Name: Un modello di fetta di cervello Ex Vivo per studiare e indirizzare la crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Scopri un modello di fetta cerebrale ex vivo per testare farmaci e radiazioni sulle metastasi cerebrali da cancro al seno. Questo metodo mantiene le interazioni tumore-cervello-ospite in condizioni fisiologicamente rilevanti.

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Vogliamo ringraziare Julia Farnan, Kayla Green e Tiziana DeAngelis per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato in parte dal Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) e W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

Questo protocollo è stato approvato e segue le linee guida per la cura degli animali dal Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). In questo studio sono stati utilizzati topi femmina atimici Nu/Nu (6-8 settimane di età).
1. Iniezione intracranica di cellule tumorali
<ol><li>Sterilizzare tutte le attrezzature (pinzette, forbici, forbici da sutura, trapano a mano) sotto un ciclo a secco di un'autoclave per un massimo di 45 minuti in sacchetti di sterilizzazione, incluso un indicatore di sterilizzazione. Se si eseguono interventi chirurgici su più animali, sterilizzare gli strumenti tra gli animali utilizzando uno sterilizzatore per perline riscaldato (fino a 3x).</li>
	<li>Anestetizzare i topi secondo il protocollo di cura degli animali degli utenti (ad esempio, isoflurano (4% per induzione, 1-2% di mantenimento) e somministrare analgesia (sottocutanea, 0,1 ml di 0,1 mg / kg di buprenorfina SR-LAB) prima dell'inizio dell'intervento chirurgico. Garantire una profondità di anestesia ottimale con un pizzico della punta.</li>
	<li>Posizionare i mouse in una cornice stereotassica e immobilizzare la testa utilizzando barre auricolari standard (Figura 1A). Applicare unguento oftalmico agli occhi.</li>
	<li>Sterilizzare la superficie della testa mediante applicazione ripetuta e alternata (3x) di tamponi di iodio e etanolo al 70% prima dell'incisione.</li>
	<li>Usa un bisturi chirurgico per fare un'incisione della linea mediana di 1 cm attraverso la pelle con un angolo leggermente diagonale rispetto alla linea immaginaria che divide il cervello dei topi in due metà simmetriche per esporre il cranio. Pulire il sangue con un batuffolo di cotone.</li>
	<li>Deviare la pelle lateralmente per esporre il sito di iniezione: 2 mm a destra, 1 mm in avanti con riferimento al bregma (+2 mediolaterale (+2ML), +1 rostrale/caudale (+1RC).</li>
	<li>Utilizzare una punta di fresa (0,73 mm) per penetrare nel cranio +2ML, +1RC al bregma e praticare un foro usando una leggera pressione e movimento di torsione.</li>
	<li>Utilizzare una siringa per iniezione cerebrale per iniettare 5 μL di una soluzione di 100.000 MDA-MB-231BR (GFP-Luciferasi che esprime stabilmente) in soluzione sterile 1x PBS inserendo inizialmente la siringa a 3,5 mm di profondità nel cervello.</li>
	<li>Lasciare riposare la siringa per 2 minuti. Tirarlo su circa 1 mm e, dopo 2 minuti, iniettare lentamente la prima metà del volume.</li>
	<li>Attendere altri 2 minuti prima di iniettare il resto, quindi tirare lentamente la siringa 3 minuti dopo l'iniezione finale. NOTA: l'iniezione lenta è empirica nel consentire al volume di essere ben assorbito dal tessuto cerebrale e non creare perdite dopo aver tirato la siringa, il che può portare alla crescita delle cellule tumorali al di fuori del sito previsto.</li>
	<li>Applicare la cera ossea sul sito di iniezione sul cranio e quindi utilizzare suture in polipropilene per suturare il tessuto. I topi si riprenderanno entro 5 minuti dopo la rimozione dell'anestesia.</li>
	<li>Monitorare il loro comportamento subito dopo l'intervento chirurgico per circa 10 minuti, 3 ore dopo e il giorno seguente per determinare se sono necessari trattamenti speciali, tra cui iniezione salina, cibo morbido, ecc., Per aiutare un rapido recupero.</li>
	<li>Monitorare la crescita del tumore tramite imaging a bioluminescenza sul sistema di imaging.<ol>
<li>Per questo, in primo luogo, accendere l'ossigeno e l'isoflurano sul sistema di imaging. Consentire la distribuzione di entrambi nella camera separata all'esterno della scatola di imaging.</li>
		<li>Quindi, accendere il software, inizializzare lo strumento e scegliere l'opzione appropriata per visualizzare e catturare l'intero corpo del mouse.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionare i topi nella camera separata con isoflurano e garantire una profondità di anestesia ottimale con un pizzico di punta. Iniettare i topi per via intraperitoneale con 200 μL di 30 mg/mL di luciferina.</li>
	<li>Trasferire lo stomaco dei topi fino al naso della camera di imaging fornito di ossigeno e isoflurano. Blocca la camera e scegli un'esposizione di 2 minuti per avviare l'imaging.</li>
	<li>Utilizzare lo strumento ROI (regione di interesse) del software per quantificare il segnale bioluminescente del tumore.</li>
	<li>Per analizzare le dimensioni del tumore, scegliere lo strumento forma del cerchio, adattarlo alla forma e alle dimensioni del tumore. Misura il ROI e riporta le letture totali.</li>
	<li>Consentire la crescita del tumore solido per 12-14 giorni (o fino a quando la luciferasi raggiunge circa 7,0 x 106 unità) (Figura 1B) prima di generare fette di cervello. NOTA: Aumentare il numero di cellule da iniettare porterà a una crescita tumorale più rapida; pertanto, la generazione di fette di cervello può avvenire prima di 12 giorni. D'altra parte, un tumore più grande porterà a più fette di GFP + se lasciato crescere per 14 giorni. Dopo 14 giorni, la salute dei topi inizia a deteriorarsi rapidamente; quindi il monitoraggio della salute degli animali dovrebbe essere aumentato a una volta al giorno dopo il punto temporale di 10 giorni e tutti i topi che mostrano segni di dolore e / o disagio dovrebbero essere usati per generare le fette.</li>
</ol>2. Genera fette di cervello
NOTA: Eseguire i passaggi dopo l'isolamento cerebrale in una cappa a flusso laminare sterile. È tipicamente possibile generare 35-40 singole fette contenenti cellule tumorali (segnale luciferasi) da un topo iniettato con cellule MDA-MB-231BR (Figura 1C).
<ol><li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave. Posizionare l'affettatrice per tessuti nella cappa a flusso laminare sterile e pulire tutti gli strumenti e gli strumenti con etanolo al 70%.</li>
	<li>Dopo 12-14 giorni dall'iniezione intracranica di cellule MDA-MB-231BR, anestetizzare i topi secondo il protocollo di cura degli animali degli utenti come descritto in 1.2. Garantire una profondità di anestesia ottimale con un pizzico della punta.</li>
	<li>Rimuovere e posizionare rapidamente il cervello (entro 45 s) in saccarosio-ACSF ghiacciato (4 °C) composto dai seguenti: 280 mM saccarosio, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 20 mM glucosio, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-ascorbato, 3 mM tiourea, 2 mM Na+, 29 mM piruvato; pH=7,3.</li>
	<li>Usando un bisturi affilato e sterile o una lama di rasoio, taglia via le parti in eccesso del cervello che non contengono alcun tumore da tutti i lati, compresa la parte inferiore del cervello.</li>
	<li>Porta la forma del cervello in un cubo non perfetto per sederti piatto sulla carta da filtro bagnata ACSF su un coperchio del piatto da 60 mm per facilitare l'affettamento. NOTA: Il tessuto extra del cervello in cui è improbabile che il tumore sia cresciuto viene rimosso prima dell'affettamento per consentire la generazione di fette per lo più GFP + e creare una forma del cervello stabile sulla superficie dello strumento e non sarà perturbata dalle vibrazioni causate dall'affettamento.</li>
	<li>Posizionare diversi fogli di cerchi di carta da filtro pre-bagnati (con ACSF) sulla piattaforma di taglio e posizionare il tessuto bloccato sopra questo.</li>
	<li>Impostare la dimensione del taglio sullo strumento su 2 o 2,5 unità sul righello fornito per tagliare il tessuto in sezioni da 200-250 μm. NOTA: le fette fino a 350 μm o sottili fino a 100 μm sono vitali. Per le fette <200 μm, utilizzare un vibratoma o un compresstome.</li>
	<li>Utilizzare un pennello (zibellino) per trasferire le fette di cervello in un piatto contenente saccarosio ACSF e separare le fette al microscopio ottico usando aghi da 27 G.</li>
	<li>Identificare le fette GFP positive al microscopio fluorescente e trasferirle in un nuovo piatto da 60 mm contenente 2-3 ml di slice media per adulti (mezzo neurobasale A, supplemento B12 al 2%, supplemento N2 all'1%, glutammina all'1%, glucosio allo 0,5%, penicillina 10 U/mL e streptomicina da 100 μg/mL) utilizzando una pipetta sterile da 1 mL rotta (ampia apertura). NOTA: Le fette di cervello che contengono cellule tumorali che crescono sulla superficie del cervello (forse a causa di perdite di cellule di iniezione, ecc.) sono escluse.</li>
	<li>Trasferire 3-5 fette su ogni coltura tissutale da 30 mm, 0,4 μm di dimensioni dei pori, inserire in piastre a 6 pozzetti a una distanza che non consente di crescere l'una nell'altra.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo in eccesso dalla superficie dell'inserto utilizzando una pipetta P1000, aggiungere 1 mL di mezzo di fetta di topo adulto sotto ciascun inserto ed equilibrare il supporto nell'incubatrice prima dell'affettatura.</li>
	<li>Incubare i tessuti a 37 °C, 5% CO2 e 95% di umidità per 24 ore prima dell'imaging.</li>
</ol>3. Imaging IVIS delle fette
NOTA: Eseguire le fasi di aggiunta di luciferasi e inibitori in una cappa a flusso laminare sterile.
<ol><li>Pipettare 5 μL di 30 mg/mL di soluzione di luciferina nel mezzo sotto gli inserti sollevando l'inserto con una pinza e rimettendolo nel pozzetto dopo l'aggiunta di luciferina al supporto nel pozzo.</li>
	<li>Posizionare la piastra a 6 pozzetti con il coperchio all'interno della camera di imaging dello strumento sotto la telecamera fissa e bloccare la porta della camera.</li>
	<li>Aprire il software e inizializzare lo strumento.</li>
	<li>Scegli le impostazioni della fotocamera che consentono la visualizzazione e l'acquisizione di un solo pozzo per immagine. Spostare il palco verso l'alto (FOV di 5 cm) e posizionare il pozzetto che deve essere ripreso direttamente sotto la fotocamera.</li>
	<li>Impostare il tempo di imaging al più appropriato a seconda dell'intensità della luciferasi che il tumore emetterà, che può variare da 10 s a 5 min. Inizia con l'impostazione su 10 s e poi aumenta se il segnale è basso, ma mantienilo coerente per tutti i punti temporali e le condizioni fino alla fine dell'esperimento (Figura 1D).</li>
	<li>Utilizzare lo strumento ROI (strumento forma circolare), adattarlo alla forma e alle dimensioni del tumore, misurare il ROI e riportare le letture totali per quantificare il segnale bioluminescente di ciascun tumore sulla fetta.</li>
	<li>Riportare la piastra nella cappa a flusso laminare sterile, utilizzare una pinza per sollevare leggermente l'inserto dal pozzo.</li>
	<li>Aspirare il mezzo, sostituirlo con 1 ml di mezzo fresco e riposizionare l'inserto nel pozzetto.</li>
	<li>Per gli esperimenti in cui le fette vengono trattate con vari composti come inibitori, metaboliti, ecc., Preparare la concentrazione appropriata del reagente in 1,2 ml di terreno di fetta di cervello in un tubo da 1,5 ml e quindi trasferire 1 mL al pozzo contenente la fetta.</li>
	<li>Ripetere questo processo ogni 48 ore per tutta la durata dello studio.</li>
</ol>4. Imaging dal vivo della crescita tumorale in fette di cervello ex vivo
NOTA: inserire di alimentazione con un supporto sufficiente (1,5 ml) per durare la durata dell'esperimento in quanto non è possibile aggiungere ulteriore supporto durante l'imaging dal vivo.
<ol><li>Posizionare la piastra a 6 pozzetti sul supporto automatico della piastra del microscopio all'interno dell'incubatore (37 °C, 5% CO2 e 95% di umidità).</li>
	<li>Apri il software, attiva brightfield sul primo quadrante per regolare l'esposizione necessaria per visualizzare le fette. Per trovare la posizione (coordinate "xy") della fetta, navigare con "xy" sul secondo quadrante per controllare le coordinate "xyz" del microscopio.</li>
	<li>Selezionare la piastra a 6 pozzetti come labware utilizzato per questo esperimento. Seleziona l'editor di mappe ROI e registra quella posizione selezionando un nuovo ROI, aggiungi e salva quel ROI.</li>
	<li>Ripetere gli stessi passaggi per tutte le altre regioni di interesse in altri pozzi. Dopo aver aggiunto tutti i ROI, salva tutti i ROI.</li>
	<li>In Protocollo, selezionare Cancella esistente e selezionare Time-Lapse in Acquisizione, quindi selezionare i canali di interesse (in questo caso GFP).</li>
	<li>Disattivate la messa a fuoco automatica nella configurazione della messa a fuoco e regolate manualmente la messa a fuoco appropriata per tutte le sezioni. Infine, regolare l'intensità del campo luminoso e l'eccitazione del canale fluorescente e il tempo di esposizione al livello appropriato.</li>
	<li>Impostare il protocollo per acquisire immagini ogni 15 minuti per 48 ore.</li>
	<li>Salvare ed eseguire il protocollo. Al termine dell'esperimento, il file salvato conterrà sia le immagini brightfield che quelle GFP acquisite per ogni ROI.</li>
	<li>Per combinare le immagini in un video, rinominare tutte le immagini di interesse con lo stesso nome seguito da un numero binario per organizzarle nell'ordine in cui sono state acquisite (ad esempio, ROI1 (1), RO1 (2) ...)</li>
	<li>Apri ImageJ e importa le immagini facendo clic su File > Importa > sequenza di immagini. Selezionare i nomi dei file visualizzati in un elenco e scrivere il contenuto del nome dei file nella casella Nome file contiene che verrà visualizzata per identificare i file selezionati per il video.</li>
	<li>Salva le immagini combinate in File > Salva con nome > AVI.</li>
</ol>5. Test MTS e immunoistochimica del tessuto cerebrale ex vivo
<ol><li>TEST MTS<ol>
<li>Asportare le fette tagliando la membrana di coltura tissutale sotto ogni fetta lungo i bordi del tessuto e trasferire il tessuto, ancora attaccato alla membrana, in una piastra a 96 pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere il reagente MTS miscelato in rapporto 1:5 con terreno di coltura e tritone allo 0,01% (1x) per consentire la penetrazione della soluzione nel tessuto, in un volume totale di 120 μL in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Utilizzare il 4% di paraformaldeide (PFA) come agente per rendere le fette di cervello inaccessibili, e quindi un controllo positivo per questo esperimento. Immergere la fetta di cervello di interesse in PFA al 4% per 1 ora a RT (temperatura ambiente) o durante la notte a 4 °C prima di procedere con il test MTS.</li>
		<li>Lasciare che il reagente MTS reagisca sulle fette per 4 ore, rimuovere le fette dai pozzetti e misurare l'assorbanza a 490 nm per tutte le condizioni, incluso un pozzo vuoto senza fetta come riferimento.</li>
		<li>Riportare le letture in funzione dell'area della fetta di tessuto, misurata con un righello a pinza digitale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione immunoistochimica<ol>
<li>Immergere le fette di cervello attaccate alla superficie dell'inserto della membrana in formalina al 10% durante la notte a 4 °C.</li>
		<li>Eseguire l'incorporamento, l'elaborazione, il blocco e generare vetrini non macchiati del tessuto. Utilizzare il protocollo di colorazione immunoistochimica standard per colorare H&E, Ki-67, gamma-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Irradiazione del tumore in fette di cervello ex vivo
<ol><li>Irradiare il tumore con 6 Gy (raggi X 310 kVp). NOTA: Le unità inserite per ottenere la dose totale di 6 Gy sono 3522 unità dopo aver considerato le unità R (misurate utilizzando l'elettrometro Victoreen) e le correzioni per il ditale, la densità dell'aria e il cGy / R come precedentemente descritto18. Il tempo di esposizione è di 130,9 s.</li>
	<li>Utilizzare 0,25 mm Cu + 1 mm Al filtrazione aggiunta, 50 cm SSD, 125 cGy al minuto.</li>
	<li>Eseguire la dosimetria mediante una camera di ionizzazione in-the-beam calibrata rispetto a uno standard primario.</li>
	<li>Apportare correzioni giornaliere per umidità, temperatura e pressione barometrica.</li>
</ol>

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<li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017(2012).</li>
<li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metastasis+cell+lines+panel%3A+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti finanziari da dichiarare.

Questo studio stabilisce un nuovo metodo di coltura cerebrale ex vivo per i tumori cerebrali allo xenotrapianto espiantato. Mostriamo che le cellule BCBM MDA-MB-231BR iniettate intracranicamente nel cervello dei topi possono sopravvivere e crescere in fette di cervello ex vivo . Lo studio ha anche testato le cellule di glioblastoma U87MG iniettate intracranicamente (GBM) e ha anche scoperto che queste cellule tumorali sopravvivono e crescono in fette di cervello (dati non mostrati). Riteniamo che questo...

Le metastasi cerebrali del cancro al seno (BCBM) si sviluppano quando le cellule si diffondono dal tumore mammario primario al cervello. Il cancro al seno è la seconda causa più frequente di metastasi cerebrali dopo il cancro del polmone, con metastasi che si verificano nel 10-16% dei pazienti1. Sfortunatamente, le metastasi cerebrali rimangono incurabili poiché >80% dei pazienti muore entro un anno dalla diagnosi di metastasi cerebrali e la loro qualità di vita è compromessa a causa di disfunzioni neurologiche2. C'è un urgente bisogno di identificare opzioni di trattamento più efficaci. I modelli di coltura monostrato bidimensionali o tridimensionali sono i metodi più comunemente usati per testare gli agenti terapeutici in laboratorio. Tuttavia, non imitano il complesso microambiente BCBM, uno dei principali driver del fenotipo tumorale e della crescita. Sebbene questi modelli siano utili, non catturano le complesse interazioni tumore-stromale, i requisiti metabolici unici e l'eterogeneità dei tumori3. Per ricapitolare più fedelmente le interazioni tumore-stromale e l'eterogeneità del microambiente, il nostro gruppo e altri hanno iniziato a generare metastasi cerebrali organotipiche "slice" colture con cellule tumorali derivate dal paziente (primarie o metastatiche) o linee cellulari tumorali 4,5,6. Rispetto ai sistemi classici in vitro, questo modello ex vivo a breve termine può fornire condizioni più rilevanti per lo screening di nuove terapie prima della valutazione preclinica in grandi coorti di animali.
Modelli ex vivo sono stati costruiti e utilizzati con successo principalmente per l'identificazione di trattamenti di successo di vari tumori. Richiedono alcuni giorni di valutazione e inoltre possono essere adattati allo screening farmacologico specifico del paziente. Ad esempio, i tessuti ex vivo del cancro della vescica e della prostata umano hanno mostrato una risposta antitumorale dose-dipendente di docetaxel e gemcitabina7. Simili tessuti di carcinoma colorettale ex vivo sono stati sviluppati per lo screening dei farmaci chemioterapici Oxaliplatino, Cetuximab e Pembrolizumab8. Questa applicazione è stata ampiamente utilizzata nel cancro del pancreas, considerando l'interazione essenziale tra l'ambiente stromale e le caratteristiche genotipiche e fenotipiche dell'adenocarcinoma duttale pancreatico 9,10. Inoltre, tali modelli organotipici sono stati sviluppati per screening simili nei tumori della testa, del collo, gastrici e della mammella11,12.
Qui, viene generato un modello ex vivo di fette di cervello di cellule tumorali metastatiche cerebrali xenografate del cancro al seno nel loro microambiente. I topi sono stati iniettati intracranicamente con carcinoma mammario cerebrale metastatico trofico mdA-MB-231BR cellule13 nel lobo parietale della corteccia cerebrale - un sito comune di metastasi TNBC14,15 e permesso di sviluppare tumori. Le fette di cervello sono state generate da questi animali xenografati e mantenute ex vivo come colture organotipiche come descritto16,17. Questo nuovo modello ex vivo consente l'analisi della crescita delle cellule BCBM all'interno del parenchima cerebrale e può essere utilizzato per testare agenti terapeutici ed effetti delle radiazioni sulle cellule tumorali all'interno del microambiente cerebrale.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 mL, punta scorrevole</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 aghi G1/2 BD</td><td></td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Genessee</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio automatizzato e software LUMAVIEW</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>B27 (GEM21)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-160</td><td></td></tr><tr><td>Becher 50 mL</td><td>Fisher</td><td>10-210-685</td><td></td></tr><tr><td>Pennello smussato di zibellino, misura #5/0</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>66100-50</td><td></td></tr><tr><td>Cera ossea</td><td>ModoMed</td><td>DYNJBW25</td><td></td></tr><tr><td>Siringa per iniezione cerebrale</td><td>Hamilton Company</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-250</td><td></td></tr><tr><td>Caspasi scissa 3 Segnalazione cellulare anticorpale</td><td></td><td>14220S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin Sale di Potassio</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio a doppio taglio</td><td>VWR</td><td>55411-060(95-0043)</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro , cerchi quantitativi, 4,25 cm</td><td>Fisher</td><td>09-805a (1001-042)</td><td></td></tr><tr><td>Pennello di zibellino fine #2/0</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>66100-20</td><td></td></tr><tr><td>Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Gamma-H2AX</td><td>Anticorpo Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Anticorpo Thermo Fisher</td><td>13-0300</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9996</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina (200 mM)</td><td>Corning cellgrow</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>H& E e KI-67</td><td>Jefferson Core Facility Pathology Coloring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hand Drill Set con Micro Mini Twist Drill Bit</td><td>Amazon</td><td>YCQ2851920086082DJ</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, acido libero</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-1</td><td></td></tr><tr><td>Solo per topi Stereotaxic Frame</td><td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td><td>72-6049, 72-6044</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche grandi</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>14001-18</td><td></td></tr><tr><td>Celle MDA-MB-231BR</td><td>Gentilmente fornito dalla dott.ssa Patricia Steeg</td><td>Rif. 14</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di imaging per mouse</td><td>Perkin Elmer</td><td>Sistema</td><td></td>IVIS 200</tr><tr><td>Software per l'imaging dei topi</td><td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td><td>Living Image Software</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Tecan Spark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di montaggio</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Reagente MTS</td><td>Promega CellTiter 96 Aquoous One Solution</td><td>(Cat:G3582)</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento di N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nu/Nu topi atimici</td><td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>145140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sutura in polipropilene</td><td>Medex supply</td><td>ETH-8556H</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodio Tampone bastoncini</td><td>DME Supply USA</td><td>Cat: 689286X</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi #11 (confezione da 100)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Spatola/sonda</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-13</td><td></td></tr><tr><td>SS Lame da barba non rivestite a doppio taglio (American safety razor co (95-0043))</td><td>VWR</td><td>55411-060</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td> chirurgico <td>Sucrose Amresco</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exelint International</td><td>D29702</td><td></td></tr><tr><td>Tritatessuti</td><td>Brinkman</td> <td>(tipo McIlwain)</td><td></td></tr><tr><td>Inserti per colture tissutali</td> Macchina a <td>raggi X PICMORG50 o PICM03050</td><td></td><td>Millipore</td></tr><tr><td></td><td>Precisione 250 kVp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di fetta di cervello ex vivo per studiare e indirizzare la crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Le metastasi cerebrali sono una grave conseguenza del cancro al seno per le donne in quanto questi tumori sono difficili da trattare e sono associati a scarsi risultati clinici. I modelli murini preclinici di crescita metastatica cerebrale del cancro al seno (BCBM) sono utili ma sono costosi ed è difficile tracciare le cellule vive e l'invasione delle cellule tumorali all'interno del parenchima cerebrale. Qui viene presentato un protocollo per colture di fette di cervello ex vivo da topi xenografati contenenti sottolinee clonali di ricerca cerebrale per cancro al seno iniettato intracranicamente. Le cellule marcate con luciferasi MDA-MB-231BR sono state iniettate intracranicamente nel cervello dei topi femmina Nu / Nu e, dopo la formazione del tumore, i cervelli sono stati isolati, affettati e coltivati ex vivo. Le fette tumorali sono state fotografate per identificare le cellule tumorali che esprimono luciferasi e monitorare la loro proliferazione e invasione nel parenchima cerebrale per un massimo di 10 giorni. Inoltre, il protocollo descrive l'uso della microscopia time-lapse per visualizzare la crescita e il comportamento invasivo delle cellule tumorali dopo il trattamento con radiazioni ionizzanti o chemioterapia. La risposta delle cellule tumorali ai trattamenti può essere visualizzata mediante microscopia live-imaging, misurando l'intensità della bioluminescenza ed eseguendo l'istologia sulla fetta di cervello contenente cellule BCBM. Pertanto, questo modello di slice ex vivo può essere una piattaforma utile per la sperimentazione rapida di nuovi agenti terapeutici da soli o in combinazione con radiazioni per identificare farmaci personalizzati per indirizzare la crescita metastatica del cervello del cancro al seno di un singolo paziente all'interno del microambiente cerebrale.

Le cellule mdA-MB-231BR-GFP-luciferasi sono state iniettate intracranicamente nell'emisfero destro di topi Nu/Nu di 4-6 settimane come spiegato sopra (Figura 1A) e sono state lasciate crescere per 12-14 giorni, durante i quali la crescita tumorale è stata monitorata mediante imaging a bioluminescenza (Figura 1B). Abbiamo iniettato 100.000 cellule tumorali in modo intracranico come riportato da altri gruppi19, ma è possibile iniettare fino...

Introduciamo un protocollo per misurare in tempo reale la risposta ai farmaci e alle radiazioni delle cellule metastatiche cerebrali del cancro al seno in un modello organotipico di fetta di cervello. I metodi forniscono un test quantitativo per studiare gli effetti terapeutici di vari trattamenti sulle metastasi cerebrali da cancro al seno in modo ex vivo all'interno dell'interfaccia del microambiente cerebrale.

Un modello di fetta di cervello Ex Vivo per studiare e indirizzare la crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Questo protocollo consente la formazione di cellule tumorali metastatiche cerebrali e la generazione di fette di cervello ex vivo che consentono di testare rapidamente l'efficacia del farmaco e le radiazioni su un tumore preformato. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di testare rapidamente più farmaci o trattamenti in un ambiente fisiologicamente rilevante che mantiene le interazioni cervello-tumore-ospite. Questo metodo può aiutare a capire come le cellule metastatiche del cervello crescono, sopravvivono e invadono il parenchima cerebrale e comprendere il ruolo del microambiente tumorale cerebrale nella crescita e nella diffusione del cancro.A dimostrare la procedura saranno Lorela Ciraku ed Emily Esquea, entrambe dottorande del mio laboratorio. Per iniziare, con posizionare i mouse anestetizzati in una cornice stereotassica e immobilizzare la testa usando le barre auricolari standard. Sterilizzare la superficie della testa tre volte mediante l'applicazione ripetuta alternata di tamponi di iodio e 70% di etanolo prima dell'incisione.Usando un bisturi chirurgico, fai un'incisione della linea mediana di un centimetro con un angolo diagonale rispetto all'asse immaginario dividendo il cervello dei topi in due metà simmetriche per esporre il cranio. Dopo aver asciugato il sangue con un batuffolo di cotone, deviare la pelle lateralmente per esporre il sito di iniezione. Utilizzare una punta di bava da 0,73 millimetri per penetrare nel cranio e praticare un foro con una leggera pressione e movimento di torsione.Per iniettare cinque microlitri di cellule che esprimono stabilmente la GFP luciferasi, inserire una siringa ad alta precisione a 3,5 millimetri di profondità nel cervello. Lasciare riposare per due minuti e poi tirare la siringa verso l'alto di circa un millimetro. Dopo due minuti, iniettare lentamente il primo mezzo volume e attendere altri due minuti prima di iniettare il resto del volume.Dopo tre minuti, tirare lentamente la siringa. Applicare la cera ossea sul sito di iniezione sul cranio e suturare il tessuto con suture in polipropilene. Monitorare periodicamente il comportamento del topo subito dopo l'intervento chirurgico per determinare se sono necessari trattamenti speciali, tra cui iniezione salina e cibo morbido, per aiutare un rapido recupero.Per monitorare la crescita del tumore tramite l'imaging a bioluminescenza, accendere prima l'ossigeno e l'isoflurano sul sistema di imaging e consentire che entrambi vengano distribuiti nella camera separata al di fuori della scatola di imaging. Quindi, dopo aver acceso il software e inizializzato lo strumento, scegliere l'opzione appropriata per visualizzare e catturare l'intero corpo del mouse. Quindi, trasferire i topi nella camera all'esterno della scatola di imaging fornita con ossigeno e isoflurano.Una volta che i topi sono sotto l'effetto anestetico, iniettare i topi per via intraperitoneale con 200 microlitri di 30 milligrammi per millilitro di luciferina. Posizionare i topi nella camera di imaging con lo stomaco rivolto verso il basso verso il labbro del naso delle camere di imaging. Bloccare la camera, scegliere due minuti di esposizione per avviare l'imaging e quindi completare l'imaging.Dopo aver posizionato l'affettatrice per tessuti in una cappa a flusso laminare sterile, pulire tutti gli strumenti e gli strumenti con etanolo al 70%. Dopo l'eutanasia del topo, rimuovere e posizionare rapidamente il cervello in una soluzione ghiacciata di saccarosio-ACSF. Usando una spatola, trasferire il cervello su una carta da filtro bagnata ACSF su un coperchio del piatto da 60 millimetri.Usando una lama di rasoio affilata e sterile, taglia le parti in eccesso del cervello che non contengono alcun tumore, compresa la parte inferiore del cervello, per portare la forma del cervello a un cubo non perfetto. Dopo aver posizionato diversi fogli di carta da filtro bagnata ACSF sulla piattaforma di taglio, posizionare il tessuto bloccato sulla carta da filtro. Per affettare il tessuto in sezioni spesse da 200 a 250 micrometri, impostare la dimensione del taglio su 2 o 2,5 unità sul righello del fornitore e iniziare a tagliare.Usa un pennello per trasferire le fette di cervello in un piatto contenente saccarosio-ACSF e separa le fette al microscopio ottico usando aghi calibro 27. Identificare le fette GFP-positive al microscopio fluorescente. Quindi, utilizzando una pipetta sterile rotta da un millilitro con un'ampia apertura, trasferire le fette identificate in un nuovo piatto da 60 millimetri contenente da due a tre millilitri di media a fette per adulti.Quindi, trasferire da tre a cinque fette su ogni inserto di coltura tissutale in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti a distanza di sicurezza. Dopo aver rimosso il mezzo in eccesso dalla superficie dell'inserto, aggiungere un millilitro di mezzo di fetta di topo adulto equilibrato sotto ogni inserto. Incubare i tessuti a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità per 24 ore prima dell'imaging.Pipettare cinque microlitri da 30 milligrammi per millilitro di soluzione di luciferina nel mezzo sotto gli inserti all'interno di un cappuccio sterile. Posizionare la piastra a sei pozzetti con il coperchio all'interno della camera di imaging dello strumento sotto la telecamera fissa e bloccare la porta della camera. Aprire il software e inizializzare lo strumento.Dopo aver scelto le impostazioni della fotocamera che consentono la visualizzazione e l'acquisizione di un solo pozzo per immagine, posizionare il pozzo da visualizzare direttamente sotto la fotocamera. Usa lo strumento ROI, adattalo alla forma e alle dimensioni del tumore, misura il ROI e riporta le letture totali per quantificare il segnale bioluminescente di ciascun tumore sulla fetta. Dopo aver riportato la piastra alla cappa a flusso laminare sterile, utilizzare una pinza per sollevare leggermente l'inserto dal pozzo.Dopo aver aspirato il mezzo, sostituire il mezzo con un millilitro di mezzo fresco e riposizionare l'inserto nel pozzetto. Per gli esperimenti in cui le fette sono trattate con vari composti, come inibitori e metaboliti, preparare la concentrazione appropriata di reagente in 1,2 millilitri di mezzo di fetta di cervello in un tubo da 1,5 millilitri, quindi trasferire un millilitro di reagente al pozzo contenente la fetta. Le cellule di luciferasi MDA-MB-231 BR-GFP sono state iniettate in topi nudi, i tumori sono stati lasciati crescere, i cervelli con tumori sono stati sezionati, affettati, cresciuti ex vivo e la crescita del tumore è stata monitorata mediante imaging a bioluminescenza.La colorazione H&E e la fluorescenza GFP-positiva hanno confermato la presenza di un tumore nella fetta di cervello. L'aumento della colorazione Ki-67 ha confermato la presenza di cellule tumorali altamente proliferative. I tumori nelle fette di cervello che non sono stati esposti all'irradiazione hanno continuato a crescere ex vivo, mentre i tumori esposti all'irradiazione hanno mostrato una crescita in stallo.Le fette di cervello contenenti tumori sono state monitorate anche tramite imaging dal vivo per visualizzare la crescita del tumore dopo il trattamento di irradiazione. Coerentemente con l'imaging bioluminescente, le cellule tumorali di controllo sono cresciute rapidamente con l'aumentare dell'intensità della GFP e le cellule hanno iniziato a invadere il parenchima cerebrale. Al contrario, le cellule tumorali nelle fette di cervello trattate con irradiazione erano citostatiche e l'intensità della GFP è stata mantenuta.Sono state rilevate grandi cellule tumorali multi-nucleate e un aumento della colorazione del marcatore di danno al DNA nelle cellule tumorali trattate con IR. Inoltre, è stato rilevato un aumento degli astrociti reattivi. L'apoptosi indotta dal trattamento IR non è stata rilevata nelle fette di cervello di topo prive di tumore.Le fette di cervello contenenti tumori sono state trattate con diverse concentrazioni di paclitaxel, un farmaco chemioterapico. Il trattamento ha ridotto significativamente le dimensioni del tumore dopo il giorno 10 del trattamento. Un aumento dell'apoptosi è stato rilevato nelle cellule tumorali trattate con paclitaxel.Il trattamento con inibitori non ha alterato la vitalità del tessuto cerebrale. Nessun aumento dell'apoptosi è stato misurato mediante colorazione di caspasi-3 scissa in fette di cervello di topo senza tumore trattate con paclitaxel. Quando il trattamento con i farmaci di interesse è terminato, le fette possono essere analizzate per l'espressione proteica attraverso immunocitochimica, studi omici o ottenere sospensioni unicellulari adatte alla citometria a flusso.

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Fonte: Ciraku, L., et. al. Un modello di fetta cerebrale ex vivo per studiare e mirare alla crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno. J. Vis. Exp. (2021). Questo video mostra l'imaging di cellule tumorali che esprimono luciferasi in una fetta di cervello di topo organotipico. La luciferina viene aggiunta al terreno e la piastra viene posizionata all'interno della camera del sistema di imaging in vivo. I parametri per l'acquisizione delle immagini vengono regolati e vengono...

Imaging a bioluminescenza per valutare la crescita tumorale in una fetta di cervello di topo organotipico

Un seno cancro al cervello metastasi modello del mouse viene stabilito con ecografia guidata iniezione intracardiaca delle cellule MDA-MB231/Br-GFP. Sviluppo delle metastasi intracraniche multifocali è stato monitorato longitudinalmente utilizzando ad alta risoluzione di 9.4 T MRI.

Ultrasound Imaging guidata intracardiaca iniezione di sviluppare un modello murino di Breast Cancer metastasi cerebrali Seguito da longitudinale MRI

Molti tipi di tumori cerebrali umani sono localizzati in regioni specifiche all'interno del cervello e sono difficili da coltivare in coltura. Questo protocollo affronta il ruolo del microambiente tumorale e studia nuovi trattamenti farmacologici analizzando le cellule tumorali cerebrali primarie fluorescenti che crescono in una fetta di cervello di topo organotipico.

Un tumore cerebrale / organotipica fetta sistema di co-coltura per lo Studio microambiente tumorale e mirata terapie farmacologiche

Cervello metastasi è diventato un bisogno medico non soddisfatto urgente come la sua incidenza è aumentata mentre le opzioni terapeutiche sono rimaste palliative. La creazione di modelli animali sperimentali di metastasi cerebrali tramite iniezione arteriosa intracarotidea delle cellule tumorali facilita gli studi meccanicistici della biologia della malattia e la valutazione dei regimi di intervento innovative.

Intracarotidea Cancer Cell iniezione per produrre modelli murini di cervello Metastasi

La modellazione della metastasi cerebrale intracraniciale è complicata dall'incapacità di monitorare le dimensioni del tumore e la risposta al trattamento con metodi precisi e tempestivi. La metodologia presentata accoppia l'iniezione di tumore intracranico con l'analisi della risonanza magnetica, che se combinata, coltiva iniezioni precise e coerenti, un monitoraggio degli animali migliorato e misurazioni accurate del volume tumorale.

Modellazione delle metastasi cerebrali attraverso l'iniezione intracraniciale e la risonanza magnetica

Qui, presentiamo un protocollo per preparare e cultare una barriera ematica del micro-ambiente tumorale metastatico e quindi quantificare il suo stato utilizzando l'imaging confocale e l'intelligenza artificiale (apprendimento automatico).

Quantificare il micro-ambiente del tumore metastatico del cervello utilizzando un modello 3D a chip Organ-On-A, apprendimento automatico e tomografia confocale

Descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali di cancro al seno generate tramite iniezione di vena della coda di una linea cellulare di carcinoma mammario infiammatorio amplificata endogenamente da HER2.

Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

Le metastasi cerebrali sono una causa di grave morbilità e mortalità nei pazienti oncologici. La maggior parte dei modelli murini di metastasi cerebrali sono complicati da metastasi sistemiche che confondono l'analisi della mortalità e dei risultati dell'intervento terapeutico. Presentato qui è un protocollo per l'iniezione carotidea interna di cellule tumorali che produce tumori intracranici coerenti con tumori sistemici minimi.

Modellazione delle metastasi cerebrali mediante iniezione interna di cellule tumorali nell'arteria carotide

Gli embrioni di pulcino sono utilizzati per studiare i tumori cerebrali del glioblastoma umano (GBM) in ovo e in co-colture di fette cerebrali ex vivo. Il comportamento delle cellule GBM può essere registrato mediante microscopia time-lapse in co-colture ex vivo, ed entrambi i preparati possono essere analizzati all'endpoint sperimentale mediante analisi confocale 3D dettagliata.

Utilizzo del cervello dell'embrione di pulcino come modello per analisi in vivo ed ex vivo del comportamento delle cellule di glioblastoma umano

La tecnica di iniezione intracranica stereotatattica consente l'impianto preciso e localizzato delle cellule tumorali nella corteccia del muro, rendendola un modello potente per studiare la colonizzazione metastatica del cervello.

Modellizzazione della metastasi cerebrale: analisi standardizzata della colonizzazione metastatica e dei modelli di crescita istologica tramite iniezione intracorticale stereotattica

Scopri un modello di fetta cerebrale ex vivo per testare farmaci e radiazioni sulle metastasi cerebrali da cancro al seno. Questo metodo mantiene le interazioni tumore-cervello-ospite in condizioni fisiologicamente rilevanti.

Un modello di fetta di cervello Ex Vivo per studiare e indirizzare la crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno (Video) | JoVE Journal

Un modello di fetta di cervello Ex Vivo per studiare e indirizzare la crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno

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