Utilizzo di baseplating e un miniscopio preancorato con una lente obiettiva per la ricerca transitoria di calcio nei topi
5 giugno 2021
Il restringimento del cemento dentale durante la polimerizzazione sposta la piastra di base. Questo protocollo minimizza il problema creando una base iniziale del cemento dentale che lascia spazio per cementare la piastra di base. Settimane dopo, la piastra di base può essere cementata in posizione su questa impalcatura utilizzando poco nuovo cemento, riducendo così il restringimento.
Questo miniscopio può ridurre il problema del restringimento con il cemento dentale durante la procedura della piastra di base e aumentare il tasso di successo delle registrazioni miniscope dei segnali di fluorescenza in due configurazioni di lunghezza. Se il transitorio di fluorescenza non può essere osservato durante la placcatura di base, controllare l'espressione dell'indicatore di calcio e la posizione di una lente relè sulla fetta di cervello. Iniziare con il montaggio dell'ago interno di un catetere endovenoso calibro 20 con un diametro di un millimetro sul braccio stereotassico.
Abbassare il catetere nel mais ventrale ammonis 1 nella regione target. Quindi, abbassare l'ago di microiniezione a una velocità da 100 a 200 micrometri al minuto nella cornu ammonis ventrale 1 e infondere 200 nanolitri del vettore virale nella regione bersaglio ad una velocità di 25 nanolitri al minuto. Dopo aver permesso al virus di diffondersi per 10 minuti, prelevare l'ago per microiniezione a una velocità compresa tra 100 e 200 micrometri al minuto.
Dopo aver disinfettato la lente del relè, immergerla in soluzione salina fredda priva di pirogeni fino all'impianto. Utilizzando un micro morsetto bulldog con tubi termorestringenti, tenere la lente del relè e posizionarla sopra la regione target a una velocità compresa tra 100 e 200 micrometri al minuto. Quindi, stabilizzare la lente con cemento dentale.
Per impostare un miniscopio, fissare l'obiettivo sul fondo e assemblare la piastra di base sul miniscopio. Avvolgere 10 centimetri di pellicola di paraffina intorno all'esterno della piastra di base. Utilizzando argilla adesiva riutilizzabile, tenere il miniscopio con la sonda da braccio stereotassica.
Allineare l'obiettivo sulla parte superiore dell'obiettivo relè con il minor spazio possibile tra gli obiettivi. Utilizzare il cemento dentale per garantire il posizionamento della piastra di base, in modo tale che il cemento tocchi solo il film di paraffina. Quando il cemento dentale si è asciugato, rimuovere la pellicola di paraffina, la piastra di base e il miniscopio, mantenendo la base del cemento dentale vuota.
Sigillare la lente del relè con gomma siliconica stampata e coprire la gomma siliconica con un sottile strato di cemento dentale. Sganciare il mouse dagli strumenti stereotassici e collocarlo in una camera di recupero. Per la placcatura di base, tagliare accuratamente lo strato sottile del tetto in cemento dentale con un rongeur osseo e rimuovere la gomma siliconica.
Pulire la superficie della lente del relè con alcool al 75%. Fissare la vite di fissaggio accanto alla piastra di base per fissarla alla parte inferiore del miniscopio. Regolare la diapositiva di messa a fuoco in modo che si trovi a circa 2,7-3 millimetri dall'alloggiamento principale.
Al termine dell'impostazione, collegare il miniscope alla scheda di acquisizione dati e collegare il miniscope a una porta USB 3.0 di un computer. Eseguire il software di acquisizione dati sviluppato dal team UCLA. Regolare l'esposizione a 255, il guadagno a 64x e il LED di eccitazione al 5%Per collegare il miniscope al software di acquisizione dati, fare clic sul pulsante di connessione e guardare il livestream del software di acquisizione dati considerando il margine della lente relè come punto di riferimento.
Una volta trovata la lente relè, allineare manualmente l'obiettivo del miniscopio all'obiettivo del relè. Regolando i vari angoli e distanze del miniscopio, iniziare la ricerca dei segnali di fluorescenza. Tenendo il miniscopio nella posizione ottimale, spostare il braccio stereotassico verso il mini cannocchiale e far aderire il miniscopio al braccio stereotassico con argilla adesiva riutilizzabile.
Cerca la vista migliore regolando leggermente i bracci X, Y e Z. Regolare l'angolo tra la superficie dell'obiettivo e l'obiettivo del relè ruotando la barra auricolare, la barra del dente o l'argilla adesiva riutilizzabile sull'asse Z. L'espressione virale e l'impianto del cristallino hanno successo quando almeno una cellula ha spostato i transitori di fluorescenza durante la placcatura di base.
Fissare saldamente la piastra di base con la minor quantità possibile di cemento dentale mentre si monitora la regione di interesse per garantire che la posizione ottimale non cambi. Nello studio rappresentativo, la procedura di baseplating fittizio si è rivelata vantaggiosa in quanto ha comportato uno spostamento minore nella posizione della piastra di base rispetto alla procedura originale. Lo spostamento della piastra di base è stato influenzato anche dall'altezza del cemento dentale.
La piastra di base che era ancorata 0,5 centimetri sopra il cranio si spostava significativamente meno della piastra di base che era fissata un centimetro sopra il cranio. In un esempio di imaging riuscito durante la procedura di placcatura di base, sono stati notati transitori di fluorescenza insieme ai vasi sanguigni nell'animale anestetizzato. I transitori di fluorescenza sono stati osservati cinque giorni dopo la placcatura basale anche quando il topo si comportava liberamente nella sua gabbia domestica con solo un leggero spostamento in una posizione.
È stata effettuata la successiva imaging del calcio dei topi. In alcuni casi, si sono verificati problemi durante la procedura di baseplating, come l'assenza di qualsiasi cosa tranne uno sfondo uniforme o la visibilità dei margini dei globuli bianchi. senza transitori di fluorescenza.
È importante fissare saldamente la piastra di base sulla regione target con la minor quantità possibile di cemento dentale. Con la tecnica dell'ardesia, i ricercatori possono osservare longitudinalmente l'attività neurale attraverso questo. Con la licenza appropriata, questa procedura può essere applicata anche per osservare la rete neurale nel campo visivo.
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Panoramica
Questo articolo descrive una procedura raffinata per minimizzare la retrazione del cemento dentale durante il processo di cementazione della base in configurazioni miniscope. Il metodo prevede la creazione di un supporto in cemento dentale, che permette un posizionamento efficace della base con problemi di retrazione ridotti, migliorando così il tasso di successo delle registrazioni del segnale di fluorescenza.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Imaging a fluorescenza
- Tecniche di registrazione neurale
Sfondo
- La retrazione del cemento dentale può spostare le basi nell'imaging a fluorescenza.
- I miniscope vengono utilizzati per registrare i segnali di fluorescenza degli indicatori di calcio.
- Il protocollo mira a migliorare la stabilità del posizionamento dell'impianto.
- I metodi precedenti hanno portato a spostamenti significativi delle posizioni della base.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo che minimizzi lo spostamento indotto dalla retrazione del cemento dentale.
- Migliorare l'affidabilità delle registrazioni miniscope nella ricerca neuroscientifica.
- Valutare le implicazioni dell'altezza della base sulla stabilità dopo l'applicazione.
Metodi utilizzati
- Configurazione miniscope con supporto in cemento dentale per sostenere la base.
- Mirate al corno ammonis ventrale 1 per l'infusione del vettore virale.
- I passaggi critici includono il fissaggio metodico dell'obiettivo di trasmissione e l'applicazione del cemento dentale.
- Controllo della fluorescenza durante e dopo la procedura di baseplating per garantire un impianto riuscito.
- Regolazione del posizionamento della base per ottimizzare il processo di imaging post-intervento.
Risultati principali
- Il metodo descritto ha portato a uno spostamento ridotto delle basi rispetto alle tecniche tradizionali.
- L'imaging riuscito delle transienti di fluorescenza è stato ottenuto con un uso minimo di cemento.
- La stabilità della base è diminuita con l'aumento dell'altezza dal cranio.
- L'imaging a fluorescenza dinamica è stato osservato anche in topi che si comportano liberamente dopo l'impianto.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un approccio raffinato per le installazioni mini-scope per migliorare i risultati di imaging.
- Il posizionamento stabile della base è cruciale per una registrazione affidabile dell'attività neuronale in contesti di ricerca.
- I risultati indicano potenziali applicazioni per il monitoraggio dell'attività neurale in vari paradigmi sperimentali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Reliable in vivo calcium imaging in freely behaving mice is critical for translational neuroscience and neuropharma discovery pipelines. This protocol addresses a key technical bottleneck—minimizing misalignment between miniscope lenses due to dental cement shrinkage—thereby improving data quality and reproducibility in longitudinal neural activity studies. Enhanced imaging stability directly supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical neurobiology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of neural circuit function in disease-relevant models.
- Reduces technical artifacts, supporting higher predictive confidence in neuronal activity readouts.
- Facilitates functional target validation by ensuring stable, longitudinal imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized workflow for preparing validated imaging systems in freely behaving animals.
- Improves reproducibility and quantitative reliability of fluorescence-based neural assays.
- Supports scalable deployment of miniscopes for compound screening in neuropharmacology.
Translational & Preclinical Research
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting stable, repeated imaging sessions.
- Aligns with translational biomarker strategies by capturing dynamic neural activity in physiologically relevant contexts.
- Reduces risk of data loss or misinterpretation due to technical misalignment.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, supporting workflows from early hypothesis testing to lead identification in neuropharma pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of neural circuits by ensuring imaging fidelity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables reliable measurement of calcium transients, facilitating statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Provides stable imaging for longitudinal biomarker studies in freely behaving animal models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized imaging platform for diverse neuroscience R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural activity studies.
- Operational Value: Standardizes baseplating and imaging procedures, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by reducing technical failure rates and data variability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurobiological targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery and in vivo imaging techniques.
- Needs access to miniscopes, data acquisition software, and precise dental cement handling tools.
- Demands cross-team standardization of surgical and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to various brain regions and genetically encoded indicators with protocol-specific adjustments.
- Dependent on successful viral expression and precise lens placement for optimal results.
