Name: Follow-up longitudinale delle infezioni del tratto urinario e loro trattamento nei topi utilizzando limaging a bioluminescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Scopri l'imaging a bioluminescenza per il monitoraggio longitudinale delle infezioni del tratto urinario nei topi. Questo metodo riduce il numero di animali necessari e migliora la riproducibilità della ricerca sulle ITU.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione per la ricerca - Fiandre (FWO Vlaanderen; G0A6113N), il Consiglio di ricerca di KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. e W.E.) e il VIB (a T.V.). W.E. è un ricercatore clinico senior della Fondazione di ricerca - Fiandre (FWO Vlaanderen). Il ceppo UTI89-lux è stato un generoso dono del laboratorio del Prof. Seed13.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida del Consiglio della Comunità europea dell'Unione europea e sono stati approvati dal Comitato etico animale di KU Leuven (P158/2018).
1. Batteri di coltura (adattati da7,13,14)
<ol><li>Preparazione<ol>
<li>Scegli un ceppo UPEC luminescente che meglio si adatta alle esigenze sperimentali. NOTA: Qui, l'isolato di cistite clinica, UTI89 (E. coli), è stato selezionato per la sua capacità uropatogena sia nell'uomo che nei roditori e il suo uso comune nei modelli UTI murini5,7,15. Il ceppo isogenico bioluminescente che trasporta l'operone lux completo (luxCDABE) è ulteriormente indicato come UTI89-lux. Questo operone trasporta anche geni di resistenza alla kanamicina solfato (Km). Pertanto, Km può essere utilizzato per selezionare colonie bioluminescenti13.</li>
		<li>Fare una curva di correlazione per il CFU e densità ottica a 600 nanometri (OD 600 nm) per il ceppo batterico scelto7.<ol>
<li>Per fare questo, coltivare batteri (utilizzando il protocollo seguente) e fare 8 diverse diluizioni in soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Misurare l'OD a 600 nm per tutte queste diluizioni e placcarle su piastre Luria-Bertani (LB) per determinare il CFU.</li>
			<li>Tracciare i valori OD 600 nm e i valori CFU per determinare la correlazione e ottenere una curva standard. NOTA: Per esperimenti futuri, misurare l'OD a 600 nm e utilizzare questa curva standard per ottenere una stima istantanea del CFU in una soluzione batterica. ATTENZIONE: gli UPEC sono batteri patogeni, assicurano che le stanze siano adeguatamente attrezzate e utilizzino dispositivi di protezione individuale.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Tre giorni prima dell'instillazione<ol>
<li>Ottenere singole colonie strisciando lo stock di glicerolo di batteri, utilizzando un anello di inoculazione, su piastre LB integrate con 50 μg/mL Km e coltivando durante la notte a 37 °C. Sigillare queste piastre con un film di paraffina da conservare a 4 °C fino a 1 settimana.</li>
	</ol></li>
	<li>Due giorni prima dell'instillazione<ol>
<li>Riempire un tubo a fondo tondo in polistirene sterile da 14 mL con tappi a scatto a doppia posizione con 5 mL di brodo LB integrato con 50 μg/mL Km. Scegliere una singola colonia batterica con un anello di inoculazione e aggiungerlo al brodo LB. Vortice per 10 s per garantire una corretta miscelazione.</li>
		<li>Coltura statica con il tappo a scatto in posizione aperta a 37 °C durante la notte. NOTA: La crescita statica di E. coli favorisce l'espressione del tipo 1-pili, che sono fondamentali per l'aderenza e l'invasione delle cellule epiteliali urinarie.</li>
		<li>Preparare un Erlenmeyer sterile o un pallone di coltura.</li>
	</ol></li>
	<li>Un giorno prima dell'instillazione<ol>
<li>Dopo l'incubazione, ruotare il tubo per 10 s per garantire una corretta omogeneizzazione della coltura batterica. Effettuare una sottocoltura nell'Erlenmeyer aggiungendo 25 μL della sospensione batterica a 25 mL di terreno LB fresco senza antibiotici.</li>
		<li>Chiudere l'Erlenmeyer e la coltura statica a 37 °C durante la notte.</li>
	</ol></li>
	<li>Il giorno dell'instillazione<ol>
<li>Vortice dell'Erlenmeyer per 10 s per garantire una corretta miscelazione.</li>
		<li>Versare la coltura dell'Erlenmeyer in un tubo di coltura da 50 ml e centrifugare a 3.000 x g e 4 °C per 5 minuti. Decantare il surnatante e risospesare il pellet batterico in 10 ml di PBS sterile e vortice di nuovo per 10 s.</li>
		<li>Scegliere la concentrazione sperimentale dell'inoculo (CFU) e utilizzare la curva standard ottenuta nel passaggio 1.1.2 per determinare la corrispondente OD 600 nm.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL della coltura batterica risospesa in 9 mL di PBS sterile e controllare l'OD a 600 nm. Regolare ulteriormente aggiungendo PBS sterile o soluzione batterica concentrata, fino a raggiungere l'OD 600 nm desiderato7. NOTA: Ad esempio, per UTI89-lux regolare la coltura aggiungendo PBS fino a quando l'OD 600 nm raggiunge 0,45, corrispondente a 2 x 107 CFU/50 μL. Per verificare il numero di CFU vitali, effettuare diluizioni seriali 10 volte e piastre 50 μL della quinta e sesta diluizione 10 volte su piastre LB in triplice copia per ottenere meno di 300 colonie. Contare le colonie ottenute il giorno successivo dopo l'incubazione notturna a 37 °C. OD 600 nm dà una lettura istantanea ma utilizzare CFU come controllo di qualità.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inoculazione degli animali (adattato da7,16)
<ol><li>Preparazione degli animali<ol>
<li>Scegli i ceppi di topo desiderati in base alla domanda di ricerca e alla disponibilità di linee knock-out, dettagli sperimentali e differenze nella suscettibilità UTI5,17. Tieni presente che il cateterismo transuretrale è più facile nei topi femmina. Non usare animali di età inferiore alle 8 settimane, in quanto sono immunologicamente immaturi. Qui sono stati utilizzati topi C57Bl / 6J femmina di 12 settimane.</li>
		<li>Ordina gli animali con largo anticipo e lasciali acclimatare, idealmente per 7 giorni. Animali domestici di gruppo in gabbie ventilate individualmente, in condizioni standard di luce/buio di 12 ore.</li>
		<li>Rasare la regione addominale degli animali per limitare la perdita di segnale. Non usare la crema per la depilazione, in quanto può bruciare rapidamente la pelle degli animali. Trattenere l'animale tenendo strettamente la collottola e gli arti posteriori con la mano non dominante mentre si rade con la mano dominante. In alternativa, radersi in anestesia isoflurano. NOTA: gli animali sono stati rasati 2 giorni prima dell'imaging, considerando che gli animali puliranno ulteriormente l'area rasata.</li>
		<li>Fornire acqua e cibo standard ad libitum durante l'esperimento. Tuttavia, privare gli animali dall'acqua 2 ore prima dell'instillazione per ridurre al minimo il volume della vescica durante l'instillazione.</li>
		<li>Montare una punta angiocatetere sterile da 24 G su una siringa da 100 μL e riempire la siringa con la soluzione batterica preparata al punto 1.5.3. NOTA: per determinare la luminescenza dello sfondo, ottenere un'immagine di base prima dell'instillazione (vedere il passaggio 3 di seguito).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instillazione degli animali<ol>
<li>Mettere gli animali in una camera di induzione e anestetizzarli utilizzando l'inalazione di isoflurano con ossigeno puro come gas vettore (induzione al 3% e mantenimento all'1,5%).</li>
		<li>Posizionare un animale su una superficie di lavoro in posizione supina e mantenere un'anestesia isoflurano stabile usando un cono nasale durante l'instillazione. Applicare l'unguento per gli occhi.</li>
		<li>Espellere l'urina residua applicando una leggera compressione e facendo movimenti circolari sulla regione sovrapubica. Pulire l'addome inferiore con il 70% di etanolo prima dell'instillazione.</li>
		<li>Lubrificare la punta del catetere con soluzione salina normale. Metti l'indice della mano non dominante sull'addome e spingilo delicatamente verso l'alto. Avviare il cateterismo dell'uretra con un angolo di 90° (verticalmente) e una volta riscontrata resistenza, inclinarlo orizzontalmente prima di inserirlo ulteriormente (0,5 cm). NOTA: Non spingere mai con forza il catetere, poiché ciò causerà danni all'uretra. Movimenti di rotazione delicati possono essere utili nell'inserimento del catetere. D'altra parte, una mancanza di resistenza di solito indica un inserimento errato nella vagina.</li>
		<li>Eseguire un'instillazione lenta (5 μL/s) di 50 μL dell'inoculo batterico (2 x 107 CFU). NOTA: volumi più elevati o instillazione più rapida potrebbero causare reflusso ai reni. Durante la pratica della tecnica, l'inchiostro blu può essere utilizzato per valutare il reflusso.</li>
		<li>Dopo l'instillazione, tenere la siringa e il catetere in posizione per qualche altro secondo e poi ritrarre lentamente per evitare perdite. Registrare eventuali irregolarità come un'elevata quantità di perdite o un meato sanguinante ed escludere gli animali, se necessario.</li>
		<li>Posizionare l'animale in posizione supina al cono nasale della camera di imaging e ripetere i passaggi precedenti 2.1.1-2.1.6 per tutti gli animali rimanenti. Utilizzare un catetere per gruppo sperimentale. Assicurarsi che l'anestesia sia continuata e ridurre al minimo il tempo tra il primo e l'ultimo animale.</li>
		<li>Se necessario, somministrare antibiotici o farmaci sperimentali, prima o dopo l'imaging (fase 3). Ad esempio, per somministrare enrofloxacina, aggiungere 40 μL della soluzione di enrofloxacina (100 mg/mL) a 3,96 mL di soluzione fisiologica per ottenere una diluizione di 1/100. Iniettare 100 μL/10 g per via sottocutanea alle 9 e alle 17 per somministrare 10 mg/kg di enrofloxacina due volte al giorno per 3 giorni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Imaging a bioluminescenza
<ol><li>Preparazione e selezione dei parametri di imaging<ol>
<li>Aprire il software di acquisizione BLI (vedere Tabella dei materiali)e fare clic su Inizializza nel dispositivo di imaging (vedere Tabella dei materiali)per testare il sistema di controllo della telecamera e dello stage e per raffreddare la telecamera CCD a -90 °C. NOTA: durante questo processo, la porta è bloccata e l'avanzamento dell'inizializzazione può essere seguito sul pannello di controllo. Una luce verde indica che è stata raggiunta la temperatura di -90 °C. Se si tenta di eseguire l'imaging prima del completamento dell'inizializzazione, verrà visualizzato un avviso.</li>
		<li>Assicurarsi che i dati vengano salvati automaticamente: fare clic su acquisizione Salvataggio automatico in e selezionare la cartella corretta.</li>
		<li>Selezionare Luminescenza e Fotografia. Controllare le impostazioni di luminescenza predefinite: impostare il filtro di eccitazione su Blocca e il filtro di emissione su Apri.</li>
		<li>Impostare il tempo di esposizione su Auto quando si scatta la prima immagine, soprattutto quando ci si aspetta un segnale debole per garantire un numero adeguato di conteggi di fotoni. Per le misurazioni in vivo e i segnali luminosi, impostare il tempo di esposizione su ~30 s. Se l'immagine è satura, verrà visualizzato un avviso. Se ciò accade, ridurre il tempo di esposizione.</li>
		<li>Selezionare il Binning medio, F/stop 1 e scegliere il campo visivo corretto(FOV)(D per 5 animali).</li>
		<li>Impostare l'altezza del soggetto su 1 cm durante l'imaging dei mouse.</li>
		<li>Fare clic su Aggiungi tre volte nel Pannello di controllo di acquisizione per ottenere una sequenza di tre immagini, come repliche tecniche.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging<ol>
<li>Posizionare i topi nella camera di imaging in posizione supina e utilizzare il cono del naso del collettore per mantenere l'anestesia (isoflurano 1,5%) durante l'esperimento. Immagina fino a 5 topi contemporaneamente e separa gli animali usando il deflettore di luce per impedire la riflessione.</li>
		<li>Chiudi la porta e fai clic su Acquisisci per avviare la sequenza di imaging.</li>
		<li>Inserisci informazioni dettagliate sull'esperimento (animali selvatici e knockout, trattamenti, giorno di imaging, ecc.). Le impostazioni di imaging, come il tempo di esposizione, vengono salvate automaticamente.</li>
		<li>Rimuovere i topi dalla camera di imaging e riportarli nella loro gabbia. Verificare il pieno recupero dopo l'anestesia. In pochi minuti, gli animali dovrebbero essere completamente svegli ed esplorativi. Non fornire analgesia in quanto ciò potrebbe interferire con il corso UTI18.</li>
		<li>Riportare le gabbie ai rack ventilati fino al successivo ciclo di imaging. Dopo il completamento dell'esperimento, eutanasizzare gli animali mediante asfissia di CO2 o lussazione cervicale. Fallo prima del recupero dell'anestesia isoflurano per ridurre al minimo l'angoscia.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi delle immagini<ol>
<li>Avviare il software di imaging e caricare il file sperimentale facendo clic su Sfoglia.</li>
		<li>Utilizzate la tavolozza degli strumenti per regolare la scala dei colori dell'immagine. Standardizzare l'aspetto visivo dei risultati utilizzando le stesse impostazioni per tutte le immagini, ovvero utilizzare una scala logaritmica con un minimo di 104 ad un massimo di 107 fotoni. Queste regolazioni non influiscono sui dati grezzi ma solo sulla presentazione grafica.</li>
		<li>Utilizza gli strumenti ROI per disegnare una regione di interesse (ROI) sull'immagine. Assicurati che il ROI sia abbastanza grande da coprire l'intera area e utilizza le stesse dimensioni per tutte le immagini. Qui, un ROI quadrato di 3,5 cm x 4,5 cm è stato posizionato sopra l'addome inferiore.</li>
		<li>Fare clic su Misurazione del ROI per quantificare l'intensità luminosa (conteggi o flusso totale di fotoni). Esporta questi dati e utilizza la media delle repliche tecniche. NOTA: i conteggi rappresentano il numero di fotoni rilevati dalla fotocamera e devono essere utilizzati solo per il controllo della qualità dell'immagine. Per riportare i dati, utilizzare il flusso totale di fotoni. Il flusso totale di fotoni è più fisiologicamente rilevante in quanto rappresenta la luce emessa dalla superficie ed è un'unità calibrata, che viene corretta per il tempo di esposizione (al secondo).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Vantaggi di BLI rispetto ai conteggi CFU Dati longitudinali Uno dei principali svantaggi del metodo tradizionale di conteggio dei CFU per quantificare il carico microbico è il requisito degli omogeneizzati d'organo post-mortem, fornendo un solo punto di dati trasversale per animale. Al contrario, BLI consente un follow-up longitudinale non invasivo degli animali infetti. Gli animali possono essere ripresi 2 o 3 volte al giorno, fornendo informazioni dettagliate sulla cinetica dell'infezion...

Le infezioni del tratto urinario (UTI) sono tra le infezioni batteriche più comuni negli esseri umani. Quasi la metà di tutte le donne sperimenterà una UTI sintomatica durante la loro vita1. Le infezioni limitate alla vescica possono dare origine a sintomi urinari come aumento della frequenza urinaria, urgenza, ematuria, incontinenza e dolore. Quando l'infezione sale al tratto urinario superiore, i pazienti sviluppano pielonefrite, con malessere, febbre, brividi e mal di schiena. Inoltre, fino al 20% dei pazienti con UTI soffre di infezioni ricorrenti con conseguente drastica diminuzione della sensibilità agli antibiotici2,3,4. Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse per le nuove terapie per il trattamento e la prevenzione delle infezioni cardiache regressive. Nonostante una migliore comprensione dell'immunità innata e adattativa del tratto urinario inferiore e dei fattori di virulenza batterica necessari per l'invasione e la colonizzazione, nessun cambiamento radicale nel regime di trattamento è stato tradotto nella pratica urologica quotidiana2. Per studiare la patogenesi e la suscettibilità delle UTI in vivo,è indispensabile un test riproducibile e non invasivo.
Sono stati descritti più modelli di UTI animali che vanno dai nematodi ai primati, ma il modello murino è prevalentemente utilizzato5,6. Questo modello consiste nella cateterizzazione transuretrale di topi (femmina) e nella successiva instillazione di una sospensione batterica, più comunemente Escherichia coli uropatogena (UPEC), direttamente nel lume della vescica7. Dopo l'inoculazione, la carica batterica è stata tradizionalmente quantificata determinando le unità formanti colonie (CFU). Questa tecnica richiede il sacrificio di animali per ottenere omogeneizzati di organi post-mortem e diluizioni seriali, limitando l'output e la riproducibilità dei dati. Inoltre, il follow-up longitudinale della carica batterica nei singoli animali non è possibile utilizzando questa tecnica.
Nel 1995, Contag etal. hanno suggerito l'uso di agenti patogeni bioluminescenti per monitorare i processi patologici negli animali viventi8,9. Da allora, l'imaging a bioluminescenza (BLI) è stato applicato a numerosi modelli di infezione come meningite, endocardite, osteomielite, infezioni della pelle e dei tessuti molli, ecc.10,11,12. Nel modello murino UTI, un ceppo UPEC con l'operone lux completo (luxCDABE) di Photorhabdus luminescens può essere utilizzato13. Una reazione enzimatica è catalizzata dalla luciferasi batterica che dipende dall'ossidazione delle aldeidi a catena lunga che reagiscono con un ridotto mononucleotide flavina in presenza di ossigeno, producendo la flavina ossidata, un acido grasso a catena lunga e leggero12. L'operone lux codifica per la luciferasi e altri enzimi necessari per la sintesi dei substrati. Pertanto, tutti i batteri metabolicamente attivi emetteranno continuamente luce verde blu (490 nm) senza la necessità di iniezione di un substrato esogeno12. I fotoni emessi da batteri con tag luxpossono essere catturati utilizzando telecamere CCD (Charge-Coupled Device) altamente sensibili e raffreddate.
L'uso di batteri bioluminescenti in un modello per UTI consente la quantificazione longitudinale e non invasiva della carica batterica, omettendo la necessità di sacrificare animali in punti temporali fissi durante il follow-up per la determinazione del CFU. Nonostante l'ampia gamma di possibilità, accumulando prove per la robustezza di questa tecnica BLI in altri campi e i suoi vantaggi rispetto ai modelli classici di UTI, non è stata ampiamente implementata nella ricerca UTI. Il protocollo qui presentato fornisce una guida dettagliata passo-passo ed evidenzia i vantaggi di BLI per tutte le future UTI ricerche.

<table><tbody><tr><td>Piastra in polistirene a fondo piatto nero a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3925</td><td>per imaging in vitro</td></tr><tr><td>Aesculap ISIS</td><td>Aesculap</td><td>GT421</td><td>, con tappo GT608</td></tr><tr><td>Vaporizzatore per anestesia Harvard</td><td>apparatus limited</td><td>N/A</td><td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td></tr><tr><td>Baytril 100 mg/mL</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td>Enrofloxacina</td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td><td>BD</td><td>382912</td><td>Giocatetere giallo, utilizzare una punta di plastica sterile per l'instillazione</td></tr><tr><td>C57Bl/6J topi</td><td>Janvier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628146</td><td></td></tr><tr><td>Dropsense 16</td><td>Unchained Labs</td><td>Trinean</td><td>per misurare OD 600nm</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Soluzione salina, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REF 14040-083</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo denaturato al 70% 5L</td><td>VWR international</td><td>85825360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14ml Tubo in polistirene a fondo tondo, tappo a scatto</td><td>Corning</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50ml cellstart</td><td>Greiner</td><td>227285</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Siringa GASTIGHT, PTFE luer lock, 100 &; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26203</td><td>per garantire una lenta instillazione batterica di 50 &micro; L</td></tr><tr><td>Anello di inoculazione</td><td>Roth</td><td>6174.1</td><td>supporto: Art. N. 6189.1</td></tr><tr><td>Iso-Vet 1000mg/g</td><td>Prodotti veterinari Dechra</td><td>N/A</td> Spettro IVIS <td>Isoflurano</td></tr><tr><td>Sistema di imaging in vivo</td><td>PerkinElmer</td><td>REF 124262</td><td>dispositivo di imaging</td></tr><tr><td>Kanamicina soluzione 50 mg/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Software di imaging vivente</td><td>PerkinElmer</td><td>N/A</td><td>Software di acquisizione BLI, versione 4.7.3</td></tr><tr><td>Luria Bertani Brodo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>REF L3022</td> in <td>alternativa si può fare</td></tr><tr><td>Luria Bertani Brodo con agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>REF L2897</td><td>in alternativa si può fare</td></tr><tr><td>la piastra Petri Sterilin 90mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>101VR20</td><td>da riempire con LB agar integrato con</td></tr><tr><td>Km Pyrex Pallone di coltura 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLW1141/08-20EA</td><td></td></tr><tr><td>Slide 200 Trinean</td><td>Unchained Labs</td><td>701-2007</td><td>per misurare OD 600nm</td></tr><tr><td>UTI89-lux</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Generoso dono da parte del Prof. Seed</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR international</td><td>444-1372</td><td></td></tr></tbody></table>

follow-up longitudinale delle infezioni del tratto urinario e loro trattamento nei topi utilizzando l'imaging a bioluminescenza

Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Le infezioni del tratto urinario (UTI) sono tra le infezioni batteriche più comuni negli esseri umani e sono trattate di routine con antibiotici empirici. Tuttavia, a causa dell'aumento della resistenza microbica, l'efficacia degli antibiotici più utilizzati è diminuita. Per trovare opzioni di trattamento alternative, c'è un grande bisogno di una migliore comprensione della patogenesi UTI e dei meccanismi che determinano la suscettibilità UTI. Per indagare su questo in un modello animale, è indispensabile un test riproducibile e non invasivo per studiare il corso dell'UTI.
Per anni, il gold standard per l'enumerazione della carica batterica è stata la determinazione delle unità formanti colonie (CFU) per un particolare volume di campione. Questa tecnica richiede omogeneizzati d'organo post-mortem e diluizioni seriali, limitando l'output e la riproducibilità dei dati. In alternativa, l'imaging a bioluminescenza (BLI) sta guadagnando popolarità per determinare la carica batterica. L'etichettatura dei patogeni con un operone lux consente il rilevamento e la quantificazione sensibili in modo non invasivo, consentendo così un follow-up longitudinale. Finora, l'adozione di BLI nella ricerca UTI rimane limitata.
Questo manoscritto descrive l'implementazione pratica di BLI in un modello di infezione del tratto urinario di topo. Qui viene fornita una guida passo-passo per la coltura di batteri, l'instillazione intravescicale e l'imaging. Viene esaminata la correlazione in vivo con i CFU e viene fornita una prova di concetto confrontando la carica batterica degli animali infetti non trattati con gli animali trattati con antibiotici. Inoltre, vengono discussi i vantaggi, i limiti e le considerazioni specifiche per l'implementazione di BLI in un modello UTI in vivo. L'implementazione di BLI nel campo della ricerca UTI faciliterà notevolmente la ricerca sulla patogenesi delle UTI e la scoperta di nuovi modi per prevenire e curare le UTI.

In vivo BLI correla con CFU dell'inoculo al momento dell'instillazione. Per valutare il limite di rilevazione di BLI in vivo e la correlazione con CFU dell'inoculo, i topi sono stati infettati con diverse concentrazioni di UTI89-lux e PBS come controllo negativo. Prima dell'instillazione, gli animali non infetti sono stati scansionati per determinare la luminescenza di fondo. Le immagini successive sono state ottenute immediatamente dopo l'instillazione (<s...

Questo manoscritto descrive la somministrazione intravescicale di batteri uropatogeni con un operone lux per indurre un'infezione del tratto urinario nei topi e la successiva analisi longitudinale in vivo della carica batterica utilizzando l'imaging a bioluminescenza.

Follow-up longitudinale delle infezioni del tratto urinario e loro trattamento nei topi utilizzando l'imaging a bioluminescenza

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

L'enumerazione delle unità formanti colonie limitava la riproducibilità della ricerca nel campo delle UTI. L'imaging a bioluminescenza farà progredire la ricerca UTI in vivo sulla fisiologia della vescica, la patogenesi e la suscettibilità dell'UTI. L'imaging a bioluminescenza consente il follow-up longitudinale con informazioni in tempo reale sull'evoluzione dell'infezione.Inoltre, riduce drasticamente il numero di animali necessari. L'imaging a bioluminescenza facilita la ricerca sulle infezioni ricorrenti o croniche, che sono frequenti negli esseri umani. Inoltre, i ricercatori possono identificare infezioni ascendenti o diffusione al sangue utilizzando l'imaging a bioluminescenza.Ottieni singole colonie strisciando lo stock di glicerolo di batteri con un ciclo di inoculazione su piastre LB integrate con kanamicina solfato e coltivando durante la notte a 37 gradi Celsius. Riempire un tubo di fondo rotondo sterile in polistirene da 14 millilitri, con tappi a scatto a doppia posizione con cinque millilitri di brodo LB integrati con kanamicina solfato. Scegli una singola colonia batterica con un ciclo di inoculazione e aggiungilo al brodo LB.Vortice per 10 secondi per garantire una

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra metodi per indurre transurethrally infezioni del tratto urinario del mouse e quantificare l'entità delle infezioni che ne derivano.

Induzione transuretrale di infezioni del tratto urinario mouse

Metodi per l'imaging bioluminescenza delle infezioni batteriche in animali viventi sono descritti. Gli agenti patogeni sono stati modificati per esprimere la luciferasi che permette l'imaging ottico intero corpo di infezioni negli animali vivi. I modelli animali possono essere infettati da agenti patogeni che esprimono luciferasi e il decorso della malattia conseguente visualizzati in tempo reale da parte di imaging bioluminescenza.

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Questo articolo descrive la somministrazione...

Bioluminescent Imaging batterica<em&gt; In Vivo</em

Fonte: Valentine, M. E., et al. Generazione di mutanti di delezione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello murino di infezione. J. Vis. Exp. (2020)Questo video dimostra l'uso della bioluminescenza per visualizzare e confrontare il comportamento in vivo di ceppi batterici virulenti e attenuati nei topi. Delinea la preparazione di sospensioni batteriche bioluminescenti e la loro iniezione intraperitoneale nei topi. Il ceppo...

Monitoraggio delle dinamiche dell'infezione batterica in un topo utilizzando la bioluminescenza

Fonte: de Vries, C. R., et al., Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica da ferita da Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Esp. (2020).Questo video mostra una tecnica di imaging bioluminescente per monitorare la progressione dell'infezione batterica in un modello murino vivo. I batteri patogeni ingegnerizzati con il sistema di segnalazione luxABCDE emettono luce nel sito di infezione, permettendo la visualizzazione dei batteri metabolicamente attivi. Attraverso l'imaging del topo...

Imaging bioluminescente delle infezioni batteriche nei topi

Fonte: Valentine, M. E., et al., Generazione di mutanti di delezione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello murino di infezione. J. Vis. Esp. (2020)Questo video dimostra l'uso di un approccio di imaging basato sulla bioluminescenza per monitorare l'infezione batterica in un modello topino vivo. L'imaging bioluminescente e a raggi X sequenziale consente la visualizzazione in tempo reale e la localizzazione anatomica...

Imaging in tempo reale dell'infezione batterica in un modello murino utilizzando la bioluminescenza

Fonte: Luyts, N., et al. Follow-up longitudinale delle infezioni delle vie urinarie e il loro trattamento nei topi tramite imaging bioluminescenze. J. Vis. Esp. (2021).Questo video dimostra l'induzione e il tracciamento dell'infezione delle vie urinarie in un modello murino utilizzando E. coli bioluminescente iniettate nella vescica, dove avvengono l'adesione, l'invasione e la replicazione intracellulare batterica. La luce emessa dall'operone bioluminescente funge da indicatore in tempo reale...

Visualizzazione dell'infezione delle vie urinarie in un modello murino utilizzando la bioluminescenza

Source: Hunt, A. M. A., et al. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp.(2017).This video demonstrates the procedure for assessing infection clearance and healing progression in a wounded diabetic mouse using bioluminescent and microscopic images.

Bioluminescence Imaging to Track Bacterial Infection and Wound Healing in a Mouse Model

In questo video, descriviamo la tecnica per la somministrazione intravescicale di batteri uropatogeni per generare un modello di infezione del tratto urinario nei topi. Questo modello può essere utilizzato per comprendere la diffusione dell'infezione batterica uropatogena all'interno del sistema urinario e i meccanismi che determinano la suscettibilità alle infezioni delle vie urinarie.

Generazione di un modello di infezione del tratto urinario: una tecnica per somministrare batteri uropatogeni nel topo per sviluppare un modello di infezione del tratto urinario

Di imaging multi-modalità è un valido approccio per studiare la colonizzazione batterica in piccoli modelli animali. Questo protocollo descrive l'infezione di topi con...

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

Il modello stabilito di cateterizzazione transuretrale dei topi permette lo studio delle patologie della vescica, compreso l'infezione delle vie urinarie, ma può essere eseguito solo nelle femmine. Un nuovo modello di maschio instillazione transuretrale, qui presentato, consentirà la ricerca in un'area segnata da forti differenze cliniche ed epidemiologiche tra i sessi.

Infezione di apparato urinario in un modello animale piccolo: cateterizzazione transuretrale di topi maschi e femmine

Scopri l'imaging a bioluminescenza per il monitoraggio longitudinale delle infezioni del tratto urinario nei topi. Questo metodo riduce il numero di animali necessari e migliora la riproducibilità della ricerca sulle ITU.

Follow-up longitudinale delle infezioni del tratto urinario e loro trattamento nei topi utilizzando l'imaging a bioluminescenza

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