Ricostruire il retinoblastoma umano in vitro
11 ottobre 2022
Descriviamo un metodo per generare retinoblastoma umano (RB) introducendo mutazioni bialleliche RB1 nelle cellule staminali embrionali umane (hESC). Le linee cellulari RB potrebbero anche essere coltivate con successo usando l'RB isolato in un piatto.
Il retinoblastoma umano è il tipo più comune di cancro intraoculare nell'infanzia. I campioni clinici sono difficili da ottenere e i modelli di topi non possono formare il retinoblastoma. Pertanto, la generazione di retinoblastoma in vitro è essenziale per osservare la genesi, la proliferazione e la crescita del retinoblastoma e per lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici.
L'efficienza di questo protocollo può raggiungere circa il 100% anche se la durata per la generazione del retinoblastoma è variabile dal giorno 45 al giorno 120. Per il mantenimento del retinoblastoma uno o RB uno knockout cellule staminali embrionali umane, coltura il gene modificato H nove cellule in una piastra a sei pozzetti rivestita con fattore di crescita ridotto matrice di membrana basale e cambiare il terreno ogni giorno. Per far passare le cellule, incubarle in tampone EDTA per 3,5 minuti a 37 gradi Celsius o cinque minuti a temperatura ambiente.
Coltivare le cellule fino a raggiungere l'80%confluenza. Quindi, per iniziare la differenziazione delle cellule retiniche, rimuovere il mezzo e sciacquare le cellule con un millilitro di DPBS. Quindi, elevare le colonie cellulari aggiungendo un millilitro di tampone Dispase e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Osserva le colonie cellulari al microscopio. Una volta che i bordi delle colonie iniziano a stendersi, aspirare il tampone Dispase e sciacquare delicatamente le cellule una volta con un millilitro di DPBS. Quindi aggiungere un millilitro di uno medio nel pozzetto e utilizzando una punta di pipetta standard da 10 microlitri, tagliare le colonie a pezzi.
Utilizzare un raschietto cellulare per raschiare le cellule rimanenti nel mezzo. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione in un tubo da 15 millilitri. Dopo la centrifugazione, lasciare circa 50 microlitri di surnatante per disperdere le cellule nel mezzo.
Quindi aggiungere 250 microlitri di matrice di membrana basale ridotta con fattore di crescita e mescolare agitando delicatamente. Dopo la miscelazione, posizionare il tubo da 15 millilitri con le celle sospese in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo un'incubazione di 20 minuti, le cellule e la matrice di membrana basale ridotta dal fattore di crescita dovrebbero formare un gel solidificato.
Quindi, aggiungere un millilitro di medio al tubo da 15 millilitri. Utilizzando una pipetta da un millilitro, pipettare il gel solidificato due o tre volte per disperdere il grumo. Quindi aggiungere altri nove millilitri di uno medio e trasferire la sospensione cellulare in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri.
Incubare il piatto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Questo è considerato il giorno zero. Il primo giorno, esamina le cellule usando un microscopio.
In media, si osservano da tre a quattro cisti in un pezzo di gel. Il quinto giorno, cambia il mezzo raccogliendo il surnatante in un tubo da 15 millilitri, permettendo alle cisti di depositarsi sul fondo e sostituendo il surnatante con uno medio fresco. Disperdere le cisti nel tubo in due piatti da 10 centimetri, assicurando almeno 300 cisti in ogni piatto.
Il settimo giorno, la maggior parte delle cisti attaccate al piatto si diffondono e formano colonie aderenti. Il giorno 10, cambia il mezzo con uno medio fresco, assicurandoti che tutte le cisti rimangano attaccate al piatto. Osservare le cellule al microscopio dai giorni 13 ai 17 per assicurarsi che le cellule si stiano diffondendo.
Il giorno 15, dopo aver risciacquato le cellule una volta con un millilitro di DPBS, aggiungere un millilitro di soluzione di Dispase e incubare a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, rimuovere il tampone Dispase e risciacquare delicatamente le colture con un millilitro di DPBS. Quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo due a ciascun piatto da 10 centimetri e incubare in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Dopo 24 ore, le colture aderenti si staccano spontaneamente e si assemblano in organoidi retinici. Tre giorni dopo il distacco, raccogliere le cellule dal piatto di coltura cellulare in un tubo da 15 millilitri. Quando gli organoidi si depositano, rimuovere il surnatante dal tubo e trasferire gli organoidi in una nuova capsula di Petri non aderente con 10 millilitri di mezzo due per i successivi quattro giorni.
Una settimana dopo il distacco, cambiare il mezzo in medio tre e da questo giorno in poi, coltivare gli organoidi in mezzo tre. Il giorno 27 della coltura di organoidi retinici, l'architettura della vescicola ottica è evidente e circa il 90% degli organoidi mostra questa struttura. La prima rilevazione del retinoblastoma avviene il giorno 45 e diventa palpabile il giorno 50.
Quando cresce fino al giorno 90, le strutture delle vescicole ottiche sono principalmente avvolte dal retinoblastoma. Il retinoblastoma può ora essere isolato e coltivato ulteriormente come linea cellulare. Il giorno 105, oltre l'80% degli organoidi retinici sono completamente avvolti dal retinoblastoma.
Questi organoidi esprimono altamente il marcatore di proliferazione Ki67 e il marcatore oncogene SYK rispetto agli organoidi retinici derivati da H nove, indicando la tumorigenesi. Inoltre, l'elevata espressione del marcatore precursore del cono ARR3 e del marcatore precursore dei fotorecettori CRX negli organoidi del retinoblastoma dimostra che provengono da cellule precursori dei coni. I risultati inferiori e superiori durante le tre fasi morfologiche della generazione del retinoblastoma sono rappresentati qui.
Le cellule staminali embrionali umane differenziate e indifferenziate possono essere facilmente distinte in base alla loro morfologia. Le cellule indifferenziate sono scelte per la formazione del retinoblastoma. Il quinto giorno, la sfera generata dovrebbe essere vuota piuttosto che solida.
Il retinoblastoma deriva dagli organoidi retinici che mostrano l'architettura delle vescicole ottiche. Nessun retinoblastoma viene generato dagli organoidi inferiori. Durante l'esecuzione della procedura, tutte le punte devono essere raffreddate e la matrice della membrana basale deve essere fusa a quattro gradi prima di aggiungerla nel tubo.
Questo è un passo fondamentale per questo protocollo di differenziazione.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per generare retinoblastoma umano (RB) introducendo mutazioni bialleliche nel gene RB1 in cellule staminali embrionali umane (hESC). Il protocollo consente la coltura con successo di linee cellulari di RB in vitro, fornendo un modello prezioso per la ricerca.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Oncologia
Sfondo
- Il retinoblastoma umano è il tumore intraoculare più comune nell'infanzia.
- I campioni clinici sono difficili da ottenere e i modelli murini esistenti non replicano in modo efficace la malattia.
- La generazione in vitro del retinoblastoma è fondamentale per lo studio del suo sviluppo e per la sperimentazione di nuove terapie.
- L'efficienza del protocollo proposto può raggiungere circa il 100%.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per generare in vitro retinoblastoma umano.
- Facilitare lo studio della genesi, della proliferazione e della crescita del retinoblastoma.
- Contribuire allo sviluppo di nuovi agenti terapeutici per il retinoblastoma.
Metodi Utilizzati
- Introduzione di mutazioni bialleliche in RB1 nelle cellule staminali embrionali umane.
- Coltura delle cellule H9 modificate geneticamente in una matrice di membrana basale con fattori di crescita ridotti.
- Cambi giornalieri del mezzo per la manutenzione delle cellule.
- Passaggio delle cellule mediante tampone EDTA a temperature specificate.
Risultati principali
- Generazione con successo di linee cellulari umane di retinoblastoma.
- Durata variabile per la generazione del retinoblastoma, compresa tra 45 e 120 giorni.
- Alta efficienza nella coltura in vitro di cellule di RB.
- Potenziale per ulteriori ricerche sulle terapie del retinoblastoma.
Conclusioni
- Il metodo fornisce uno strumento prezioso per lo studio del retinoblastoma.
- I modelli in vitro possono migliorare la comprensione della malattia.
- Questo approccio potrebbe portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la ricostruzione in vitro del retinoblastoma umano a partire da linee di hESC modificate geneticamente, fornendo un modello scalabile e riproducibile per lo studio della genesi tumorale e della risposta terapeutica. Riproducendo l'origine dai precursori dei coni del retinoblastoma, il modello supporta la validazione degli bersagli e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci oncologici. Esso colma una lacuna fondamentale nella modellizzazione preclinica, dovuta alla mancanza di modelli rodentici affidabili e all'accesso limitato ai campioni clinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei meccanismi di perdita di funzione di RB1 in un contesto cellulare umano.
- Valore operativo: Fornisce una fonte rinnovabile di cellule di retinoblastoma per studi sull'interazione con i bersagli.
- Valore predittivo: Permette la valutazione di candidati terapeutici diretti contro la tumorigenesi derivata dai precursori dei coni.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera organoidi con marcatori quantificabili di tumorigenesi come Ki67 e SYK.
- Valore operativo: Produce colture arricchite in retinoblastoma entro il giorno 105, idonee per lo screening costante di composti.
- Prontezza del saggio: Consente il monitoraggio longitudinale della crescita tumorale, dall'architettura della vescicola ottica fino all'avvolgimento completo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra l'origine specifica della malattia umana attraverso l'espressione di ARR3 e CRX in organoidi di retinoblastoma.
- Valore operativo: Consente l'isolamento di linee cellulari di retinoblastoma per analisi farmacodinamiche e di tossicità successive.
- Continuità traslazionale: Collega la differenziazione di hESC all'output tumorogenico in una finestra temporale definita (giorno 45–120).
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, consentendo la verifica di ipotesi sui bersagli attraverso linee di cellule staminali embrionali umane isogeniche con mutazione o knockout di RB1, prima dell'identificazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Consente l'analisi meccanicistica della perdita della via RB1 nello sviluppo retinico umano.
- Screening: Produce linee cellulari di retinoblastoma adatte a saggi di vitalità e proliferazione ad alto contenuto informativo.
- Analisi: Fornisce parametri misurabili inclusi la formazione di organoidi, l'avvolgimento tumorale e l'espressione di marcatori.
- Ricerca traslazionale: Collega le firme dei precursori dei coni all'output tumorale per la selezione di bersagli allineati ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma per modellare altri tumori pediatrici con origini cellulari definite.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduzione del rischio meccanicistica delle terapie mirate a RB1 mediante modellizzazione della tumorigenesi rilevante per l'uomo.
- Valore operativo: Protocollo standardizzato di differenziamento con transizioni definite dei mezzi e cronoprogramma.
- Valore strategico: Consente decisioni di avanzamento o interruzione basate sulla penetranza tumorale e sull'espressione dei marcatori in un formato scalabile.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati terapeutici per il retinoblastoma in base alla gestione del rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella coltura di hESC, nell'editing genico e nella differenziazione di organoidi 3D.
- Dipende dalla matrice della membrana basale con ridotto contenuto di fattori di crescita e da formulazioni precise dei mezzi di coltura.
- Necessita di un passaggio standardizzato mediante tampone EDTA a temperature controllate.
- Richiede il monitoraggio dell'adattamento per garantire la fedeltà del marcatore dei precursori dei coni attraverso diverse linee di hESC.
- È limitato dalla durata variabile della formazione del retinoblastoma (giorno 45–120), richiedendo un monitoraggio longitudinale.
