riferimento25.<ol>
<li>Montare tubi su unità fluidiche. Qui, i tubi in silicone con un diametro di 0,8 mm e 1,6 mm vengono utilizzati per applicare sollecitazioni di taglio rispettivamente di 1 dyn / cm2 e 30 dyn / cm2. NOTA: il materiale e la lunghezza del tubo devono rimanere costanti, poiché le modifiche potrebbero influenzare la tensione di taglio risultante. In generale, è possibile utilizzare altre combinazioni di sistemi di pompaggio e tubi, purché lo stress di taglio risultante sia noto e la pompa crei un flusso laminare costante.</li>
		<li>Riempire i serbatoi con una quantità appropriata di M199 full medium preriscaldato (minimo 10 ml).</li>
		<li>Collegare le unità fluidiche con il tubo al sistema di pompaggio ed eseguire una pre-corsa senza celle per equilibrare il mezzo e rimuovere l'eventuale aria rimanente25.</li>
		<li>Collegare in serie i singoli canali sulla diapositiva a 6 canali l'uno all'altro utilizzando tubi di connessione seriale. Il primo e l'ultimo canale della slitta saranno collegati al tubo assemblato in 1.6.1 (vedere la Figura 1A per uno schema). Fare attenzione a non introdurre aria nel sistema in quanto ciò potrebbe danneggiare gravemente le cellule. Ulteriori informazioni sulla connessione seriale sono disponibili in reference26.</li>
		<li>Per l'esposizione delle cellule ad alti livelli di sforzo di taglio (>20 dyn/cm2), utilizzare una fase di rampa, ovvero aumentare lo sforzo di taglio gradualmente con fasi di adattamento. I passi possono essere impostati con incrementi di 5 dyn/cm2 per 30 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fissazione
<ol><li>Staccare le diapositive dalle pompe dopo l'esposizione al fluido SS. Utilizzare morsetti sul tubo durante il distacco, per evitare la fuoriuscita media nell'incubatore.</li>
	<li>Il flusso di trasferimento istantaneo scorre sul ghiaccio, mentre il tubo rimanente viene staccato sequenzialmente. Quando si rimuove il tubo dai serbatoi, il serbatoio sull'altro lato deve essere tenuto chiuso con un dito per evitare di intrappolare bolle d'aria nel canale. Ciò potrebbe interferire con i passaggi di fissazione.</li>
	<li>Mantenendo le cellule sul ghiaccio, aspirare accuratamente il mezzo dai serbatoi ma non dal canale in cui risiedono le cellule. Successivamente, lavare i campioni con PBS sterile freddo (4 °C) con tre volte il volume del canale (90 μL). Aggiungere PBS in un serbatoio e aspirare con attenzione dall'altro serbatoio. Ripetere questo passaggio in ciascuno dei 6 canali per diapositiva. NOTA: Per tutte le fasi di lavaggio e incubazione la rispettiva soluzione viene aggiunta in uno dei serbatoi che porta ad uno scambio di soluzioni nel canale. Per consentire la sostituzione completa delle soluzioni nel canale, la soluzione in eccesso viene quindi aspirata dall'altro serbatoio. La soluzione sulla parte superiore delle celle nel canale non viene rimossa. Le cellule non dovrebbero asciugarsi in nessun momento. Pertanto, è importante lavare accuratamente senza alcun inserimento di bolle d'aria nelle diapositive.</li>
	<li>Fissare le celle aggiungendo 90 μL di soluzione tamponata al 4% di PFA nello stesso serbatoio in cui è stato aggiunto il PBS in anticipo e allo stesso modo aspirare il liquido dall'altro serbatoio. Ripetere questo passaggio in ogni canale di ogni diapositiva. Dopo l'aggiunta della soluzione di PFA, trasferire i campioni dal ghiaccio alla temperatura ambiente (RT) e incubare per 20 minuti. ATTENZIONE: il PFA è tossico e deve essere maneggiato con attenzione. Usa i guanti e lavora sotto un cappuccio di fumo.</li>
	<li>Lavare le celle 3x con PBS (RT) aggiungendolo in un serbatoio e aspirando con attenzione dall'altro serbatoio. Svuotare solo i serbatoi, assicurandosi di non asciugare il canale. Ripetere questo passaggio per ciascuno dei 6 canali per diapositiva.</li>
	<li>Estinguere la fissazione del PFA aggiungendo 90 μL di cloruro di ammonio ambiente da 50 mM in PBS in uno dei serbatoi. Aspirare la soluzione in eccesso dall'altro serbatoio. Ripetere l'operazione per ogni canale della diapositiva. Incubare i campioni per 10 minuti a RT.</li>
	<li>Lavare come descritto nel passaggio 2.5. NOTA: A questo punto, i campioni possono essere conservati a 4 °C durante la notte, oppure il protocollo può essere immediatamente continuato con il blocco e l'incubazione di anticorpi primari (vedere fase 3).</li>
</ol>3. Blocco e incubazione di anticorpi primari
<ol><li>Per permeabilizzare le celle, aggiungere 90 μL di Triton-X-100 allo 0,3% in PBS in un serbatoio svuotato e aspirare dall'altro serbatoio per ciascun canale. Incubare per 10 minuti a RT.</li>
	<li>Lavare come descritto nel passaggio 2.5.</li>
	<li>Aggiungere 90 μL di soluzione bloccante pla sterile in un serbatoio di un canale e aspirare dall'altro lato. Ripetere questo passaggio per ogni canale. Blocco per 1 ora a 37 °C in camera umidificata.<ol>
<li>Per realizzare una camera umidificata, utilizzare un piatto di 10 cm con tessuto bagnato sigillato con pellicola di cera e posizionare il piatto nell'incubatrice. In alternativa, è possibile utilizzare altri formati di camera di umidità che forniscono un'atmosfera umida. NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare una soluzione di blocco autoprodotta (ad esempio, 3% (p / v) BSA in PBS, filtrato sterile).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare gli anticorpi primari (1:100) nel diluente anticorpale PLA. Preparare 30 μL della soluzione per canale. Aggiungere entrambi gli anticorpi primari contemporaneamente e vortice. NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un diluente anticorpale autoprodotto (ad esempio, 1% (p/v) BSA in PBS). Gli anticorpi utilizzati qui sono combinazioni di SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 e fosfo-SMAD1/5-SMAD4. Informazioni dettagliate sono disponibili nella Tabella dei materiali.</li>
	<li>Prima dell'applicazione di anticorpi primari, aspirare la soluzione bloccante dai serbatoi e, anche, con attenzione dal canale. Pipettare 30 μL della soluzione anticorpale primaria immediatamente nel canale vuoto inclinando il canale mentre si aggiunge la soluzione. NOTA: Eseguire la rimozione della soluzione bloccante e l'aggiunta della soluzione anticorpale canale per canale per garantire che le cellule non si secchino nel mezzo.</li>
	<li>Incubare campioni con gli anticorpi primari durante la notte in camere umidificate a 4 °C. NOTA: L'incubazione può essere eseguita anche per 1 ora a temperatura ambiente, se interessati a continuare con i seguenti passaggi nello stesso giorno.</li>
</ol>4. Incubazione della sonda PLA
NOTA: per tutte le fasi di cui al punto 4.1-7.3, i tamponi di lavaggio A e B sono conservati a 4 °C e devono essere riscaldati a RT prima dell'uso.
<ol><li>Diluire le sonde PLA (+)-mouse e (-)-coniglio a 1:5 in soluzione di diluente anticorpale PLA (o BSA all'1%). Preparare 30 μL per canale.</li>
	<li>Lavare i campioni 2 volte per 5 minuti utilizzando 90 μL del tampone di lavaggio A a RT aggiungendolo in uno dei serbatoi e aspirando attentamente dall'altro serbatoio. Ripetere questo passaggio per ciascuno dei 6 canali per diapositiva.</li>
	<li>Aspirare accuratamente il tampone di lavaggio A e aggiungere 30 μL di soluzione di sonda PLA (preparata nella fase 4.1), simile all'aggiunta di anticorpi primari nella fase 3.5.</li>
	<li>Incubare i campioni per 1 ora a 37 °C in una camera umidificata.</li>
</ol>5. Legatura
<ol><li>Lavare i campioni 2 volte per 5 minuti utilizzando 90 μL del tampone di lavaggio A a RT, come descritto al punto 4.2.</li>
	<li>Preparare una diluizione 1:5 del tampone di legatura in acqua deionizzata. Utilizzare questo tampone per diluire l'enzima ligasi a 1:40 (su ghiaccio). Utilizzare 30 μL per canale.</li>
	<li>Aspirare completamente il tampone di lavaggio A e aggiungere la soluzione di legatura come descritto al punto 3.5.</li>
	<li>Incubare i campioni per 30 minuti a 37 °C in una camera umidificata.</li>
</ol>6. Amplificazione
<ol><li>Lavare i campioni 2 volte per 2 minuti utilizzando 90 μL di tampone di lavaggio A a RT, come descritto al punto 4.2.</li>
	<li>Preparare il tampone di amplificazione diluendolo 1:5 in acqua deionizzata e utilizzarlo per diluire l'enzima polimerasi a 1:80 (su ghiaccio). Proteggere dalla luce. Preparare 30 μL per canale.</li>
	<li>Aspirare completamente il tampone di lavaggio A e aggiungere immediatamente la soluzione di amplificazione preparata nel canale vuoto, come descritto al punto 3.5. Incubare i campioni per 100 minuti a 37 °C in una camera umidificata.</li>
</ol>7. Montaggio
<ol><li>Lavare i campioni 2 volte per 10 minuti utilizzando 90 μL di wash buffer B a RT come descritto al punto 4.2. Aggiungere DAPI (1:500) da 1 mg/mL di soluzione madre (in acqua deionizzata) al primo lavaggio per colorare i nuclei. Non asciugare il canale.</li>
	<li>Diluire il tampone di lavaggio B in acqua deionizzata (1:10) e lavare 1x con 90 μL di soluzione tampone B 0,1x come descritto al punto 4.2.</li>
	<li>Aspirare completamente il tampone di lavaggio B e aggiungere immediatamente 2-3 gocce del mezzo di montaggio del liquido in un serbatoio. Distribuiscilo nel canale inclinando la diapositiva. Conservare i campioni a 4 °C in un ambiente umidificato fino all'imaging.</li>
</ol>8. Acquisizione di immagini
<ol><li>Acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza. Assicurarsi che i rispettivi filtri che si adattano alle sonde fluorescenti pla siano disponibili. NOTA: È utile utilizzare un microscopio confocale, se possibile, poiché le macchie di PLA ottenute sono più definite. Ciò supporta anche un'ulteriore elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.</li>
</ol>9. Analisi e quantificazione delle immagini utilizzando ImageJ/FIJI
<ol><li>Elaborare le immagini esportate (.tiff) con un programma di elaborazione delle immagini, ad esempio ImageJ27. NOTA: tutti gli script utilizzati in questo studio e necessari per il conteggio automatico di eventi cellulari, nucleari e tutti gli eventi PLA (per cella) sono disponibili in un repository GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Eseguire analisi statistiche utilizzando qualsiasi programma o strumento adatto.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Il protocollo basato sul PLA qui descritto offre un modo efficiente per determinare la stretta vicinanza di due proteine (ad esempio, la loro interazione diretta) nelle CE esposte allo stress di taglio con risoluzione quantitativa e spaziale. Utilizzando diapositive di flusso con più canali paralleli, diverse interazioni proteiche possono essere esaminate contemporaneamente in cellule in condizioni meccaniche identiche. Al contrario, i sistemi di camere di flusso costruiti su misura spesso utilizzano un singolo canale co...

Le proteine della superfamiglia dei fattori di crescita trasformanti beta (TGFβ) sono citochine pleiotropiche con una varietà di membri, tra cui TGFβs, proteine morfogenetiche ossee (BMP) e Activins1,2. Il legame del ligando induce la formazione di oligomeri recettoriali che portano alla fosforilazione e, quindi, all'attivazione dello SMAD citosolico regolatorio (R-SMAD). A seconda della sottofamiglia di ligandi, vengono attivati diversi R-SED1,2. Mentre TGFβs e Activins inducono principalmente fosforilazione di SMAD2/3, BMP inducono fosforilazione SMAD1/5/8. Tuttavia, ci sono prove crescenti che BMP e TGFβs / Activins attivano anche R-SMAD della rispettiva altra sottofamiglia, in un processo definito come "segnalazione laterale" 3,4,5,6,7,8 e che esistono complessi SMAD misti costituiti da entrambi, SMAD1/5 e SMAD2/3, members3,9 . Due R-SMAD attivati formano successivamente complessi trimerici con il mediatore comune SMAD4. Questi complessi di fattori di trascrizione sono quindi in grado di traslocare nel nucleo e regolare la trascrizione dei geni bersaglio. Gli SED possono interagire con una varietà di diversi co-attivatori e co-repressori trascrizionali, portando alla diversificazione delle possibilità di regolare i geni bersaglio10. La deregolamentazione della segnalazione SMAD ha gravi implicazioni in una varietà di malattie. In linea con questo, la segnalazione Squilibrata di TGFβ/BMP può portare a gravi patologie vascolari, come ipertensione dell'arteria polmonare, teleangectasia emorragica ereditaria o aterosclerosi3,11,12,13,14.
Le cellule endoteliali (CE) formano lo strato più interno dei vasi sanguigni e sono, quindi, esposte allo stress da taglio (SS), una forza di attrito esercitata dal flusso viscoso del sangue. È interessante notare che le CE che risiedono nelle parti della vascolarizzazione, che sono esposte ad alti livelli di SS uniforme e laminare, sono mantenute in uno stato omeostatico e quiescente. Al contrario, le CE che sperimentano SS basse e non uniformi, ad esempio a biforcazioni o la minore curvatura dell'arco aortico, sono proliferative e attivano le vie infiammatorie15. A loro volta, i siti di EC disfunzionali sono inclini a sviluppare aterosclerosi. È interessante notare che gli EC in queste aree di ateropatrone mostrano livelli aberrantemente elevati di SMAD2/3 e SMAD1/516,17,18 attivati. In questo contesto, la segnalazione TGFβ/BMP potenziata è risultata essere un evento precoce nello sviluppo di lesioni aterosclerotiche19 e l'interferenza con la segnalazione BMP è risultata ridurre notevolmente l'infiammazione vascolare, la formazione di ateroma e la calcificazione associata20.
Proximity Ligation Assay (PLA) è una tecnica biochimica per studiare le interazioni proteina-proteina in situ21,22. Si basa sulla specificità di anticorpi di diverse specie che possono legare proteine bersaglio di interesse, consentendo il rilevamento altamente specifico di interazioni proteiche endogene a livello di singola cellula. Qui, gli anticorpi primari devono legarsi al loro epitopo bersaglio a una distanza inferiore a 40 nm per consentire il rilevamento23. Pertanto, il PLA è molto utile rispetto ai tradizionali approcci di co-immunoprecipitazione, in cui sono necessari diversi milioni di cellule per rilevare le interazioni proteiche endogene. Nel PLA, gli anticorpi secondari specie-specifici, legati covalentemente ai frammenti di DNA (chiamati sonde Plus e Minus), legano gli anticorpi primari e se le proteine di interesse interagiscono, le sonde Plus e Minus si avvicinano. Il DNA viene legato nella fase successiva e l'amplificazione del cerchio rotolante del DNA circolare è resa possibile. Durante l'amplificazione, oligonucleotidi complementari marcati fluorescenti si legano al DNA sintetizzato, consentendo a queste interazioni proteiche di essere visualizzate mediante microscopia a fluorescenza convenzionale.
Il protocollo qui descritto consente agli scienziati di confrontare quantitativamente il numero di complessi di trascrizione SMAD attivi in condizioni ateroprotettive e ateroprotroniche SS in vitro utilizzando PLA. SS è generato tramite un sistema di pompe pneumatiche programmabili che è in grado di generare flusso unidirezionale laminare di livelli definiti e consente aumenti graduali delle portate. Questo metodo consente il rilevamento di interazioni tra SMAD1/5 o SMAD2/3 con SMAD4, nonché complessi misti-R-SMAD. Può essere facilmente espanso per analizzare le interazioni degli SMAD con i co-regolatori trascrizionali o con complessi di fattori di trascrizione diversi dagli SMAD. La Figura 1 mostra i passaggi principali del protocollo presentati di seguito.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo descritto. (A) Le celle seminate in vetrini a 6 canali sono esposte a sollecitazioni di taglio con un sistema di pompe pneumatiche. (B) Le celle fisse sono utilizzate per esperimenti PLA o per condizioni di controllo. (C) Le immagini degli esperimenti PLA vengono acquisite con un microscopio a fluorescenza e vengono analizzate utilizzando il software di analisi ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>&micro;-Vetrino VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>Vetrino a 6 canali</td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Carl Roth</td><td>K298.1</td><td>Estinzione Albumina</td></tr><tr><td>sierica bovina</td><td>Carl Roth</td><td>8076.4</td><td>Blocco</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>D9542</td><td>Colorazione DNA/Nuclei</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Duolink In Reagenti per la rilevazione in situ Kit PLA Green</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92014</td><td>contenente ligasi, tampone di legatura, polimerasi e tampone di amplificazione (con oligonucleotidi marcati in verde)</td></tr><tr><td>Sonda PLA in situ Duolink Sonda MINUS anti-topo</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92004</td><td>MINUS</td></tr><tr><td>Sonda PLA in situ Duolink Sonda</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-coniglio PLUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92002 PLUSDuolink Tamponi di lavaggio in situ, fluorescenza</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO82049</td><td>tamponi di lavaggio PLA A e B</td></tr><tr><td>Integratore per la crescita delle cellule endoteliali Integratore</td><td>Corning</td><td></td><td>per terreno (ECGS)</td></tr><tr><td>Vitello fetale Integratore di siero</td><td></td><td></td><td>per terreno FIJI</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Software di analisi delle immagini</td>Soluzione</tr><tr><td>di formaldeide tamponato al 4%</td><td>KLINIPATH/VWR</td><td>VWRK4186. BO1</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Mezzo</td><td></td><td></td> pieno <td>M199 medio basale +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&nbsp; 25 &; g/mL Hep +&nbsp; &nbsp; 50 &micro; g/mL ECGS</td></tr><tr><td>Gelatina da pelle suina, Tipo A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>Utilizzare lo 0,1% in PBS per il rivestimento dei canali di flusso</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.7</td><td>GarphPad</td><td></td><td>Programma statistico utilizzato per i grafici e i calcoli statistici</td></tr><tr><td>Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>integratore per medium (Hep)</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ibidi Mezzo di montaggio</td><td>ibidi</td><td>50001</td><td>Mezzo di montaggio liquido</td></tr><tr><td>ibidi Pump System</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>pompa pneumatica</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>integratore per terreno (L-Glu)</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2154</td><td>Base medium</td></tr><tr><td>topo anti- SMAD1 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab53745</td><td>Adatto per PLA</td></tr><tr><td>topo anti- SMAD2/3 Anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>610843</td><td>Non adatto per PLA in combinazione con CST 9515</td></tr><tr><td>topo anti- SMAD4 Anticorpo</td><td>Sanata Cruz Biotechnology</td><td>sc-7966</td><td>Adatto per PLA</td></tr><tr><td>Penicillina 10.000U/ml /Streptomicina 10mg/ml</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>integratore per terreno (P/ S)</td></tr><tr><td>Perfusion Set BIANCO</td><td>ibidi</td><td>10963</td><td>Tubi utilizzati per 1 dyn/cm2</td></tr><tr><td>Perfusion Set GIALLO e VERDE</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>Tubi utilizzati per 30 dyn/cm2</td></tr><tr><td>rabbit anti-phospho SMAD1/5</td><td>Tecnologie di segnalazione cellulare</td><td>anticorpo 9516</td><td>Adatto per coniglio PLA</td></tr><tr><td>anti- SMAD2/3 XP</td><td>Tecnologie di segnalazione cellulare</td><td>anticorpo 8685</td><td>Adatto per PLA</td></tr><tr><td>coniglio anti- SMAD4</td><td>Tecnologie di segnalazione cellulare</td><td>anticorpale 9515</td><td>Non adatto per PLA in combinazione con BD 610843</td></tr><tr><td>Connettore seriale per &micro;-Slide</td><td>ibidi</td><td>10830</td><td>tubi di connessione seriale</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>6683.1</td><td>Permeabilizzazione</td></tr></tbody></table>

visualizzazione e quantificazione della segnalazione tgfβ/bmp/smad in diverse condizioni di sforzo di taglio del fluido utilizzando il test di prossimità-legatura

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

La segnalazione del fattore di crescita trasformante β (TGFβ) / proteina morfogenetica ossea (BMP) è strettamente regolata ed equilibrata durante lo sviluppo e l'omeostasi del sistema vascolare Pertanto, la deregolazione in questa via di segnalazione provoca gravi patologie vascolari, come l'ipertensione dell'arteria polmonare, la teleangectasia emorragica ereditaria e l'aterosclerosi. Le cellule endoteliali (CE), come strato più interno dei vasi sanguigni, sono costantemente esposte allo stress da taglio fluido (SS). Modelli anormali di SS fluida hanno dimostrato di migliorare la segnalazione TGFβ / BMP, che, insieme ad altri stimoli, induce l'aterogenesi. In relazione a questo, l'ateroprone, SS a basso laminare è stato trovato per migliorare la segnalazione TGFβ / BMP mentre l'ateroprotettivo, SS laminare elevato, diminuisce questa segnalazione. Per analizzare in modo efficiente l'attivazione di questi percorsi, abbiamo progettato un flusso di lavoro per studiare la formazione di complessi di fattori di trascrizione in condizioni di SS a basso laminare e SS laminare elevato utilizzando un sistema di pompe pneumatiche disponibile in commercio e un test di legatura di prossimità (PLA).
La segnalazione attiva TGFβ/BMP richiede la formazione di complessi trimerici SMAD costituiti da due SMED regolatori (R-SMAD); SMAD2/3 e SMAD1/5/8 per la segnalazione TGFβ e BMP, rispettivamente) con un mediatore comune SMAD (co-SMAD; SMAD4). Utilizzando il PLA mirato a diverse subunità del complesso trimerico SMAD, cioè R-SMAD / co-SMAD o R-SMAD / R-SMAD, la formazione di complessi di fattori di trascrizione SMAD attivi può essere misurata quantitativamente e spazialmente utilizzando la microscopia a fluorescenza.
L'utilizzo di guide di flusso con 6 piccoli canali paralleli, collegabili in serie, consente di studiare la formazione complessa del fattore di trascrizione e di inserire i necessari controlli. 
Il flusso di lavoro qui spiegato può essere facilmente adattato per studi mirati alla vicinanza degli SMED ad altri fattori di trascrizione o a complessi di fattori di trascrizione diversi dagli SMAD, in diverse condizioni di SS fluida. Il flusso di lavoro qui presentato mostra un modo rapido ed efficace per studiare la segnalazione TGFβ/BMP indotta da SS fluidi nelle CE, sia quantitativamente che spazialmente.

In precedenza abbiamo utilizzato il PLA per rilevare le interazioni di diverse proteine SMAD3 e analizzato i cambiamenti indotti dallo stress di taglio nella fosforilazione SMAD28.
Qui, entrambi i metodi sono stati combinati con il protocollo sopra descritto. Gli HUVEC sono stati sottoposti a stress di taglio di 1 dyn/cm2 e 30 dyn/cm2 e analizzati per le interazioni dei fattori di trascrizione SMAD. Mostriamo che, rispetto a...

Qui, stabiliamo un protocollo per visualizzare e analizzare simultaneamente più complessi SMAD utilizzando il test di legatura di prossimità (PLA) in cellule endoteliali esposte a condizioni patologiche e fisiologiche di stress da taglio del fluido.

Visualizzazione e quantificazione della segnalazione TGFβ/BMP/SMAD in diverse condizioni di sforzo di taglio del fluido utilizzando il test di prossimità-legatura

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Questo protocollo consente agli scienziati di confrontare quantitativamente il numero di complessi di fattori di trascrizione in diverse condizioni di stress da taglio e sarà utile per la ricerca in biologia vascolare. Il vantaggio principale di questo protocollo è l'utilizzo di canali di flusso microfluidici che consentono indagini su più coppie di anticorpi, compresi i rispettivi controlli contemporaneamente. Per iniziare, rivestire il vetrino a sei canali aggiungendo lo 0,1% di gelatina per pelli suine preparata in PBS nei canali per 30 minuti a 37 gradi Celsius.Svuotare i canali dalla soluzione di gelatina e seminare Huvecs nei vetrini a sei canali precodificati ad una densità di 2,5 volte 10 alla sesta cella per millilitro in 30 microlitri di M199 mezzo completo. Lasciare che le cellule aderiscano per un'ora a 37 gradi Celsius nell'incubatore umidificato. Aggiungere 60 microlitri di mezzo completo M199 pre-avvertito a ciascuno dei serbatoi.Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius per due giorni in un incubatore umidificato con sostituzione media dopo 24 ore. Montare il tubo di silicio sulle unità fluidiche, riempire i serbatoi con un minimo di 10 millilitri di mezzo completo M199 pre-avvertito. Collegare le unità fluidiche con tubo al sistema di pompaggio ed eseguire il pre-run senza celle per equilibrare il mezzo e rimuovere l'aria rimanente.Collegare i singoli canali sulla slitta a sei canali utilizzando il tubo di connessione seriale. Collegare il primo e l'ultimo canale della slitta ai tubi montati sull'unità fluidica. Per l'esposizione delle cellule ad alti livelli di puro stress, aumentare lo stress puro passo saggio con fasi di adattamento, impostando i passaggi in incrementi di cinque dini per centimetro quadrato per 30 minuti.Utilizzare i ciuffi sul tubo per staccare i vetrini dalle pompe dopo l'esposizione allo stress di taglio del fluido, evitando fuoriuscite medie nell'incubatore e trasferire i vetrini di flusso sul ghiaccio. Mentre si stacca il tubo dai serbatoi, utilizzare il dito per chiudere l'altro lato del serbatoio per evitare di intrappolare le bolle d'aria nel canale. Mantenendo lo scorrimento del flusso sul ghiaccio, aspirare accuratamente il mezzo dai serbatoi ma non dal canale in cui risiedono le cellule.Lavare i campioni con 90 microlitri di PBS sterile freddo aggiungendo PBS a un serbatoio e aspirare attentamente dall'altro serbatoio, quindi ripetere per tutti i canali. Fissare le celle aggiungendo 90 microlitri di soluzione tamponata al 4% di PFA allo stesso serbatoio in cui è stato aggiunto il PBS e aspirare il liquido dall'altro serbatoio come dimostrato. Dopo aver fissato le cellule in tutti e sei i canali, trasferire i campioni dal ghiaccio alla temperatura ambiente e incubare per 20 minuti.Lavare le celle tre volte con PBS aggiungendo PBS ad un serbatoio e aspirandolo accuratamente dall'altro serbatoio in tutti i canali, avendo cura di non asciugare i canali. Estinguere l'accesso al PFA aggiungendo 90 microlitri di cloruro di ammonio ambientale da 15 millimolari preparato in PBS a uno dei serbatoi. Aspirare dall'altro serbatoio e incubare le cellule per 10 minuti.Permeabilizzare le celle aggiungendo 90 microlitri dello 0,3% di Triton X 100 preparati in PBS nel serbatoio vuoto. Aspirare dall'altro serbatoio per ciascun canale e incubare per 10 minuti, quindi lavare tre volte con PBS come dimostrato in precedenza. A 90 microlitri di soluzione di blocco pla sterile a un serbatoio.Aspirare dall'altro lato per ogni canale e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius in una camera umidificata. Aggiungere anticorpi primari nel diluente anticorpale PLA e nel vortice. Aspirare accuratamente la soluzione di blocco dai serbatoi e dai canali.Aggiungere 30 microlitri della soluzione anticorpale primaria immediatamente nel canale vuoto inclinando il vetrino mentre si aggiunge la soluzione. Ripetere per tutti i canali e incubare a quattro gradi Celsius nella camera umidificata durante la notte o a 37 gradi Celsius per un'ora. Diluire meno coniglio e più sonda PLA di topo da uno a cinque nel diluente anticorpale PLA.Lavare tutti i canali due volte aggiungendo 90 microlitri di tampone di lavaggio A e aspirando come dimostrato. Dopo aver aspirato il tampone di lavaggio, aggiungere 30 microlitri di soluzione di sonda PLA e incubare nella camera umidificata. Diluire il tampone di legatura da uno a cinque in acqua ionizzata D e diluire l'enzima ligo da uno a 40 nel tampone di legatura diluito.Dopo aver lavato e aspirato completamente il tampone di lavaggio A, aggiungere 30 microlitri di soluzione di legatura ai canali vuoti mentre si inclina il vetrino e incubare nella camera umidificata. Diluire il tampone di amplificazione da uno a cinque in acqua deionizzata, quindi diluire l'enzima polimerasi da uno a 80 nel tampone di amplificazione diluito sul ghiaccio. Dopo aver lavato e aspirato completamente il tampone di lavaggio A, aggiungere 30 microlitri di soluzione di amplificazione ai canali vuoti mentre si inclina il vetrino e incubarlo nella camera umidificata.Diluire il DAPI uno a 500 nel tampone di lavaggio B e lavare tutti i canali una volta aggiungendo 90 microlitri di DAPI contenenti tampone di lavaggio B e aspirando come dimostrato per vaporizzare i nuclei. Quindi lavare tutti i canali una volta con il tampone di lavaggio B senza DAPI. Diluire il tampone di lavaggio B da uno a 10 in acqua deionizzata e lavare tutti i canali una volta con 90 microlitri di tampone di lavaggio diluito B.Dopo aver aspirato il tampone di lavaggio B, aggiungere immediatamente da due a tre gocce del mezzo di montaggio del liquido in un serbatoio e inclinare la slitta per distribuire il mezzo di montaggio in tutti i canali.Conservare i campioni a quattro gradi Celsius in un ambiente umidificato fino all'imaging. Gli Huvecs sono stati esposti ad alto e basso stress puro. Il basso stress da taglio ha aumentato le interazioni della proteina SMAD nel citosol e nei nuclei.I controlli a singolo anticorpo non hanno mostrato pochissimi segnali, dimostrando il successo dell'esperimento. L'aumento della concentrazione di anticorpi ha comportato un numero maggiore di eventi PLA per cellula, ma la differenza nei segnali PLA tra cellule esposte a stress puro alto e basso è stata ridotta. I tamponi autoprodotti per il blocco e la diluizione degli anticorpi possono essere utilizzati come alternativa ai tamponi commerciali.La quantificazione degli eventi pla per soluzioni diluenti e bloccanti commerciali e autoprodotte ha mostrato lo stesso modello di segnali PLA nelle aree citosoliche e nucleari. Tuttavia, il numero totale di eventi PLA per cella era più alto con le soluzioni commerciali. Una combinazione di anticorpi SMAD Two/Three, SMAD Four è stata utilizzata laddove l'anticorpo SMAD Four non era adatto per esperimenti di immunofluorescenza.Non c'è stata alcuna differenza negli eventi pla nella condizione sperimentale rispetto a quella di controllo, indicando l'importanza di selezionare la corretta combinazione di anticorpi per rilevare gli eventi PLA. Il protocollo descritto può essere adattato per rilevare le interazioni di complessi di fattori di trascrizione diversi dagli SED e quindi aiutare a comprendere la regolazione genica in condizioni di athero prone e athero protettive.

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Visualizzazione e quantificazione della segnalazione TGFβ/BMP/SMAD in diverse condizioni di sforzo di taglio del fluido utilizzando il test di prossimità-legatura (Video) | JoVE Journal

Visualizzazione e quantificazione della segnalazione TGFβ/BMP/SMAD in diverse condizioni di sforzo di taglio del fluido utilizzando il test di prossimità-legatura

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