Screening cromosomico di embrioni umani preimpianto mediante l'utilizzo di terreno di coltura esausto: raccolta del campione e analisi della ploidia cromosomica

Il protocollo prevede la normalizzazione della raccolta del terreno di coltura e dell'analisi della ploidia cromosomica basata sullo screening cromosomico non invasivo NICS di embrioni umani preimpianto. Il vantaggio principale di NICS è la facilità d'uso rispetto alla micromanipolazione TiDieR, il risparmio di tempo e la riduzione efficace della perdita invasiva di campioni bioptici. Il metodo di campionamento è molto flessibile.

Qui ti offriamo due diverse opzioni, una per la coltura sequenziale di routine dell'embrione e un'altra per una fase. Questi sono i principali colleghi del nostro team, il Dr.Yaxin Yao e il Dr.Xiaohui Zhu sono principalmente responsabili della preparazione della libreria e del sequenziamento di rigenerazione NICS. Il Dr.Jialin Jia ed io completiamo il lavoro di embriologia e la raccolta dei campioni.

Il professor Liu è il leader del nostro gruppo. È anche l'autrice corrispondente di questo articolo. Per iniziare, prepara i reagenti e gli strumenti.

Preriscaldare ed equilibrare da 20 a 30 microlitri di terreno di coltura e ialuronidasi prima dell'uso. Quindi posizionare il terreno di coltura e la ialuronidasi su una superficie di lavoro in una cappa aspirante. Trasferire rapidamente gli OCCC digeriti nella piastra di coltura per la manipolazione degli ovociti e coprire con olio minerale in ogni pozzetto.

Aspirare delicatamente e rilasciare gli ovociti da cinque a 10 volte per rimuovere le cellule residue della granulosa intorno agli ovociti. Ripetere questo passaggio nei restanti tre pozzetti per rimuovere completamente le cellule della granulosa. Valutare la completezza della rimozione delle cellule della granulosa utilizzando un microscopio.

Quindi eseguire l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, chiamata anche ICSI e trasferire l'embrione nel terreno di coltura. Preparare da 20 a 30 microlitri di microgoccioline di terreno di coltura di blastocisti per ogni embrione. Coprire gli embrioni con olio minerale in un piatto di coltura tissutale il secondo giorno e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 5% di ossigeno.

Dopo aver trasferito l'embrione del terzo giorno nella microgoccia di lavaggio, aspirare delicatamente e rilasciare l'embrione nella microgoccia nelle tre goccioline in serie utilizzando le pipette. Quindi trasferire l'embrione nel terreno di coltura della blastocisti. Preparare le microgoccioline di lavaggio e le microgoccioline di coltura.

Nel pomeriggio del quarto giorno, trasferire l'embrione in microgoccioline preriscaldate di terreno di coltura e lavare delicatamente ogni embrione in serie in tre microgoccioline con le pipette. Trasferire ogni embrione in un'unica microgocciolina singola preriscaldata di terreno di coltura per la raccolta del campione. Coltivare l'embrione di blastocisti prima della crioconservazione.

Per eseguire la vitrificazione prima della crioconservazione dell'embrione, preparare le microgoccioline di coltura e trasferire l'embrione in microgoccioline preriscaldate da 10 a 15 microlitri di terreno di coltura. E lavare delicatamente ogni embrione in serie in tre microgoccioline pipettando la mattina del quinto giorno. Come dimostrato in precedenza, trasferire ogni embrione in un'unica microgoccia singola preriscaldata di terreno di coltura per la raccolta del campione.

E coltivare l'embrione di blastocisti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica prima della crioconservazione. Successivamente, regolare delicatamente l'ICM a una distanza considerevole dal punto mirato del raggio laser che si concentra sulla giunzione cellulare del trofoectoderma per generare un piccolo foro nel trofoectoderma per rilasciare il fluido dalla cavità del blastocele. Per raccogliere il campione, scongelare il tampone nel kit a temperatura ambiente e centrifugare brevemente.

Quindi trasferire il terreno di coltura da ciascun embrione coltivato in una provetta PCR priva di RNasi-DNasi contenente cinque microlitri di tampone di lisi cellulare. Preparare i reagenti e gli strumenti. Dopo aver quantificato il DNA genomico diluito a una concentrazione di 50 picogrammi per microlitro con il terreno di coltura.

Dopo aver mescolato accuratamente, centrifugare brevemente la provetta a 200 G per cinque secondi. Dopo aver centrifugato il terreno di coltura in una microcentrifuga per 30-60 secondi, pipettare 10 microlitri di terreno di coltura dal fondo della provetta diluito per il controllo positivo e il terreno di coltura fresco in una nuova provetta PCR da 0,2 millilitri. Aggiungere un microlitro di miscela di enzimi MT e mescolare accuratamente mediante pipettaggio.

Quindi centrifugare immediatamente per due o tre secondi. Mettere la provetta PCR in una stazione di preparazione del campione misto preriscaldata ed eseguire il programma di lisi. Una volta che il tampone pre-lib è scongelato e miscelato, centrifugarlo immediatamente per due o tre secondi a 200 G.Preparare una miscela master per la reazione di pre-libreria aggiungendo due microlitri di miscela enzimatica di pre-libreria a 60 microlitri di tampone di pre-libreria.

Mescolare accuratamente la reazione e centrifugare brevemente. Aggiungere 60 microlitri di miscela di reazione pre-libreria nel campione di terreno pretrattato. Dopo aver miscelato accuratamente mediante pipettaggio, centrifugare immediatamente per due o tre secondi a 200 G.Posizionare la provetta PCR nella stazione di preparazione del campione preriscaldata.

Esegui il programma pre-libreria e mantieni la temperatura di quattro gradi Celsius. Preparare una miscela master per la reazione di libreria aggiungendo 1,6 microlitri di miscela di enzimi di libreria a 60 microlitri di tampone di libreria. Mescolare accuratamente la reazione e centrifugare come dimostrato in precedenza.

Aggiungere 60 microlitri della miscela di reazione della libreria e due microlitri del primer del codice a barre a ciascun prodotto della pre-libreria. Quindi mescolare accuratamente la reazione e centrifugare come dimostrato. Dopo la centrifugazione, posizionare la provetta PCR nel termociclatore.

Esegui il programma di preparazione della libreria e poi mantieni la temperatura di quattro gradi Celsius. Preparare i reagenti e gli strumenti. Aggiungi le mega perline preparate 1X al campione della libreria.

Quantificare le librerie purificate come descritto nel manoscritto del testo e utilizzare 10 nanogrammi di ciascun campione di libreria per il pooling. Fare riferimento alla guida per l'utente del sequenziamento ed eseguire l'analisi dei dati al termine del sequenziamento. Inserisci il nome e la password dell'utente nella pagina di accesso per l'analisi dei dati in ChromGo.

Una volta effettuato l'accesso, fare clic su Crea invio nella scheda NICS. Quindi scegli NGS per la piattaforma, Illumina per Corporation e NICSInst per il reagente. Immettere le informazioni sul progetto nella casella in ID progetto.Impostare le preferenze di analisi e caricare i file.

Una volta caricati correttamente tutti i file di sequenziamento, fare clic su Invia per avviare l'analisi. I progetti inviati sono elencati nella scheda Visualizza invii. Fare clic sul pulsante Mostra nel campo Report per visualizzare la tabella riepilogativa dell'analisi NICS.

Fare clic sul pulsante Esporta report per salvare i report. Sei blastocisti sono state ottenute da pazienti e la NICS è stata eseguita su tutti e sei gli embrioni dal quarto al quinto giorno. Le anomalie cromosomiche causate dalla traslocazione bilanciata dei genitori sono state rilevate in cinque dei cromosomi utilizzando il test NICS e quindi non sono stati utilizzati per il trasferimento.

I risultati NICS dei due embrioni hanno mostrato che la stessa delezione del cariotipo 45 XN e del cromosoma 18 erano entrambe delezioni del cromosoma 18. Il braccio corto del cariotipo 46 XN della delezione della regione del cromosoma uno era solo il braccio corto della delezione della regione cromosomica. I risultati del NICS hanno mostrato il cariotipo 46 XN con il braccio lungo della delezione della regione del cromosoma 18 e il braccio corto della duplicazione della regione del cromosoma uno.

Sebbene i cariotipi fossero duplicazioni del cromosoma cinque e mostrassero otto differenze di mosaico, il test NICS è stato in grado di esaminare tutti i 24 cromosomi per l'aneuploidia. Questo processo fornisce un nuovo metodo per il trasferimento di singole blastocisti cariotipiche normali. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di rimuovere completamente le cellule cumulari per evitare la contaminazione di origine materna e raccogliere il terreno di coltura e lo stadio di blastocisti esposto quando il contenuto di DNA è sufficiente per l'amplificazione.

Utilizzando la tecnologia NICS, il presente studio ha semplificato le fasi di preparazione della libreria WGA e WGS in circa tre ore e ha optato per il risultato CCS in modo non invasivo in circa nove ore. Dopo il suo sviluppo, la tecnica ha fornito ai medici in ART un nuovo modo per combinare la valutazione morfologica con la NICS per trasferire l'embrione aploidico con una buona morfologia nell'utero potrebbe migliorare i tassi di gravidanza in corso e i tassi di nati vivi.