Name: Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Scopri il protocollo per espandere cellule T Gamma-Delta da aferesi umana per terapie anticancro. Questo metodo raggiunge oltre 200.000 espansioni, ottenendo prodotti cellulari puri per applicazioni cliniche contro leucemia mieloide acuta.

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Ringraziamo il Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity del Moffitt Cancer Center per aver fornito i finanziamenti per lo sviluppo di questo protocollo. Ringraziamo anche il Dr. Claudio Anasetti per il suo inestimabile aiuto e guida attraverso questo progetto. Infine, ringraziamo il Dr. Justin Boucher per le sue intuizioni e la revisione del manoscritto.

NOTA: è stata ottenuta l'approvazione dell'IRB e il consenso informato è stato ottenuto dai donatori.
1. Isolamento dei linfociti
<ol><li>Trasferire il prodotto di aferesi in una camera bianca. NOTA: la convalida del processo è stata eseguita utilizzando la normale aferesi del donatore da un fornitore commerciale esterno conforme alle normative sulla raccolta delle materie prime cellulari.</li>
	<li>Raccogliere campioni per test di sterilità, conteggio cellulare e fenotipizzazione cellulare.</li>
	<li>Elutriato sul dispositivo di centrifugazione controcorrente utilizzando un mezzo primario di Hanks Balanced Salt Solution con albumina sierica umana all'1% (HSA) e un mezzo secondario di soluzione salina (0,9% di cloruro di sodio injection USP) o soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Impostare la velocità di centrifugazione di elutrazione a 900 × g e raccogliere frazioni in base alla portata e al tempo.</li>
	<li>Raccogliere campioni dalla frazione 2 ed eseguire i seguenti test: 2 ml per test di sterilità; 0,5 mL per la conta cellulare e la vitalità con acridina arancio/ioduro di propidio (AO/PI); 5 × 106 cellule per la fenotipizzazione cellulare mediante citometria a flusso.</li>
	<li>Espandere una frazione linfocitaria pura (frazione 2) di cellule in coltura a 10 × 106 cellule/cm2 in un bioreattore a sistema chiuso da 1 L con 5 μmol/L di acido zoledronico e 300 UI/mL di IL-2.</li>
	<li>Incubare per sette giorni in un incubatore impostato a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
</ol>2. Deplezione delle cellule T alfa-beta (αβ)
<ol><li>Raccogliere le cellule dal pallone del bioreattore a sistema chiuso da 1 L. Saldare sterili un pacco di trasferimento da 1 L alla linea rossa del bioreattore a sistema chiuso e utilizzare la pompa farmaceutica appropriata per trasferire le cellule nel pacchetto di trasferimento.</li>
	<li>Prelevare i seguenti campioni: 10 ml per sterilità media esaurita; 0,5 mL di cellule per la conta e la vitalità delle cellule utilizzando AO/PI; 5 × 106 cellule per citometria a flusso</li>
	<li>Risospese le cellule a ~ 5 × 108 cellule / mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o (PBS / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)) tampone + 0,5% HSA e anticorpo biotinilato TCR αβ-specifico.</li>
	<li>Mettere lo shaker in frigorifero e incubare le cellule a 2-8 °C per circa 15 minuti con agitazione.</li>
	<li>Lavare le celle con un totale di 600 ml di tampone PBS/EDTA + 0,5% HSA. Centrifugare per rimuovere l'anticorpo non legato a 200-500 × g per 15 minuti a 2-8 °C. Risospeso ~ 5 × 108 cellule / mL in tampone PBS / EDTA + 0,5% HSA con microsfere anti-biotina-specifiche (7,5 mL / 1 fiala).</li>
	<li>Mettere lo shaker in frigorifero e incubare le cellule a 2-8 °C per circa 15 minuti con agitazione. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 200-500 × g per 15 minuti a 2-8 °C per rimuovere le microsfere non legate. Sospendere ~ 6 × 107 celle / mL nel tampone PBS / EDTA + 0,5% HSA e trasferirle in un sacchetto di trasferimento.</li>
	<li>Installare il set di tubi nel dispositivo di separazione delle celle magnetiche di grado clinico seguendo le istruzioni del produttore, posizionare le confezioni con il tampone PBS/EDTA e la confezione di trasferimento con il prodotto cellulare nello strumento e puntarlo quando indicato dallo strumento.</li>
	<li>Selezionare il protocollo Depletion 1.2 per l'esaurimento delle cellule T αβ etichettate.</li>
	<li>Centrifugare la frazione bersaglio (cellule T γδ arricchite) e risospescere le cellule in mezzo integrato con il 10% di siero AB umano.</li>
	<li>Prelevare un campione da 0,5 ml ed eseguire un conteggio delle cellule e la vitalità con la colorazione AO/PI. Portare le cellule ad una concentrazione finale di circa 1 × 106 cellule/ml. Prelevare un campione di 5 × 106 cellule del prodotto per la fenotipizzazione della citometria a flusso post-esaurimento.</li>
</ol>3. Co-cultura con aAPC
<ol><li>Irradiare 5 × 107 aAPC/pallone a 100 Gy sullo strumento di generazione di raggi X.</li>
	<li>Utilizzare le aAPC in co-coltura con un rapporto 10:1 con le cellule T γδ. Porre le cellule AAPC irradiate (5 × 107 cellule/pallone) e le cellule T γδ (5 × 106 cellule/pallone) in palloni bioreattori a sistema chiuso da 1 L con 1 L di terreno di coltura integrato con siero AB umano al 10%. Semina fino a 10 boccette.</li>
	<li>Espandere le cellule in coltura per 10 giorni in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Monitorare i livelli di glucosio e lattato ogni 3-4 giorni utilizzando strisce, glucosio e un misuratore di lattato.</li>
	<li>Se il glucosio scende a 250 mg/dL, ridurre il volume nel matraccio a 200 ml utilizzando una pompa farmaceutica saldando a sterili una confezione di trasferimento da 1 L sulla linea rossa del bioreattore a sistema chiuso.</li>
	<li>Mescolare le cellule nei restanti 200 ml e prelevare un campione da 0,5 ml per il conteggio delle cellule e la misurazione della vitalità mediante colorazione AO-PI. Se il numero di cellule è ≥109, dividere un matraccio in due palloni e riempire ciascun matraccio fino a 1 L con AIM-V integrato con siero AB umano al 10%. Se il numero di cellule è <109, nutrire le cellule con un litro fresco di terreno di coltura integrato con il 10% di siero AB umano.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.6 per tutti i palloni e restituirli all'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2. Ripetere i passaggi 3.4-3.7 ogni 3 o 4 giorni.</li>
</ol>4. Raccolta delle cellule
<ol><li>Alla fine di 10 giorni in co-coltura, raccogliere tutte le fiasche del bioreattore. Raccogliere 1 pallone bioreattore alla volta e raggruppare tutte le cellule in un pacchetto di trasferimento di dimensioni appropriate. Saldare sterilemente il pacchetto di trasferimento alla linea rossa del bioreattore a sistema chiuso e utilizzare la pompa farmaceutica per trasferire le cellule nel pacchetto di trasferimento.</li>
	<li>Rimuovere i seguenti campioni di controllo qualità: 1% del prodotto farmaceutico (DP) per la sterilità mediante emocoltura e colorazione del grammo; 0,5 mL per il conteggio e la vitalità delle cellule utilizzando AO/PI; 5-10 × 106 cellule per la citometria a flusso (vedi Figura 1 per la strategia di gating); 0,5 ml per endotossina; 0,5 ml per la colorazione dei grammi; 106 cellule sono entrate in 10 ml di terreno esaurito per il test del micoplasma.</li>
	<li>Centrifugare le celle a 200-500 × g per 15 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Lavare le celle in una soluzione di soluzione cristallina bilanciata + 0,5% HSA a 200-500 × g per 15 minuti a temperatura ambiente. Risospenderli in un volume target di 100-300 ml di soluzione cristallina bilanciata + 0,5% HSA.</li>
</ol>5. Test di rilascio
<ol><li>Eseguire test di controllo qualità della cellula T γδ DP per quanto segue: purezza e identità mediante citometria a flusso (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); vitalità mediante colorazione AO/PI; endotossina; Test del micoplasma mediante reazione a catena della polimerasi (PCR); sterilità mediante colorazione al grammo e emocoltura aerobica e anaerobica; saggio K562 residuo mediante citometria a flusso (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%3A+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li>
<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li>
<li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment%2C+risk+factors%2C+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li>
<li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph%2B+leukemia+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700(2011).</li>
<li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3%CE%B4+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-%CE%B1%CE%B2%2B%2FCD19%2B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li>
<li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+T+cell+receptor%3A+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expansion+of+V%CE%B39V%CE%B42+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li>
<li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+V%CE%B39V%CE%B42+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+V%CE%B39V%CE%B42+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Il Moffit Cell Therapy Lab ha sviluppato un protocollo con un'espansione bifasica di cellule T γδ altamente pure da utilizzare come DP in studi clinici. Questo protocollo fornisce un metodo di produzione secondo le linee guida cGMP in un sistema chiuso che produce un DP a cellule T γδ altamente puro che viene attivato ed espanso con successo dall'acido zoledronico e dagli aAPC WCB. Questo protocollo è stato approvato dalla FDA per la produzione di un DP allogenico a cellule T γδ per i pazienti affetti da LMA. Utilizzando donatori sani, abbiamo ampliato con successo la piccola popolazione di cellule T γδ donatrici in soli 7 giorni dal 2,06± 0,45% al 54,45± 28,34%. Dopo l'espansione di 7 giorni con acido zoledronico, è stato osservato che il donatore 2 ha avuto un aumento della popolazione NK.
L'acido zoledronico inibisce la farnesil difosfato sintasi (FDPS) nei monociti, che a sua volta porta all'accumulo di isopentenil pirofosfato (IPP), che è stato correlato con un significativo aumento della proliferazione delle cellule T e delle cellule NK naturali7,8,9. Questo aumento della popolazione NK ostacola la 2a fase di espansione con gli aAPC, poiché gli aAPC contribuiranno solo all'ulteriore espansione delle cellule NK. Per questo motivo, i criteri dei donatori sono stati modificati per escludere i donatori con un'alta popolazione di NK. Dopo l'esaurimento delle cellule T αβ, le cellule T γδ sono state ulteriormente arricchite al 76,61 ± al 27,51%. Questo protocollo unico include una seconda espansione che utilizza gli AAPC prodotti da Moffit per colpire i recettori CD8, CD28 e CD127L nelle cellule T γδ. Questa seconda fase di espansione con le aAPC ha prodotto un DP con ≥65% per le cellule CD3+TCR γδ+, ≤1% TCRαβ T e <35% cd3-CD16+CD56+ NK. A causa dell'uso di AAPC derivati da K562, è stato necessario dimostrare che tali AAPC costituivano <1% del prodotto finale.
Il CTF Moffit ha sviluppato un test citometrico a flusso utilizzato per i criteri di rilascio per misurare la percentuale delle cellule K562 residue nel DP finale. Questo test citometrico a flusso mitiga tutti i problemi dell'utilizzo di antigeni di superficie cellulare per identificare le cellule K562. Poiché le cellule T attivate possono esprimere CD71, abbiamo ideato una strategia per escludere tutte le cellule T e le cellule NK gating su popolazioni CD3- CD56 e CD16- e quindi esaminando le cellule CD71 +, che sarebbero esclusivamente cellule K562. Questo protocollo dimostra che la DP delle cellule T γδ produce 0,48 ± lo 0,42% delle cellule K562 residue e soddisfa tutti i criteri di rilascio di vitalità ≥70%, negatività del micoplasma mediante PCR, nessun organismo visto dalla colorazione del grammo, ≤2 EU/ mL di endotossina e nessuna sterilità di coltura del sangue finale di crescita (14 giorni).

La recidiva di leucemia è la principale causa di mortalità dopo trapianto di cellule ematopoietiche (HCT) in pazienti con LMA1,2,3. Una migliore sopravvivenza libera da leucemia è stata riportata con l'aumento del recupero delle cellule T γδ nel sangue dopo HCT senza aumento del rischio di graft-versus-host disease (GVHD)4. La capacità delle cellule T γδ di riconoscere gli antigeni in modo indipendente dall'MHC e di sviluppare forti funzioni effettrici citolitiche e simili a Th1 rendono questa sottopopolazione minore di cellule T ideale per il trattamento dei pazienti affetti da LMA sottoposti a trapianto allogenico a rischio di recidiva5. Dato che le cellule T Vγ9Vδ2 sono un sottoinsieme minore di linfociti T che vanno dallo 0,5% al 5% delle cellule T nella periferia6, abbiamo deciso di stabilire un sistema robusto per espandere questa rara popolazione di cellule del sangue per ottenere dosi potenzialmente terapeutiche per studi clinici.
Sebbene altri abbiano espanso con successo le cellule T γδ usando acido zoledronico e persino aAPC, abbiamo sviluppato un processo che può potenzialmente espandere le cellule T γδ di 229.749 volte. L'espansione è bifasica: in primo luogo, i linfociti sono ottenuti per elutrazione utilizzando lo strumento di separazione. L'apparecchiatura fornisce un sistema chiuso che consente la separazione delle celle in base alle loro dimensioni, forma e densità mediante centrifugazione controcorrente. Dopo l'arricchimento per i linfociti, l'espansione selettiva delle cellule T Vγ9Vδ2 si ottiene mediante trattamento con acido zoledronico e IL-2 per 7 giorni. Immediatamente dopo questo trattamento, le cellule T TCR-αβ vengono esaurite utilizzando la tecnologia delle microsfere, consentendo la successiva espansione delle cellule T γδ con aAPC derivate da K562.
Per la validazione del processo, solo 5 × 106 cellule T γδ espanse con acido zoledronico sono state utilizzate solo 5 × 106 cellule T γδ espanse con aAPC. In questa seconda fase di espansione, le cellule T γδ vengono attivate utilizzando una banca di cellule di lavoro (WCB) conforme alle good manufacturing practices (cGMP) di aAPC derivate da K562 geneticamente modificate (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) prodotte a Moffitt. Il razionale di questa espansione bifasica si basa sulla capacità dell'acido zoledronico di inibire la farnesil difosfato sintasi (FDPS) nei monociti, portando all'accumulo di isopentenil pirofosfato, che stimola direttamente le cellule Vγ2Vδ2. Nella seconda fase di espansione, le aAPC derivate da K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) forniscono una robusta stimolazione a tutte le cellule T. Tuttavia, il prodotto cellulare è già stato arricchito per le cellule T γδ, con conseguente robusta espansione delle cellule T γδ.
Con l'uso di attrezzature e palloni specifici, il processo è un sistema funzionalmente chiuso, diminuendo così il rischio di contaminazione. Inoltre, il bioreattore a sistema chiuso da 1 L facilita la massima crescita ed espansione delle cellule in un volume totale di 1 L di mezzo con un minimo bisogno di alimentazione. Il vantaggio del metodo Moffitt è che fornisce un sistema GMP rapido, riproducibile e altamente fattibile per produrre un prodotto a base di cellule T γδ altamente puro, derivato da donatori, per la somministrazione allogenica. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi studio clinico che mira a utilizzare cellule T γδ umane che esprimono recettori delle cellule T Vγ2Vδ2 come immunoterapia adottiva per mediare l'immunità contro microbi e tumori in pazienti oncologici con remissione parziale e completa. Inoltre, fornisce una solida piattaforma per lo sviluppo e la produzione di cellule T positive al recettore dell'antigene γδ chimerico (CAR+).

<table><tbody><tr><td>Hanks Soluzione salina bilanciata</td><td>R& D</td><td>285-GMP</td><td></td></tr><tr><td>Albumina umana 25%</td><td>Grifolis</td><td>65483-16-071</td><td></td></tr><tr><td>Plasmalyte A</td><td>Fisher</td><td>2B2543Q</td><td></td></tr><tr><td>Acido zoledronico (Zometa)</td><td>Hos pira</td><td>4215-04--8</td><td>FDA farmaco approvato</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>CS10</td><td>BIOLIFE SOLUTIONS</td><td>210374</td><td></td></tr><tr><td>3 mL siringa</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 20 mL</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 50 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 100 mL</td><td>JMS</td><td>992861</td><td></td></tr><tr><td>18g Ago</td><td>Fisher</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials 1,8 mL</td><td>Fisher</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>pipetta da 5 mL</td><td>Fisher</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>pipetta da 50 mL</td><td>Fisher</td><td>1367610Q</td><td></td></tr><tr><td>pipetta da 10 mL</td><td>Fisher</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>pipetta da 100 mL Fisher</td><td></td><td>07-200-620</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conica</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conica</td><td>Fisher</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>250 mL conica</td><td>Fisher</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Confezione di trasferimento da 600 mL</td><td>TERUMO BCT INC</td><td>1BBT060CB71</td><td></td></tr><tr><td>Set di trasferimento al plasma da 4"</td><td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td><td>03-220-90</td><td></td></tr><tr><td>Set di tubi Elutra</td><td>TerumoBCT</td><td>70800</td><td></td></tr><tr><td>100 MCS GREX</td><td>WILSON WOLF MFG CORP</td><td>81100-CS</td><td></td></tr><tr><td>Ashton Sistema di</td> <td>erogazione di liquidi sterili PumpmaticFisher Scientific</td><td>22-246660</td><td></td></tr><tr><td>Acacia Pump boot</td><td>MPS Medical In</td><td>17789HP3MLL</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS PBS / EDTA Buffer</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-070-525</td><td></td></tr><tr><td>Dornase Alpha</td><td>Genentech, Inc</td><td>50242-100-40/186-0055</td><td>FDA approvato farmaco</td></tr><tr><td>1000 ml 0,22 um Filtro</td><td>Fisher</td><td>157-0020</td><td></td></tr><tr><td>Filtro sangue 170um</td><td>B. Braun</td><td>V2500</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACs Set di tubi</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-090-719</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS TCR&alpha;/&beta; Kit</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-021-301</td><td></td></tr><tr><td>Set di sangue di tipo Y</td><td>Fenwal</td><td>FWL4C2498H</td><td></td></tr><tr><td>75 mL Flask</td><td>Fisher</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Prometheus</td><td>65483-116-071</td><td>Farmaco approvato dalla FDA</td></tr><tr><td>AIM-V Fisher</td><td></td><td>0870112BK</td><td></td></tr><tr><td>Siero Human AB</td><td>Gemini Bio-Product</td><td>100H41T</td><td></td></tr><tr><td>Confezione di trasferimento da 3 litri</td><td>Independent Medical Associates</td><td>T3109</td><td></td></tr><tr><td>1000&nbsp; puntali per pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>5991040</td><td></td></tr><tr><td>CF-250</td><td>KOLBio</td><td>CF-250</td><td></td></tr><tr><td>Elutra</td><td>TERUMOBCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GatheRex Liquid Handling, pompa per la raccolta delle cellule</td><td>WILSON WOLF MFG CORP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HERAcell Vios Incubatore a CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

espansione e arricchimento di cellule t gamma-delta (γδ) da prodotto umano afereso

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Sebbene le cellule T Vγ9Vδ2 siano un sottoinsieme minore di linfociti T, questa popolazione è ricercata per la sua capacità di riconoscere gli antigeni in modo indipendente dal complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) e sviluppare una forte funzione effettore citolitica che la rende un candidato ideale per l'immunoterapia del cancro. A causa della bassa frequenza delle cellule T Gamma-Delta (γδ) nel sangue periferico, abbiamo sviluppato un protocollo efficace per espandere notevolmente un prodotto farmacologico altamente puro per le cellule T γδ per l'uso primo nell'uomo di cellule T γδ allogeniche in pazienti con leucemia mieloide acuta (LMA). Utilizzando l'aferesi di un donatore sano come fonte di cellule allogeniche, i linfociti vengono isolati utilizzando un dispositivo convalidato per un metodo di centrifugazione controcorrente per separare le cellule per dimensione e densità. 
Viene utilizzata la frazione ricca di linfociti e le cellule T γδ vengono attivate preferenzialmente con acido zoledronico (approvato dalla FDA) e interleuchina (IL)-2 per 7 giorni. A seguito dell'espansione preferenziale delle cellule T γδ, un dispositivo di separazione cellulare magnetico di grado clinico e perline TCRαβ vengono utilizzati per esaurire le cellule T contaminanti del recettore delle cellule T (TCR)αβ. Le cellule T γδ altamente arricchite subiscono quindi una seconda espansione utilizzando cellule artificiali ingegnerizzate che presentano l'antigene (aAPC) derivate da cellule K562 geneticamente modificate per esprimere frammenti variabili a catena singola (scFv) per CD3 e CD28, 41BBL (CD137L) e IL15-RA insieme all'acido zoledronico e IL-2. La semina di cellule T γδ arricchite per tutto il giorno 7 in co-coltura con le aAPC facilita la produzione di cellule T γδ altamente pure con un'espansione media di >229.000 volte dal sangue di un donatore sano.

Il processo delle cellule T γδ è stato caratterizzato e ottimizzato per la produzione del prodotto farmaceutico a cellule T γδ. L'ottimizzazione del processo ha incluso 1) arricchimento dei linfociti mediante elutriazione, 2) espansione specifica delle cellule T (DS) della sostanza farmaceutica delle cellule T γδ con acido zoledronico, 3) deplezione delle cellule T γδ DS di TCRαβ, 4) espansione secondaria della cellula T γδ DS utilizzando aAPC derivate da K562 e 5) raccolta DP finale e formulazione del prodotto per somministrazione o crioconservazione. Dopo l'ottimizzazione del processo, le prove di conferma sono state eseguite su larga scala utilizzando il materiale derivato da tre donatori sani per confermare l'idoneità all'elaborazione cellulare. Tutti i dati sono stati analizzati e sono riassunti nella Tabella 1, tabella 2 e tabella 3. Le cellule separate dalla frazione di centrifugazione post-controflusso 2 (F2) hanno prodotto una popolazione di linfociti puri con una media del 99,23% di cellule CD45+ (riportata come frequenza del gate vivo totale) e un'eccellente vitalità media del 95,80% (Tabella 1).
L'espansione specifica delle cellule T γδ con acido zoledronico dipendeva dalla percentuale iniziale di cellule natural killer (NK) presenti nella frazione linfocitaria (F2) dopo l'elutrazione. L'arricchimento della cellula T γδ DS con la deplezione di TCRαβ è stato coerente (Tabella 2). Le cellule T γδ DP prodotte da tre donatori sani avevano una media dello 0,11% ± 0,05% di cellule CD20+ B e dello 0,00% ± 0,00% di cellule TCR αβ+, soddisfacendo così il criterio di rilascio di ≤1% delle cellule T TCR αβ+. La percentuale media di celle NK nel prodotto finale è del 17,06% ± del 26,19% e soddisfa il criterio di rilascio del &lt;35%. Inoltre, la percentuale media di cellule T e cellule NK negative al lignaggio nel prodotto finale è stata dello 0,48% ± dello 0,42% (Tabella 3). La colorazione della superficie cellulare e l'analisi citometrica a flusso sono state utilizzate per caratterizzare l'identità, la purezza e le impurità di processo del DS e del DP, come mostrato nella Figura 2A-D.
L'espansione secondaria, ottenuta dalla co-coltura delle cellule T AAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB e γδ T cell DS con un rapporto di 10:1, ha generato un DP della cellula T γδ che soddisfaceva tutti i criteri di rilascio, come mostrato nella Tabella 4. Inoltre, le cellule sono state colorate e valutate mediante citometria a flusso alle cellule F2 di centrifugazione controcorrente del giorno 0, cellule T espanse dell'acido zoledronico del giorno 7, deplezione delle cellule T del giorno 7-TCR αβ, DP del giorno 17-finale per i seguenti biomarcatori cluster di differenziazione (CD)3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, recettore delle chemochine CC 7 (CCR7), proteina di morte cellulare programmata-1 (PD-1), la proteina 4 associata ai linfociti T citotossici (CTLA4), il gene 3 attivante i linfociti (LAG3) e l'immunoglobulina delle cellule T e la proteina 3 contenente il dominio della mucina (TIM3). I dati mostrati nella Figura 3 sono mediati da tre cicli indipendenti e dimostrano che le cellule non hanno raggiunto l'esaurimento. Il CTF Moffitt ha anche sviluppato un test K562 residuo per determinare le impurità DP correlate alle aAPC derivate da K562 (Figura 4).
La strategia di gating citometrico a flusso utilizzata per caratterizzare le percentuali dei tipi cellulari è stata la seguente: 1) gating su popolazione negativa al lignaggio delle cellule T e NK (CD3-CD56-CD16-); 2) gate su CD71+ (recettore della transferrina espresso in lignaggio eritroide e LMA che consente il rilevamento di cellule K562 residue). Questa strategia di gating ha permesso la valutazione delle cellule CD3-CD16-CD56-CD71+, che sono l'aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (definito "K562 residuo" nella Figura 4).<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig04large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2" rowspan="2"></td><td colspan="3"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="8"></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2" 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fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td colspan="3"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="7"></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Presentato è un protocollo per l'espansione del prodotto farmaceutico a cellule T Gamma-Delta (γδ). I linfociti sono isolati per elutriazione e arricchiti con acido zoledronico e interleuchina-2. Le cellule T alfa-beta vengono esaurite utilizzando un dispositivo di separazione magnetica di grado clinico. Le cellule γδ sono co-coltivate con cellule derivate da K562, che presentano antigeni artificiali ed espanse.

Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Le cellule T Gamma-Delta hanno una potente attività citotossica contro molti tipi di cancro, tra cui la leucemia mieloide acuta. Tuttavia, le cellule T Gamma-Delta circolanti nel sangue sono relativamente rare, in particolare nei pazienti con tumori maligni. L'infusione di cellule T Gamma-Delta espanse X-vivo derivate da donatori, è promettente nel ridurre la recidiva della leucemia e migliorare la sopravvivenza dei pazienti con leucemia mieloide acuta.Il metodo proposto raggiunge un'espansione delle cellule T Gamma-Delta superiore a 200.000 volte, raggiungendo dosi terapeuticamente rilevanti di un prodotto a base di cellule T Gamma-Delta altamente puro, in tre semplici passaggi. Quindi legare un IEL all'espansione, l'esaurimento delle cellule T alfa beta mediante selezione magnetica e l'espansione secondaria bounty con AAPC. Il metodo proposto espande l'utilità delle cellule T Gamma-Delta per malattie come il cancro e le malattie autoimmuni creando rapidamente un gran numero di cellule che possono essere utilizzate dallo scaffale.Questo processo potrebbe essere adattato per espandere le cellule Gamma-Delta utilizzando diversi metodi di arricchimento e aggiungendo ulteriori manipolazioni come la trasduzione. La dimostrazione della procedura sarà tradita a LA, un tecnologo di terapia cellulare, tre del mio laboratorio. Iniziare con l'elutrazione del campione di prodotto a effervescenza, sul dispositivo di centrifugazione controcorrente, utilizzando un mezzo primario di soluzione salina bilanciata Hanks, con l'1% di albumina sierica umana e il mezzo secondario di soluzione salina o DPBS.Con la velocità di centrifugazione di elutrazione a 900 volte G, raccogliere frazioni in base alla portata e al tempo. Raccogliere i campioni dalla frazione due per eseguire il test di sterilità, la conta cellulare e la fenotipizzazione cellulare mediante citometria a flusso. Dalla frazione due, espandere una frazione linfocitaria pura di cellule in coltura a 10 volte 10 alle sesti cellule per centimetro quadrato, con cinque micromoli per litro di acido zoledronico e 300 unità per millilitro di interleuchina-2 in un bioreattore a sistema chiuso da un litro.Incubare il sistema per sette giorni a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule dal pallone del bioreattore a sistema chiuso da un litro. Per fare ciò, saldare sterilemente un pacco di trasferimento da un litro alla linea rossa del bioreattore e utilizzare la pompa farmaceutica appropriata per trasferire le cellule nella confezione di trasferimento.Prelevare i campioni per il test della sterilità media esaurita, della conta cellulare e della fenotipizzazione cellulare mediante citometria a flusso. Dal campione rimanente, sospendere nuovamente le cellule a cinque volte 10 all'ottava cellula per millilitro, in tampone PBS-EDTA contenente lo 0,5% di HSA e recettore delle cellule T biotinilato, anticorpo alfa beta specifico. E incubare le cellule a due-otto gradi Celsius con agitazione.Dopo 15 minuti, lavare le cellule con 600 millilitri di tampone PBS-EDTA contenente 0,5 HSA e centrifugare a 200-500 volte G per 15 minuti, da due a otto gradi Celsius, per rimuovere l'anticorpo non legato. Quindi, sospendere nuovamente le cellule a circa cinque volte 10-ottava cella per millilitro, in tampone PBS-EDTA contenente 0,5% HSA e 7,5 millilitri per fiala di microsfere specifiche anti-biotina. Come descritto in precedenza, incubare le cellule con agitazione, prima di centrifugare la sospensione cellulare per rimuovere le microsfere non legate.Sospendere nuovamente sei volte 10 alla settima cella per millilitro nel tampone PBS-EDTA con 0,5% HSA. Raccoglieteli in un sacchetto di trasferimento. Spike quando istruito dallo strumento.Quindi, installare un set di tubi nel dispositivo di separazione delle celle magnetiche di grado clinico. Introdurre nello strumento le confezioni con il tampone PBS-EDTA e la confezione di trasferimento con il prodotto cellulare. Per l'esaurimento delle cellule T alfa beta marcate, selezionare il protocollo di esaurimento 1.2 nel software.Quindi, centrifugare il prodotto cellulare per raccogliere la frazione target arricchita con cellule T Gamma-Delta. Sospendere nuovamente le cellule raccolte nel mezzo, integrate con siero AB umano al 10%. Eseguire una vitalità del conteggio cellulare e fenotipizzazione della citometria a flusso dopo l'esaurimento.Portare le cellule a una concentrazione finale di circa una volta 10 alla sesta cella per millilitro. Irradiare cinque volte 10 alla settima cellula che presenta l'antigene artificiale o AAPC per pallone, a 100 grigi sullo strumento di generazione dei raggi X. Preparare una co-coltura, posizionando le AAPC irradiate e le cellule T Gamma-Delta al rapporto di 10 è a uno, in palloni bioreattori a sistema chiuso da un litro.Con un litro di terreno di coltura, integrato con siero AB umano al 10%, semina fino a 10 palloni. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 10 giorni, con uno screening dei livelli di glucosio e lattato ogni tre o quattro giorni utilizzando strisce, glucosio e un misuratore di lattato. Se il livello di glucosio scende a 215 milligrammi per decilitro, ridurre il volume nel matraccio a 200 millilitri.Mescolare le cellule nei restanti 200 millilitri di media e rimuovere un campione di 0,5 millilitri per il conteggio delle cellule e la misurazione della vitalità mediante colorazione di arancia acridina o ioduro di propidio. Se la conta cellulare è uguale o superiore a 10 a nona, dividere il contenuto di un matraccio in due e riempire ciascun matraccio fino a un litro con un mezzo AIM-V, integrato con siero AB umano al 10%. Se il numero di cellule è inferiore a 10 al nono, nutrire le cellule con un terreno di coltura fresco di un litro, integrato con siero AB umano al 10% e restituire i palloni all'incubatrice.Alla fine di 10 giorni in co-coltura, raccogliere i palloni del bioreattore uno alla volta e tirare tutte le cellule in un pacchetto di trasferimento di dimensioni appropriate. Dopo aver rimosso i campioni di controllo qualità, centrifugare le celle a 200-500 volte G per 15 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Lavare le cellule in una soluzione di soluzione cristallina bilanciata, integrata con 0,5% HSA a 200-500 volte G per 15 minuti a temperatura ambiente.Risespensali in un volume target da 100 a 300 millilitri di soluzione cristallina bilanciata con 0,5% HSA. Le celle separate dalla frazione di centrifugazione post controcorrente. Due hanno prodotto una popolazione di linfociti puri, con un'eccellente vitalità media del 95,80% L'espansione specifica delle cellule T Gamma-Delta, con acido zoledronico dipendeva dalla percentuale iniziale di cellule natural killer presenti nella frazione linfocitaria dopo elutrazione.L'arricchimento della sostanza farmaceutica gamma-delta delle cellule T, con l'esaurimento del recettore alfa beta delle cellule T, è stato coerente. Il prodotto farmaceutico a cellule T Gamma-Delta prodotto da tre donatori sani, ha soddisfatto il criterio di rilascio di meno dell'1% delle cellule T beta beta positive del recettore delle cellule T, con una media dello 0,11% di cellule B CD20 positive e dello 0,00% di cellule T beta beta positive del recettore delle cellule T. La percentuale media di cellule natural killer nel prodotto finale era di circa il 17,06% che soddisfaceva il criterio di rilascio di meno del 35% La colorazione della superficie cellulare e l'analisi citometrica a flusso, sono state utilizzate per caratterizzare l'identità, la purezza e le impurità di processo della sostanza farmacologica e del prodotto farmaceutico.La seconda riespansione ottenuta dalla co-coltura della sostanza farmaceutica AAPC e Gamma-Delta T-cell, ha generato un prodotto farmaceutico Gamma-Delta T-cell che ha soddisfatto tutti i criteri di rilascio. I pathon che arricchiscono la popolazione di cellule T influenzano l'espansione e le caratteristiche del prodotto. È necessaria una considerazione e un'indagine sufficienti sui metodi di arricchimento, prima di iniziare il loro processo di arricchimento.

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Espansione ex vivo di tumore cellule T reattive per mezzo di 1/Ionomycin Bryostatin e il Comune catena gamma Citochine Formulazione

Un rapido, protocollo semplice e conveniente per la generazione di donatore-derivati ​​multivirus specifici CTL (RCtl) per infusione a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT) a rischio di sviluppare infezioni da CMV, EBV o Adv. Questo processo di fabbricazione è GMP e deve assicurare l'applicazione più ampia di cellule T immunoterapia al di là di centri specializzati.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Un nuovo metodo DC indipendente per l'induzione e l'espansione di antigene-specifica delle cellule T è descritta. HLA-A2 Ig Cellule artificiali basati Antigen Presenting (aAPC) vengono caricati con HLA-A2 peptidi limitato ad ampliare in modo efficace CTL di specificità antigenica diversi. Questa tecnologia ha un grande potenziale per CTL-immunoterapia adottiva.

HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

Un metodo per espandere γδ cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è descritta. PBMC cellule derivate γδ T vengono stimolati e ampliati con zoledronato e interleuchina-2 (IL-2). L'espansione su larga scala di γδ cellule T possono essere applicate a autologo immunoterapia cellulare del cancro.

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Qui si descrive la prima pratica di fabbricazione (GMP) conforme metodo per produrre virus-specifici linfociti T citotossici (CTL) da sangue del cordone ombelicale, fonte di cellule T prevalentemente ingenuo.

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